Name: Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę barwienia peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond PeroxiSPY. Protokoły umożliwiają wizualizację w komórkach żywych i utrwalonych, wspierając badania dynamiki organelli w zdrowiu i chorobie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Obrazowania i Mikroskopii Szkoły Nauk Biologicznych (IMC) za udostępnienie niezbędnego sprzętu. TA była finansowana przez długoterminowe stypendium HFSP (LT000559/2021-L), Uniwersytet w Southampton, Wessex Medical Research Innovation Grant oraz European Leukodystrophy Association (ELA). Studia magisterskie są wspierane przez program ELISIR Szkoły Nauk Przyrodniczych EPFL, Fundację Bryn Turner-Samuels oraz Fondation Bios pour la recherche. CH był finansowany przez letnie stypendium Royal Microscopical Society. REC jest wspierany przez stypendium Odkryć Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/Z514767/1). MSvA był wspierany przez letnie studia Stowarzyszenia Biochemicznego.

1. Barwienie żywych komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie hodowli komórek do obrazowania żywych komórek (czas: 24 godziny) UWAGA: Badanie stosowało standardowe protokoły hodowli komórek we wszystkich eksperymentach. Linie komórkowe były utrzymywane w DMEM lub DMEM/F12 dla SH-SY5Y, uzupełnione o 10% surowicy płodowej bydła (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C oraz 5%CO2. Niektóre systemy obrazowania są wrażliwe na skład ośrodka. Jeśli mikroskop wykryje sygnał z czerwieni fenolowej w ośrodku, należy użyć alternatyw wolnych od fenolu czerwonego. Dodatkowo, jeśli mikroskop nie jest wyposażony w komoręCO2 , zamień ośrodek na medium zawierające HEPES (pH 7,4).<ol>
		<li>Dzień przed eksperymentem rozdziel komórki na szklaną płytę obrazującą, aby następnego dnia osiągnąć 30-70% konfluencję. UWAGA: W tym protokole stosowano płytki 4-wiertowe o średnicy 35 mm.<ol>
			<li>(Krytyczne) Nie używaj wygłodniałych lub zestresowanych komórek do rozdzielania na potrzeby eksperymentu. Upewnij się, że linie komórkowe regularnie zmieniają świeże media (co najmniej co 2-3 dni) i są rozdzielane zanim osiągną 90% konfluencji. Celem jest posiadanie zdrowej linii komórkowej, aby zapewnić jednolite barwienie. UWAGA: Niektóre komórki, np. komórki macierzyste, wymagają powlekania szkłem odpowiednią warstwą powłoki, np. Matrigel, która nie przeszkadza w barwieniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zestawu obrazowego (czas trwania: 1 godzina) UWAGA: Obrazowanie organelli i dynamiki organelli wymaga wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Do tego protokołu użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł fotopowielacza GaAsP, komoręCO2 oraz jednostkę do regulacji temperatury. Obrazowanie wykonano w trybie dwukierunkowego skanowania galwanometru z obiektywem CFI Plan Apo Lambda 60x oil NA 1.42, a do sondy 555 zastosowano laser o mocy 561 nm (50 mW). Użyj lasera 640 nm lub odpowiednika do sondy 650. Peroksysomy były wizualizowane w ludzkich liniach komórkowych. Czas inkubacji sondami może się różnić w zależności od linii komórkowych. Zaleca się optymalizację czasu poprzez wizualizację komórek w różnych punktach po barwieniu (Rysunek 2A).<ol>
		<li>Inicjuj układ konfokalny. Upewnij się, że stężenieCO2 i temperatura (37 °C) są ustabilizowane przez 20 minut przed rozpoczęciem barwienia i wprowadzeniem komórek pod mikroskop. UWAGA: (Krytyczne) Niezbędne jest zweryfikowanie, czy komórki pozostają zdrowe przez cały eksperyment poprzez wizualną inspekcję oraz utrzymanie pH i temperatury podłoża. Można to osiągnąć poprzez wykorzystanie jednostek sterujących parametrów i wizualną analizę koloru medium, jeśli używa się czerwieni fenolowej. Do tego można użyć regulatorów temperatury iCO2 .</li>
