Name: Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-16T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metody ilościowego liczenia komórek nerwowych w mózgach ssaków. Badanie porównawcze ujawnia różnice międzygatunkowe w populacjach neuronów gryzoni i ludzi, pomagając zrozumieć ewolucyjne wzorce rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Matteo Piumattimu i Chiarze La Rosa za współdziałanie w definiowaniu protokołu opisanego tutaj dla neuronów niedojrzałych korowych. Prace były wspierane przez Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (grant RF=2022.0618) dla LB; PRIN2022 (grant 2022LB4X3N) dla LB; National Science Foundation (granty EF-2021785, DRL-2219759) oraz National Institutes of Health (granty NS092988 AG067419) dla CCS.

<ol><li>Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+from+the+bottleneck%3A+benefits+of+the+comparative+approach+to+modern+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience.</a> Trends Neurosci. 38 (5), 273-278 (2015).</li>
<li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+translational+research%3A+rosetta+stone+or+stumbling+block%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Animal models in translational research: rosetta stone or stumbling block.</a> Bioessays. 39 (12), 1-8 (2017).</li>
<li>Moreno-Jiménez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-García, M., Rábano, A., Llorens-Martín, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidences+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans.</a> J Neurosci. 41 (12), 2541-2553 (2021).</li>
<li>Sorrells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+controls+in+adults+and+children+support+that+very+few%2C+if+any%2C+new+neurons+are+born+in+the+adult+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus.</a> J Neurosci. 41 (12), 2554-2565 (2021).</li>
<li>Simard, S., Matosin, N., Mechawar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis+in+the+human+brain%3A+updates%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis in the human brain: updates, challenges, and perspectives.</a> Neuroscientist. 31 (4), 141-158 (2024).</li>
<li>Bao, H., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+brain+disorders+by+targeting+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Treating brain disorders by targeting adult neural stem cells.</a> Trends Mol Med. 24 (12), 991-1006 (2018).</li>
<li>Ghibaudi, M., Zanone, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+plasticity+in+large-brained+mammals%3A+not+only+narrowing+roads%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Brain structural plasticity in large-brained mammals: not only narrowing roads.</a> Neural Regen Res. 21 (5), 1669-1680 (2026).</li>
<li>Bonfanti, L., La Rosa, C., Ghibaudi, M., Sherwood, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+%26%2334%3Bimmature%26%2334%3B+neurons+in+mammals%3A+an+evolutionary+tradeoff+in+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and &#34;immature&#34; neurons in mammals: an evolutionary tradeoff in plasticity.</a> Brain Struct Funct. 229 (8), 1775-1793 (2024).</li>
<li>Paredes, M. F., Sorrells, S. F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+size+and+limits+to+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain size and limits to adult neurogenesis.</a> J Comp Neurol. 524 (3), 646-664 (2016).</li>
<li>Parolisi, R., Cozzi, B., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humans+and+dolphins%3A+decline+and+fall+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Humans and dolphins: decline and fall of adult neurogenesis.</a> Front Neurosci. 12, 497(2018).</li>
<li>Snyder, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recalibrating+the+relevance+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recalibrating the relevance of adult neurogenesis.</a> Trends Neurosci. 42 (3), 164-178 (2019).</li>
<li>Bonfanti, L., Charvet, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+plasticity+in+humans+and+model+systems%3A+advances%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Brain plasticity in humans and model systems: advances, challenges, and future directions.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9358(2021).</li>
<li>Duque, A., Arellano, J. I., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+existence+of+adult+neurogenesis+in+humans+and+value+of+its+rodent+models+for+neuropsychiatric+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An assessment of the existence of adult neurogenesis in humans and value of its rodent models for neuropsychiatric diseases.</a> Mol Psychiatry. 27, 377-382 (2022).</li>
<li>Gómez-Climent, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+prenatally+generated+cells+in+the+rat+paleocortex+maintains+an+immature+neuronal+phenotype+into+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">A population of prenatally generated cells in the rat paleocortex maintains an immature neuronal phenotype into adulthood.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2229-2240 (2008).</li>
<li>Rotheneichner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+in+the+adult+murine+piriform+cortex%3A+continuous+maturation+of+dormant+precursors+into+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity in the adult murine piriform cortex: continuous maturation of dormant precursors into excitatory neurons.</a> Cereb Cortex. 28 (7), 2610-2621 (2018).</li>
<li>Sorrells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+excitatory+neurons+develop+during+adolescence+in+the+human+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature excitatory neurons develop during adolescence in the human amygdala.</a> Nat Commun. 10 (1), 2748(2019).</li>
<li>La Rosa, C., Parolisi, R., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structural+plasticity%3A+from+adult+neurogenesis+to+immature+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">structural plasticity: from adult neurogenesis to immature neurons.</a> Front Neurosci. 14, 75(2020).</li>
<li>Bonfanti, L., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PSA-NCAM-positive+%26%2334%3Bimmature%26%2334%3B+neurons%3A+an+old+discovery+providing+new+vistas+on+brain+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The PSA-NCAM-positive &#34;immature&#34; neurons: an old discovery providing new vistas on brain structural plasticity.</a> Cells. 10 (10), 2542(2021).</li>
