Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

Dlatego nasze badania koncentrują się na zrozumieniu peroksysomów, które są niezbędnymi organellami dla metabolizmu lipidów i równowagi oksydacyjnej komórkowej. Naszym celem jest odkrycie, jak reguluje się ich strukturę i funkcję oraz jak te procesy zmieniają się w chorobach. Aby to osiągnąć, opracowujemy sondy fluorescencyjne, które pozwalają nam i szerszej społeczności naukowej wizualizować peroksysomy w różnych komórkach zwierzęcych.

Opracowujemy tutaj protokoły barwienia działające zarówno w żywych, jak i stałych komórkach, dostarczając potężnych narzędzi do badania biologii paroksetyny w zdrowiu i patologii. Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest osiągnięcie nieinwazyjnego znakowania peroksysomów w komórkach zwierzęcych. Chociaż barwienie przeciwciał pomaga to przezwyciężyć, brakuje komercyjnie dostępnych przeciwciał przeciwciał do białek paroksyzmowych.

Kolejnym wyzwaniem jest nieinwazyjne wizualizowanie peroksjosomów w czasie rzeczywistym, co wymaga elastycznych protokołów. I wreszcie, tradycyjne barwienie nie daje funkcjonalnego odczytu. Natomiast barwienie oparte na peroksydazie może się różnić w zależności od funkcji paroksysmalnej, co jest zarówno wyzwaniem, jak i szansą, ponieważ pozwala rozróżnić stany funkcjonalne paroksysmalne wewnątrz komórki.

Zacznij od komórek ssaków zasianych dzień wcześniej na talerzu z pokrywkami, które obecnie mają łączność 30 do 70%. Rozcieńcz sondę peroksysomem świeżym medium w światłoczułej, mikrowirowanej probówce, aby uzyskać końcowe stężenie czteromikromolowe. Wybierz pożądany dołek do bejcowania i oznacz zewnętrzną stronę markerem.

Aspiruj 0,5 mililitra podłoża z wybranego odwiertu i zastąp je przygotowanym materiałem sondowym kropla po kropli wzdłuż ściany odwiertu. Po wydaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Od tego momentu zabezpieczaj ogniwa przed światłem za pomocą folii aluminiowej.

Po inkubacji ostrożnie usuń zabarwione medium i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Następnie umieść płytkę pod chemicznym kapturem, dodaj 4% paradehydu w PBS do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po utrwaleniu usuń paraformaldehyd do wyznaczonego pojemnika na odpady i raz umyj komórki PBS.

Następnie dodaj 0,5% Triton X do PBS, aby przeniknąć komórki i inkubować przez 2,5 minuty. Po inkubacji usuń Triton X i myj komórki dwukrotnie PBS przez 10 minut każda. Aby zablokować komórki, inkubuj je 5% surowicową albuminą w PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wykonaj procedurę barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie ze standardowym protokołem. Na koniec wykonaj mikroskopię, aby uzyskać obrazy zarówno komórek stałych, jak i żywych. Barwienie żywych komórek Peroxi_SPY sondami skutkowało importem kasetowej podrodziny D zależnym od ATP do peroksysomów, co powodowało wysoki stosunek fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w komórkach metabolicznie aktywnych.

W dzikich komórkach typu HEK-293T ekspresujących GFP-SKL barwienia Peroxi_SPY555 wykazywały wyraźną kolokalizację z peroksysomami, podczas gdy w komórkach knockout PEX19 pozbawionych peroksysomów barwienie było nieobecne. W ludzkich fibroblastach barwienie Peroxi_SPY współlokalizowało się z markerem paroksysmalnym GFP-SKL, potwierdzając celowanie peroksysome. Ilościowa ilościowa ilościowość peroksysomów wykazała istotne zróżnicowanie między różnymi typami komórek.

Zoptymalizowane warunki barwienia w komórkach COS-7 przy użyciu Peroxi_SPY nanomolowego 250 nanomolów przez 20 minut znacząco zwiększyły stosunek fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w porównaniu do oryginalnego protokołu z jednym mikromolarem przez 10 minut. Przedłużona inkubacja komórek HEK-293T z Peroxi_SPY przez 24 godziny doprowadziła do poprawy stosunku intensywności fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w porównaniu do 15 minut, mimo zmniejszonego barwienia peroksysomowego. Protokół utrwalania umożliwił skuteczne barwienie przeciwciał, co zostało wykazane przez zachowane znakowanie Peroxi_SPY oraz immunodbarwienie anty-PEX14 w komórkach HuH-7 i HEK-293T.

Ilościowość wykazała, że procedury fiksacji i permeabilizacji wpływały na intensywność peroksysomu fluorescencji w porównaniu z barwieniem żywych komórek. Opracowaliśmy Peroxi_SPY barwnik, który można wykorzystać do wizualizacji peroksysomów zarówno w żywych, jak i stałych komórkach zwierzęcych. Nasza sonda fluorescencyjną oferuje prostą i szybką metodę badania dynamiki peroksysomów, heterogeniczności i dysfunkcji w sposób wcześniej ograniczony.

Protokół ten umożliwi badania peroksysomów oparte na obrazowaniu w różnych typach komórek, w tym komórkach pochodzących od pacjentów z zaburzeniami napadowymi.