		<li>Ustaw oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Uruchom oprogramowanie i włącz laser 561 nm do barwienia sondą 555. Dostosuj parametry akwizycji i mocy lasera. Protokół ten wykorzystuje 1% mocy lasera, wzmocnienie HV (wzmocnienie) 100 oraz rozdzielczość 1024 1024 pikseli z 3 zoomami do obrazowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie peroksysomem (czas trwania: 1-5 min)<ol>
		<li>Pipeta to aliquot sondy dla końcowego stężenia roboczego 1 μM, np. dla 0,5 mL ośrodka, pipeta 0,5 μL sondy.</li>
		<li>Wybierz dołek do bejcowania i oznacz go na zewnątrz markerem.</li>
		<li>Z wybranego dołku pipetować cały (0,5 mL) medium i przeprowadzić je do rurki mikrowirówki zawierającej aliquot sondy z etapu 1.3.1. UWAGA: Kluczowe jest usunięcie wszystkich mediów z studni na tym etapie, aby zapewnić jednolite barwienie.</li>
		<li>Pipetą połącz w górę i w dół trzy razy, żeby połączyć nośnik z sondą. Wssaj całą mieszankę do pipety. UWAGA: Zamiast pipetowania można stosować mieszanie przez wirowanie.</li>
		<li>Dozuj mieszankę z powrotem do wybranej studni kropla po kroplu, upewniając się, że pipeta styka się ze ścianą studni. Po ponownym wlaniu mieszanki do studni rozpocznij 10-minutowy timer.</li>
		<li>Zamknij pokrywkę, dodaj kroplę oleju immersyjnego na obiektyw (ten protokół wykorzystuje obiektyw olejowy 60×) i umieść płytkę na mikroskopie do obrazowania. UWAGA: Zaleca się optymalizację stężenia sondy dla każdej linii komórkowej, aby zapewnić jednolite barwienie. Zaleca się badanie w stężeniach 0,25, 0,5, 1 i 2 μM przez 5-20 minut; niższe stężenia zazwyczaj barwią się o niższym tle (Rysunek 2A). W zależności od linii komórkowej i czułości detektora mikroskopu, barwione komórki można obrazować od 5 minut po dodaniu sondy do 24 godzin po dodaniu. W niektórych przypadkach, na przykład obrazowanie komórek macierzystych, wizualizacja komórek może trwać ponad 180 minut po dodaniu sondy bez zmiany sygnału. W dowolnym momencie można zmienić nośnik, aby wypłukać sondę. To prowadzi do stopniowej utraty barwienia w ciągu około 30 minut dla HEK293T komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfokalne obrazowanie peroksysomów w żywych komórkach (czas trwania: 10 min-3 godziny)<ol>
		<li>Gdy płytka zostanie umieszczona na mikroskopie, dostosuj ostrość na komórki w dołku, które są barwione, i rozpocznij obrazowanie.</li>
		<li>Gdy ogniwa są ostre, dostosuj wzmocnienie (czułość HV lub detektora) oraz ustawienia mocy lasera, stosując standardowe zasady ustawienia mikroskopu konfokalnego.</li>
		<li>Znajdź i pozycjonuj (Zoom-In) na grupie komórek. Po skupieniu ostrości na komórkach dostosuj parametry akwizycji do wymaganej jakości obrazu.<ol>
			<li>Ustaw parametry obrazowania do akwizycji obrazu: 0,5-1% mocy lasera, 100 HV (wzmocnienie) w oprogramowaniu NIS-Elements. Sprawdź, czy obraz nie jest przesycony (jeśli tak, zmień intensywność i wzmocnienie).</li>
			<li>Wybierz rozmiar skanu. Pobierz 1024 obrazy o długości 1024 pikseli, prędkość skanowania (1/2-1/4), uśrednianie linii (2), powiększenie (3) odpowiednie do wykonywanego obrazowania. UWAGA: Peroksysomy przesuwają się podczas akwizycji obrazu, co może prowadzić do powstawania artefaktów. Zalecane parametry są zoptymalizowane tak, aby zminimalizować ślady ruchu, jednocześnie zapewniając odpowiednią jakość obrazów do ilości. Podczas tworzenia time-lapse upewnij się, że przed rozpoczęciem filmu określono interwał, czas trwania i pętle. Sondy są fotowalne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobierz i zapisz wszystkie obrazy z dostępnymi etykietami (tutaj używany jest format oprogramowania Nikon .nd2 NIS-Elements).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie komórek stałych