<li>Benedetti, B., Couillard-Després, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+would+the+brain+need+dormant+neuronal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why would the brain need dormant neuronal precursors.</a> Front Neurosci. 16, 877167(2022).</li>
<li>Luzzati, F., Bonfanti, L., Fasolo, A., Peretto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCX+and+PSA-NCAM+expression+identifies+a+population+of+neurons+preferentially+distributed+in+associative+areas+of+different+pallial+derivatives+and+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">DCX and PSA-NCAM expression identifies a population of neurons preferentially distributed in associative areas of different pallial derivatives and vertebrate species.</a> Cereb Cortex. 19 (5), 1028-1041 (2009).</li>
<li>Palazzo, O., La Rosa, C., Piumatti, M., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+large+brains+of+long-living+mammals+prefer+non-newly+generated%2C+immature+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Do large brains of long-living mammals prefer non-newly generated, immature neurons.</a> Neural Regen Res. 13 (4), 633-634 (2018).</li>
<li>La Rosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+variation+in+cortical+layer+II+immature+neuron+reservoir+of+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic variation in cortical layer II immature neuron reservoir of mammals.</a> Elife. 9, e55456(2020).</li>
<li>Sherwood, C. C., Gómez-Robles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+plasticity+and+human+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anthropol%22%5BJournal%5D)">Brain plasticity and human evolution.</a> Annu Rev Anthropol. 46, 399-419 (2017).</li>
<li>Piumatti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-newly+generated%2C+%26%2334%3Bimmature%26%2334%3B+neurons+in+the+sheep+brain+are+not+restricted+to+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-newly generated, &#34;immature&#34; neurons in the sheep brain are not restricted to cerebral cortex.</a> J Neurosci. 38 (4), 826-842 (2018).</li>
<li>Pattaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+variation+of+layer+II+cortical+immature+neurons+in+dog+and+horse+confirms+covariance+with+brain+size+and+neocortical+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic variation of layer II cortical immature neurons in dog and horse confirms covariance with brain size and neocortical surface.</a> Brain Struct Funct. 230 (6), 115(2025).</li>
<li>Ghibaudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistency+and+variation+in+doublecortin+and+Ki67+antigen+detection+in+the+brain+tissue+of+different+mammals%2C+including+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Consistency and variation in doublecortin and Ki67 antigen detection in the brain tissue of different mammals, including humans.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2514(2023).</li>
<li>Ben Abdallah, N. M., Slomianka, L., Vyssotski, A. L., Lipp, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+age-related+changes+in+adult+hippocampal+neurogenesis+in+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Early age-related changes in adult hippocampal neurogenesis in C57 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 151-161 (2010).</li>
<li>Ghibaudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+layer+II+immature+neurons+of+the+murine+piriform+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in layer II immature neurons of the murine piriform cortex.</a> Front Cell Neurosci. 17, 1205173(2023).</li>
<li>Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+transformations+of+neurodevelopmental+sequences+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species.</a> J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).</li>
<li>Charvet, C. J., de Sousa, A. A., Vassilopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+time%3A+challenges%2C+progress%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Translating time: challenges, progress, and future directions.</a> Brain Res Bull. 221, 111212(2025).</li>
<li>Bartges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAHA+canine+life+stage+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Anim+Hosp+Assoc%22%5BJournal%5D)">AAHA canine life stage guidelines.</a> J Am Anim Hosp Assoc. 48, 1-11 (2012).</li>
<li>Ghibaudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecies+characterization+of+immature+neurons+in+the+mammalian+amygdala+reveals+their+expansion+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multispecies characterization of immature neurons in the mammalian amygdala reveals their expansion in primates.</a> PLoS Biol. 23 (8), e3003322(2025).</li>
<li>Ghibaudi, M., Boda, E., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+humans%3A+a+need+for+comparable+results+in+mammalian+neuroplasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">From mice to humans: a need for comparable results in mammalian neuroplasticity.</a> Neural Regen Res. 20 (2), 464-466 (2025).</li>
<li>Smulders, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+brain+evolution+for+the+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">The relevance of brain evolution for the biomedical sciences.</a> Biol Lett. 5, 138-140 (2009).</li>
<li>Keck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+theory+and+experiment+in+%28statistical%29+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bridging theory and experiment in (statistical) learning.</a> Curr Opin Neurobiol. 94, 103106(2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda dostarcza porównywalnych danych ilościowych, gdy uwzględnimy różnorodne gatunki znacznie różniące się rozmiarami mózgu i neuroanatomią. Może być używany do oceny spójności populacji komórek w całym mózgu różnorodnych ssaków, a także do śledzenia ich rozwoju u pojedynczego gatunku na kolejnych etapach, od okresu poporodowego po starzenie. Zaczyna się od założenia, że zaangażowanych będzie stosunkowo duża liczba mózgów (całych półkul) i gatunków, przetwarzanych przez to samo laboratorium według standar...