<ol>
	<li>Przygotowanie hodowli komórek do obrazowania żywych komórek (czas: 24 godziny) UWAGA: Stosowano standardowe protokoły kultywacji komórek we wszystkich eksperymentach. Komórki Huh7 były utrzymywane w DMEM/F12 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 37 °C i 5%CO2.<ol>
		<li>Dzień przed eksperymentem podziel komórki na płytkę z pokrywkami, aby następnego dnia uzyskać 30-70% konfluentności. UWAGA: Zasiewaj 50 000 komórek/studnię na płytach 12-dołkowych z pokrywkami 18 mm lub 15 000 komórek/odwierć na płytach 24-dołkowych z pokrywkami 13 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie peroksysomem (czas trwania: 1-5 min)<ol>
		<li>Rozcieńcz sondę nowym medium do końcowego stężenia roboczego 4 μM w pustej, światłoczułej mikrowirówce, np. dla 0,5 mL medium pipetą 2 μL sondy (roztwór zapasowy: 1 mM).</li>
		<li>Wybierz dołek do bejcowania i oznacz go na zewnątrz markerem.</li>
		<li>Z wybranego otworu zasysaj cały (0,5 mL) medium i zamień je na medium sondujące od kroku 2.2.1. Podawaj medium sondowego do wybranego dołka kropla po kroplu, upewniając się, że pipeta styka się ze ścianą studni.</li>
		<li>Po ponownym włożeniu mieszaniny do studni inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut. UWAGA: Od tej chwili ogniwa są światłoczułe i powinny być pokryte folią aluminiową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiksacja po barwieniu i peroksysomy obrazowania w ustalonych komórkach<ol>
		<li>Po barwieniu ostrożnie usuń medium i dwukrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Stosuj 4% roztwór paradehydu (PFA) w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń PFA do specjalnie wyznaczonego pojemnika na odpady. Umyj komórki raz za pomocą PBS. UWAGA: PFA jest toksyczna i musi być utylizowana zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
		<li>Aby przejść do immunofluorescencji, postępuj zgodnie z poniższymi krokami<ol>
			<li>Dodaj 0,5% Triton-X (rozcieńczony w PBS), aby przeniknąć komórki. Wyjedź na 2,5 minuty.</li>
			<li>Ostrożnie usuń Triton-X. Myj komórki dwa razy, przez 10 minut z PBS.</li>
			<li>Blokuj z 5% roztworem surowicy bydłej (BSA) w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.</li>
			<li>Przejdź do standardowego zabiegu immunofluorescencji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kassmann, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+peroxisomes+-+essential+organelles+for+the+maintenance+of+white+matter+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system.</a> Biochimie. 98, 111-118 (2014).</li>
<li>van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of peroxisomes.</a> Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).</li>
<li>Aubourg, P., Wanders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal disorders.</a> Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).</li>
<li>Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome biogenesis disorders.</a> Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).</li>
<li>Korotkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+fatty+acid+conjugates+for+live+cell+imaging+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes.</a> Nat Commun. 15, 4314(2024).</li>
<li>Bezman, L., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+X-linked+adrenoleukodystrophy+and+the+relative+frequency+of+its+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes.</a> Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).</li>
<li>Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+transport+across+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Metabolite transport across the peroxisomal membrane.</a> Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).</li>