Badania neurobiologiczne w dużej mierze wykorzystują mieszane myszy i szczury do przenoszenia wyników na ludzi. Pomimo wielu podobieństw molekularnych, komórkowych, a nawet anatomicznych, istnieją również istotne różnice międzygatunkowe, które mogą mylić interpretację danych przedklinicznych 1,2. Chociaż badania porównawcze są potrzebne, utrudniają je trudności techniczne i praktyczne, gdy w grze wchodzą duże mózgi (np. od średniej 0,5 g u myszy do 1300 g u ludzi; Rysunek 1A). Co więcej, heterogeniczne podejścia eksperymentalne stosowane przez różne laboratoria mogą ograniczać porównania wyników, zwłaszcza analiz ilościowych, co czasem wywołuje kontrowersje. To jest przypadek strukturalnej plastyczności mózgu, ze szczególnym uwzględnieniem procesówneurogennych 3,4,5, tematu interesującego dla zrozumienia neuroplastyczności rozwojowej i naprawy mózgu 6,7.
Najnowsze odkrycia w dziedzinie plastyczności mózgu silnie sugerują, że podczas ewolucji pojawiły się istotne różnice w występowaniu, tempie i anatomicznym położeniu różnych typów procesów neurogennych8. Przykładem jest widoczny spadek neurogenezy sterowanej przez komórki macierzyste występującej u dorosłych ssaków o dużym mózgu w porównaniu do gryzoni laboratoryjnych 5,9,10, prawdopodobnie związanych z różnym rozszerzaniem obszarów i funkcji mózgu jako adaptacja do presji ekologicznej 7,8, a także z różnymi cyklami neurorozwojowymi11,12. Tempo neurogenezy wydaje się znacząco różnić między myszy a ludźmi, co rodzi kwestię tłumaczenia13.
Z drugiej strony, przypuszcza się, że nowy rodzaj "neurogenezy bez podziału" reprezentowany przez neurony zablokowane w zatrzymanym dojrzewaniu (tzw. neurony niedojrzałe lub uśpione 14,15,16,17,18,19) ma się przysunąć jako wzrastający od gatunku o małym mózgu do dużego mózgu 20,21. Co ciekawe, niezależna od komórek macierzystych populacja niedojrzałych neuronów znajduje się w korze mózgowej (miejscu poznania wysokiego rzędu u gatunków gyrencefalicznych22,23) i daleko od kanonicznych miejsc neurogennych, które są głównie związane z węchem i nawigacją przestrzenną, które zachowują duże znaczenie w gatunkach lissencefalicznych 7,8. Te różnice między strukturami mózgu i gatunkami ssaków wykraczają poza zwykłe porównanie, ponieważ mogą mieć znaczenie w tłumaczeniu, zmieniając potencjał plastyczności u myszy i ludzi. Z tych powodów kluczowe jest ocenenie w "porównywalny sposób", w jakim stopniu różnice stanowią zmienność filogenetyczną wśród bardzo różnych ssaków, ze szczególnym uwzględnieniem gryzoni laboratoryjnych i naczelnych.