<li>Matsuzono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+PEX19%3A+cDNA+cloning+by+functional+complementation%2C+mutation+analysis+in+a+patient+with+Zellweger+syndrome%2C+and+potential+role+in+peroxisomal+membrane+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).</li>
<li>Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+promotes+peroxisome+biogenesis+and+peroxisome-endoplasmic+reticulum+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction.</a> J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).</li>
<li>Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peroxisomal+targeting+signal+at+the+carboxy+terminus+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase.</a> J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).</li>
<li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+near-infrared+fluorophore+for+live-cell+super-resolution+microscopy+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins.</a> Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).</li>
</ol>

LR posiada akcje Spirochrome AG. Wszyscy inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To proste wykrycie peroksysomem można wykonać w mniej niż 10 minut w komórkach zwierzęcych. Barwienie PeroxiSPY umożliwia wizualizację, ilościową i śledzenie peroksysomów w żywych komórkach i jest dostępne jako czerwona (Tabela materiałów) oraz sonda dalekoczerwona5 (Tabela materiałów). Barwienie to zapewnia podobną wizualizację peroksysomów do klasycznego barwienia opartego na sygnałach peroksysomów (PTS1)l10 (Rysunek 1B) bez potrzeby nadmiernej ekspresji. Fluorofory są fotostabilne i mogą być wykorzystywane do obrazowania superrozdzielczości oraz długoterminowego pozyskiwania dynamiki peroksysomów w różnych warunkach eksperymentalnych 5,9,11. Dodatkowo sondy są wrażliwe na działanie peroksysomów; dlatego mogą być wykorzystywane do wykrywania i ilościowego określania patologii peroksysomów5 w badaniach i zastosowaniach diagnostycznych. Barwienie peroksysomem zależy od metabolizmu peroksysomów oraz ich zdolności do importu i utleniania kwasów tłuszczowych. Dlatego ważne jest optymalizacja stężenia i czasu dla używanych linii komórkowych. Przedstawiamy tutaj standardową procedurę, która działa dla testowanych linii komórkowych; jednak czas barwienia można wydłużyć do 24 godzin bez utraty stosunku intensywności fluorescencji peroksjomom do cytoplazmy (rysunek 2B).
Sondy były testowane w wielu liniach komórkowych ssaków (Rysunek 1 i Rysunek 2) oraz w komórkach i embrionach danio Danio rerio 5, wykazując specyficzność wobec peroksysomów i łatwość użycia. Te sondy nie były testowane w innych liniach komórkowych zwierząt, a warunki oraz stężenia sond będą musiały zostać zoptymalizowane pod kątem nich. Sondy nie barwią peroksysomów w komórkach roślin Arabidopsis thaliana 5.
Omówiono tutaj niektóre problemy oraz ich rozwiązania w zakresie rozwiązywania problemów. Jeśli stosunek peroksysomów do cytoplazmy jest zbyt niski (niskie barwienie peroksysome), upewnij się, że komórki są świeżo rozdzielone, a następnie ponownie je rozdziel dla barwienia. Do bejcowania używaj 30-70% konfluencji. Zoptymalizuj stężenie sondy (zbyt wysokie stężenie spowoduje przekroczenie zdolności peroksysomowej do pochłaniania sond) oraz czas (na przykład patrz Rysunek 2A). Użyj naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm (barwienie na płytach z 96 dołkami jest trudniejsze ze względu na niewielką ilość mieszania). Upewnij się, że sondy są dodane do rurki mikrowirówki i dokładnie wymieszane z medium przed dodaniem do komórek. Różne linie komórkowe i różne warunki wpływają na barwienie. Na koniec, wypłukanie sondy zmniejsza tło; jednak sygnał będzie stopniowo tracony, skracając czas efektywnego przeprowadzania obrazowania.
Jeśli nie ma widocznych peroksysomów, upewnij się, że sonda została zmieszana z ośrodkiem. Zwiększ stężenie sondy (np. do 2 μM). Wprowadź dodatkowy marker peroksysomowy, aby umożliwić wizualizację peroksysomów. Jeśli występują różnice w barwieniu między komórkami, ważne jest, aby usunąć wszystkie nośniki i dokładnie je wymieszać z aliquotami przed ponownym dodaniem do komórek. Zapewnia to jednolite barwienie. Jeśli nadal występuje zmienność, możliwe, że populacja komórek jest niejednorodna pod względem zdolności importu substratów peroksysomów. Synchronizacja komórek poprzez regularne rozszczepienie pomaga w jednolitym barwieniu. Jeśli nie wykryje się sygnału, sprawdź, czy ustawienia lasera na mikroskopach są zgodne z parametrami wzbudzenia/emisji sondy. Jeśli tło poza komórką jest zbyt jasne, wypłukaj sondy, aby usunąć to tło; jednak sygnał będzie stopniowo tracony, skracając okno czasowe, w którym obrazowanie może być skuteczne. Dodatkowo fiksacja może być użyta do redukcji tła. Jeśli sygnał po fiksacji jest bardzo słaby, sprawdź, czy sygnał nie został utracony po dodaniu Triton-X 100. Ten etap może być modyfikowany lub usuwany w zależności od dalszej aplikacji. Ogranicz liczbę kroków mycia.

Peroksysom jest najliczniejszym organellem eukariotycznym, z niektórymi komórkami przekraczającymi tysiąc peroksysomów1. Ich funkcje są kluczowe dla rozwoju organizmu i adaptacji metabolicznej 1,2, co potwierdzają różne ludzkie zaburzenia peroksysomowe, zazwyczaj nieuleczalne neurodegeneracyjne i neurometaboliczne schorzenia u małych dzieci 3,4. Z naszej wiedzy wynika, że wcześniej brakowało selektywnych metod oznaczania peroksysomów w żywych komórkach i tkankach. Narzędzia te są nieocenione w badaniach i zastosowaniach diagnostycznych, umożliwiając bezpośrednie i ilościowe pomiary kilku aspektów powstawania i funkcji peroksysomów6. Te sondy są na tyle wszechstronne, że z jednej strony dostarczają ilościowego odczytu funkcji peroksysomu w komórkach, a z drugiej strony mogą być stosowane w testach skuteczności translacyjnej lub jako diagnostyka zaburzeń peroksysomów6. Barwienie PeroxiSPY to szybka, specyficzna, niecytotoksyczna technika wykrywania peroksysomów w nieinwazyjnych żywych komórkach. Tutaj opisujemy, jak barwić peroksysomy w liniach komórkowych ssaków za pomocą sond peroksysomowych (sondy wykazały również specyficzne barwienie peroksysomów w embrionach danio pręgowanego, ale nie są odpowiednie do barwienia peroksysomów w komórkach roślin Arabidopsis thaliana 6). Barwienie można wykonać w mniej niż 10 minut. Sonda może być wykrywana przez wiele godzin lub fiksowana za pomocą protokołu utrwalania paraformaldehydu do dalszego immunobarwienia.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało przeciw PEX14</td><td>Proteintech</td><td>10594-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>A1r</td><td>Każdy mikroskop konfokalny z obiektywem o wysokiej NA, np. 60x olejowy NA1.4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech</td><td>&nbsp; P04-03590</td><td>Medium hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płyty obrazujące ze szklanym dnem</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Kozi antykróliczy Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>ABCAM</td><td>ab150081</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PeroxiSPY555</td><td>Spirochrom</td><td>https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/</td><td>&nbsp; https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2</td></tr><tr><td>PeroxisPY650</td><td>Spirochrom</td><td>https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/</td><td>&nbsp; https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2</td></tr></tbody></table>

barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

Peroxisome Staining in Mammalian Cells Using Peroxisome-Specific Probes

Peroksysomy to wszechobecne organelli, odgrywające istotną rolę w zdrowiu człowieka, a ich dysfunkcja prowadzi do spektrum zaburzeń genetycznych. Wizualizacja peroksysomów jest kluczowa do identyfikacji dysfunkcji peroksysomów; Jednak postępy zostały ograniczone przez brak sond specyficznych dla peroksysomów. Opracowując PeroxiSPY, sondy specyficzne dla peroksysomów naśladujące naturalne metabolity peroksysomów, umożliwiliśmy w czasie rzeczywistym wykrywanie, śledzenie i ilościowe określanie dynamiki peroksysomów w żywych komórkach ssaków. Dodatkowo, zastosowania tej techniki u komórek pacjentów z zaburzeniami peroksysomowymi ujawniają fenotypy patologiczne. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół wykrywania peroksysomów w żywych komórkach ssaków, a także wykrywania peroksysomów po barwieniu w komórkach stałych. Pokazujemy, jak barwić peroksysomy w żywych komórkach za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów, koncentrując się na przygotowaniu komórek, czasie zabiegu, powtarzalności i rozwiązywaniu problemów. Sondy te umożliwiają szybkie, specyficzne i nietoksyczne wykrywanie peroksysomów w żywych komórkach, oferując unikalną, ilościową metodę oceny funkcji peroksysomów i ich dysfunkcji w zaburzeniach związanych z peroksysomami.

Sondy PeroxiSPY są zaprojektowane tak, aby naśladować naturalne podłoża peroksysomów – rozgałęzionych i bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych5. W związku z tym barwienie spowoduje zależny od adenozynotrifosforanu (ATP) importu kasetowych podrodziny D (ABCD) sond z cytoplazmy do peroksysomów 5,6,7. W zależności od stanu metabolicznego komórki, transport ABCD zależny od ATP może efektywnie i szybko importować sondy, co skutkuje wysokim stosunkiem intensywności fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy (Rysunek 1A). Kluczowe kroki mające na celu zapewnienie wysokiego stosunku obejmują unikanie głodzenia komórek poprzez regularną wymianę podłoża komórkowego oraz niewzrost komórek przy dużej konfluencji.
Aby zweryfikować specyficzność barwienia peroksysomem, zaleca się uwzględnienie kilku środków kontrolnych (Rysunek 1B,C). Analiza współlokalizacji z użyciem referencyjnego markera peroksisomalnego, na przykład markera importu białek - GFP-SKL (rysunek 1B,C). Dodatkowo, jeśli dostępne są linie komórkowe z niedoborem peroksysomu, np. PEX19 KO, barwienie będzie nieobecne w tych komórkach (rysunek 1B)5,8.
Sondy peroksysomowe mogą być używane do pomiaru gęstości peroksysomów (rysunek 1C)5,9 i są rozwijane w celu oceny importu podłoża, dynamiki peroksysomów oraz interakcji. W przypadku obrazowania ilościowego ważne jest ustandaryzowanie procedury barwienia, czasu akwizycji obrazu (np. 10-20 minut po barwieniu), przygotowania linii komórkowej oraz parametrów pozyskiwania. Niektóre linie komórkowe wymagają optymalizacji stężenia sondy oraz czasu w celu poprawy intensywności sygnału peroksysomów względem tła cytosolowego, np. 250 nM i 20 min lepiej sprawdzają się dla komórek COS-7 (Rysunek 2A). Komórki metabolizują sondy, co prowadzi do stopniowego zmniejszania barwienia peroksysomów z czasem; jednak stosunek peroksysomu do cytoplazmy może poprawić się w ciągu 24 godzin (rysunek 2B). Dodatkowo opracowaliśmy procedurę fiksacji, która pozwala na współbarwienie z przeciwciałami oraz wizualizację peroksysomów w późniejszym czasie (rysunek 2C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69405/69405fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Obrazowanie żywych komórek peroksysomów. (A) Schemat barwienia. (B) Mikroskopia konfokalna WT i PEX19 KO HEK293T komórek nadekspresjonujących GFP-SKL i barwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 1 μm i 10 μm. Przedstawiony jest reprezentatywny profil intensywności. (C) Mikroskopia konfokalna ludzkich fibroblastów o nadekspresji GFP-SKL i barwieniu PeroxiSPY (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 1 μm i 10 μm. Przedstawiony jest reprezentatywny profil intensywności. (D) Mikroskopia konfokalna komórek SW13 (kora nadnerczy), SH-SY5Y (neuroblasty), CCL-136 (miocyty), HaCat (keratynocyty), U2OS (osteoblasty) oraz HEK293T (ludzka nerka embrionalna) zabarwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 2 μm i 10 μm. Ilościowość przeprowadzono na Fidżi zgodnie z wcześniej opisaną liczbą9 i pokazuje liczbę peroksysomów na mikron kwadrat, średnią ± SEM, N = 100 komórek zebranych z 3 powtórzeń biologicznych, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Test Kruskala-Wallisa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69405/69405fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69405/69405fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Optymalizacja obrazowania peroksysomów i barwienie stałych komórek. (A) Mikroskopia konfokalna komórek COS-7 (afrykańska zielona małpa) barwiona czerwoną sondą peroksysometyczną zgodnie z protokołem (1 μM przez 10 minut; przed optymalizacją) i w warunkach optymalizowanych (250 nM przez 20 minut; po optymalizacji). Pasek skali - 10 μm. Średnia intensywność pikseli peroksysomów i cytosolu została zidentyfikowana za pomocą Fidżi i wyrażona jako stosunek. N = 7 komórek (przed optymalizacją) i 21 komórek (po optymalizacji). Średnia ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. (B) Mikroskopia konfokalna HEK293T komórek barwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM) przez 15 minut i 24 godziny. Ilościowa analiza pokazuje intensywność fluorescencji peroksysomów i cytoplazmy, a także stosunek peroksysomów do cytoplazmy, średnią ± SEM, N = 680 peroksysomów zebranych z 3 powtórzeń biologicznych, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. (C) Mikroskopia konfokalna komórek Huh7 barwionych sondami peroksysomowymi za pomocą protokołu fiksacji. Peroksysomy były współbarwione przeciwciałem pierwotnym przeciwciałem anty-PEX14 (1:100 w roztworze blokującym, 1 godzina inkubacji w RT) oraz przeciwciałem wtórnym (1:1000 w roztworze blokującym, Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488, 1 godzina inkubacji w RT). Prezentowane są reprezentatywne obrazy konfokalne. Skala - 10 μm. (D) Ilościowa analiza pokazuje zmiany intensywności fluorescencji peroksysomów podczas fiksacji i permeabilizacji przeprowadzonej na HEK293T komórkach zgodnie z protokołem, średnia ± SEM, N = 100 komórek zebranych z trzech powtórzeń biologicznych, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69405/69405fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Sondy PeroxiSPY są używane do wykrywania peroksysomów w komórkach ssaków. Tutaj pokazujemy, jak używać sond do barwienia peroksysomów w żywych i stałych komórkach.

Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

Peroxisomes are ubiquitous organelles with essential roles in human health, and their dysfunction leads to a spectrum of genetic disorders. Visualization ...

Dlatego nasze badania koncentrują się na zrozumieniu peroksysomów, które są niezbędnymi organellami dla metabolizmu lipidów i równowagi oksydacyjnej komórkowej. Naszym celem jest odkrycie, jak reguluje się ich strukturę i funkcję oraz jak te procesy zmieniają się w chorobach. Aby to osiągnąć, opracowujemy sondy fluorescencyjne, które pozwalają nam i szerszej społeczności naukowej wizualizować peroksysomy w różnych komórkach zwierzęcych.Opracowujemy tutaj protokoły barwienia działające zarówno w żywych, jak i stałych komórkach, dostarczając potężnych narzędzi do badania biologii paroksetyny w zdrowiu i patologii. Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest osiągnięcie nieinwazyjnego znakowania peroksysomów w komórkach zwierzęcych. Chociaż barwienie przeciwciał pomaga to przezwyciężyć, brakuje komercyjnie dostępnych przeciwciał przeciwciał do białek paroksyzmowych.Kolejnym wyzwaniem jest nieinwazyjne wizualizowanie peroksjosomów w czasie rzeczywistym, co wymaga elastycznych protokołów. I wreszcie, tradycyjne barwienie nie daje funkcjonalnego odczytu. Natomiast barwienie oparte na peroksydazie może się różnić w zależności od funkcji paroksysmalnej, co jest zarówno wyzwaniem, jak i szansą, ponieważ pozwala rozróżnić stany funkcjonalne paroksysmalne wewnątrz komórki.Zacznij od komórek ssaków zasianych dzień wcześniej na talerzu z pokrywkami, które obecnie mają łączność 30 do 70%. Rozcieńcz sondę peroksysomem świeżym medium w światłoczułej, mikrowirowanej probówce, aby uzyskać końcowe stężenie czteromikromolowe. Wybierz pożądany dołek do bejcowania i oznacz zewnętrzną stronę markerem.Aspiruj 0,5 mililitra podłoża z wybranego odwiertu i zastąp je przygotowanym materiałem sondowym kropla po kropli wzdłuż ściany odwiertu. Po wydaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Od tego momentu zabezpieczaj ogniwa przed światłem za pomocą folii aluminiowej.Po inkubacji ostrożnie usuń zabarwione medium i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Następnie umieść płytkę pod chemicznym kapturem, dodaj 4% paradehydu w PBS do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po utrwaleniu usuń paraformaldehyd do wyznaczonego pojemnika na odpady i raz umyj komórki PBS.Następnie dodaj 0,5% Triton X do PBS, aby przeniknąć komórki i inkubować przez 2,5 minuty. Po inkubacji usuń Triton X i myj komórki dwukrotnie PBS przez 10 minut każda. Aby zablokować komórki, inkubuj je 5% surowicową albuminą w PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wykonaj procedurę barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie ze standardowym protokołem. Na koniec wykonaj mikroskopię, aby uzyskać obrazy zarówno komórek stałych, jak i żywych. Barwienie żywych komórek Peroxi_SPY sondami skutkowało importem kasetowej podrodziny D zależnym od ATP do peroksysomów, co powodowało wysoki stosunek fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w komórkach metabolicznie aktywnych.W dzikich komórkach typu HEK-293T ekspresujących GFP-SKL barwienia Peroxi_SPY555 wykazywały wyraźną kolokalizację z peroksysomami, podczas gdy w komórkach knockout PEX19 pozbawionych peroksysomów barwienie było nieobecne. W ludzkich fibroblastach barwienie Peroxi_SPY współlokalizowało się z markerem paroksysmalnym GFP-SKL, potwierdzając celowanie peroksysome. Ilościowa ilościowa ilościowość peroksysomów wykazała istotne zróżnicowanie między różnymi typami komórek.Zoptymalizowane warunki barwienia w komórkach COS-7 przy użyciu Peroxi_SPY nanomolowego 250 nanomolów przez 20 minut znacząco zwiększyły stosunek fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w porównaniu do oryginalnego protokołu z jednym mikromolarem przez 10 minut. Przedłużona inkubacja komórek HEK-293T z Peroxi_SPY przez 24 godziny doprowadziła do poprawy stosunku intensywności fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy w porównaniu do 15 minut, mimo zmniejszonego barwienia peroksysomowego. Protokół utrwalania umożliwił skuteczne barwienie przeciwciał, co zostało wykazane przez zachowane znakowanie Peroxi_SPY oraz immunodbarwienie anty-PEX14 w komórkach HuH-7 i HEK-293T.Ilościowość wykazała, że procedury fiksacji i permeabilizacji wpływały na intensywność peroksysomu fluorescencji w porównaniu z barwieniem żywych komórek. Opracowaliśmy Peroxi_SPY barwnik, który można wykorzystać do wizualizacji peroksysomów zarówno w żywych, jak i stałych komórkach zwierzęcych. Nasza sonda fluorescencyjną oferuje prostą i szybką metodę badania dynamiki peroksysomów, heterogeniczności i dysfunkcji w sposób wcześniej ograniczony.Protokół ten umożliwi badania peroksysomów oparte na obrazowaniu w różnych typach komórek, w tym komórkach pochodzących od pacjentów z zaburzeniami napadowymi.

peroxisome-staining-mammalian-cells-using-peroxisome-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna.  Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Ten protokół dostarcza instrukcje dotyczące wyzwalania i monitorowania pexofagii za pośrednictwem Stub1 w żywych komórkach.

Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Zawartość wodoronadtlenku lipidów stanowi najczęściej używany wskaźnik śmierci komórek ferroptotycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach po indukcji ferroptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Poznaj metodę barwienia peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond PeroxiSPY. Protokoły umożliwiają wizualizację w komórkach żywych i utrwalonych, wspierając badania dynamiki organelli w zdrowiu i chorobie.

Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

Przeglądaj więcej filmów