Opisano niedawno podejście do badania zmienności międzygatunkowej populacji neuronów warstwy II korowych niedojrzałych (cIN) u ssaków znacznie różniących się rozmiarem mózgu, gyrencefalią i niszą społecznoekologiczną 22,24,25. Metoda ta opiera się na trzech zasadach: i) rozważaniu kilku (różnorodnych) gatunków ssaków przetwarzanych równolegle przy użyciu tych samych procedur; ii) minimalizować zmienne, których nie da się w pełni ustandaryzować w bardzo różnych mózgach (procedura fiksacji, interwał pośmiertny, wiek) oraz uwzględnienie specyficzności gatunkowej przeciwciał dla immunocytochemii poprzez wykorzystanie szeroko wspólnych cech badanych populacji komórkowych jako wewnętrznych pozytywnych kontroli; oraz iii) ustalenie odpowiadających struktur anatomicznych jako punktów odniesienia do liczenia komórek na odpowiadających poziomach mózgowych różnych gatunków (Rysunek 1B i Rysunek 2). Dane uzyskane (np. gęstości komórek) poprzez liczenie komórek zidentyfikowanych z dobrze ugruntowanym markerem podwójnej kortyny (DCX 15,17,26) mogą być mapowane na drzewa filogenetyczne, aby ujawnić wzorce ewolucyjne i analizować pod kątem kowariancji przy różnych parametrach, takich jak wielkość mózgu, gyrencefalia i powierzchnia kory.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69446/69446fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Przetwarzanie bardzo różnych mózgów ssaków w celu oceny rozkładu i ilości cin w płaszczu korowym. (A) Ssaki należące do różnych gatunków i rzędów charakteryzują się bardzo różnymi rozmiarami mózgów oraz stopniem gyrencefalii i ekspansji korowej. Ikony mózgu odtworzone na licencji BioRender. (B) Reprezentatywne przekroje koronne z niebieskim barwieniem toluidynowym wycięte z mózgów o bardzo różnych rozmiarach i o wydłużeniu płaszcza korowego. Histologicznie barwione sekcje seryjne (nacięcie kriostatowe, koronowe, o grubości 40 μm) służą do identyfikacji głównych struktur neuroanatomicznych u każdego gatunku zwierzęcego (patrz Rysunek 3); Zwróć uwagę na niezwykłe różnice w rozmiarze mózgu i obwodzie korowym. Ikony zwierząt w panelu A zostały odtworzone za zgodą La Rosy i in.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69446/69446fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Wreszcie, ponieważ wszystkie procesy plastyczne zazwyczaj ulegają stopniowemu redukcji wraz ze wzrostem wieku27,28 lat, kolejnym problemem w porównawczej neuroplastyczności jest ocena różnych biegów czasowych takiej redukcji, które mogą być powiązane z różnymi przebiegami procesów neurorozwojowych u ssaków 12,29,30. W rzeczywistości istnienie gatunków szybko dojrzewających (myszy) i powoli dojrzewających (naczelnych) jest kolejnym powodem, dla którego najpopularniejszy system modelowy, mysz laboratoryjna, jest ograniczony w rozwiązywaniu wyzwań w naukach biomedycznych. Opisana tutaj metoda może być również przydatna do uwzględnienia populacji komórek w różnym wieku w całym okresie życia każdego gatunku, a następnie porównania powstałych trendów między gatunkami. Stwierdzono zmienność filogenetyczną gęstości cIN oraz różnice w ich trwałości na przestrzeni wieku, pomiędzy ssakami o małym mózgu a dużym mózgiem22,28.

<table><tbody><tr><td>10% formalności</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320404</td><td>Isopentane</td></tr><tr><td>3,3&prime;-hydrat tetrahydrochlorku diaminobenzydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Montaż DPX do histologii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 06522</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Killik - kompleks O.C.T.</td><td>Biooptika</td><td>&nbsp; 05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Mesquite</td><td>Projekt Mesquite</td><td>Mesquite wersja 3.81 (wersja 955)</td><td></td></tr><tr><td>Neo-mount</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09016</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem (PB)</td><td>na</td><td>na</td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>na</td><td>na</td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Riedel-de Haen</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>Dibazowy dihydrat fosforanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71645</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu monozasadowy dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite zestaw ABC-HRP Peroksydaza (standardowa)</td><td>Laboratoria Vector</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Xylol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247642</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

A Comparative Approach for Quantitative Cell Counting Studies in Widely Different Mammalian Brains

Większość badań neurobiologicznych prowadzona jest na gryzoniach laboratoryjnych. Pomimo wielu podobieństw między mózgami ssaków, istnieją także istotne różnice, które mogą być mylące w tłumaczeniu. Stwierdzono wyraźne różnice międzygatunkowe w plastyczności mózgu, szczególnie w neurogenezie. Różne procesy neurogenne mogą być powszechne ze względu na ewolucyjne kompromisy, wykazując zmienność między strukturami mózgu i ssakami oraz przesuwając potencjał plastyczności u gatunków różnicowych, takich jak myszy i ludzie. Porównywanie szerokich gatunków rodzi wiele kwestii: badania porównawcze napotykają trudności techniczne, gdy w grę wchodzą duże mózgi; Stosowanie heterogenicznych podejść eksperymentalnych przez różne laboratoria może ograniczać porównania wyników; Heterogeniczność może być powiązana z różnymi biegami czasowymi procesów rozwojowych neurologicznych u różnych ssaków, co dodaje zmienne do porównania.
Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowano podejście do badania zmienności międzygatunkowej populacji neuronów warstwy II korowych, niedojrzałych u ssaków znacznie różniących się rozmiarem mózgu, gyrencefalią, niszą społecznoekologiczną i wiekiem. Pomimo pewnych zmiennych, których nie da się w pełni ustandaryzować, proponuje się metodę łączącą zmniejszoną heterogeniczność w zbieraniu mózgów oraz ustanowienie wspólnych struktur anatomicznych jako punktów odniesienia do liczenia komórek na odpowiadających poziomach mózgu. Uzyskane dane (np. gęstość komórek) można mapować na drzewa filogenetyczne, aby ujawnić wzorce ewolucyjne i analizować pod kątem kowariancji z cechami neuroantycznymi (np. rozmiar mózgu, powierzchnia kory). To podejście wykazało niezwykłą zmienność liczby neuronów korowych, niedojrzałych pomiędzy grupami filogenetycznymi oraz odkrytą kowariancję z rozmiarem mózgu. Metoda ta może być również wykorzystywana do ilościowego określania różnic w różnych etapach rozwojowych u tego samego gatunku oraz rozszerzać ją na inne różnorodne ssaki i procesy biologiczne, aby mapować porównywalne wyniki umożliwiające dokładniejsze ilościowe określenie różnych populacji komórek w mózgach dorosłych w celu wspierania plastyczności.

Komórki DCX+ w korze mózgowej wszystkich badanych gatunków konsekwentnie wykazują szereg cech wskazujących na istnienie dobrze zachowanej populacji neuronów niezróżnicowanych (Rysunek 4A). W skrócie: (i) są topograficznie ułożone tak, aby tworzyć monowarstwę wzdłuż warstwy korowej II; (ii) wykazują morfologiczne podtypy opisane dla różnych stadiów dojrzewania u neuronów niedojrzałych, (a) z dużą częstością występowania małych, unipolarnych/dwubiegunowych komórek oraz niewielkim udziałem komó...

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Most neurobiological studies are conducted on laboratory rodents. Despite many similarities across mammalian brains, important differences also exist, ...

Odkryto, że plastyczność strukturalna mózgu może być wyraźnie różna u poszczególnych ssaków. W związku z tym konieczne jest ujawnienie systematycznej analizy ilościowej. Nasza systematyczna analiza bardzo różnych mózgów może dać porównywalne wyniki, które można umieścić w kontekście filogenetycznym.Na początek weź płytkę z 12-dołkową z lodówki o temperaturze 20 stopni Celsjusza zawierającą swobodnie unoszące się fragmenty mózgu i wyjmij kilka plasterków do szalki Petriego wypełnionej roztworem PBS. Wybierz sekcje i umieść je na slajdzie. Po histologicznym barwieniu przekrojów określ poziomy mózgu na podstawie konkretnych cech neuroanatomicznych.Zdefiniuj go na poziomy od 1 do 4, używając tej samej liczby sekcji szeregowych o grubości 40 mikrometrów, a następnie wybierz trzy równomiernie rozmieszczone przekroje koronne z każdego poziomu mózgu i wykonaj barwienie immunohistochemiczne. Otwórz oprogramowanie Neurolucida na stanowisku roboczym i umieść preparat pod mikroskopem, korzystając z wybranego celu do liczenia komórek. Przy niskim powiększeniu konturuj warstwę korową 2 za pomocą narzędzia do wolnej ręki do rysowania linii konturowych w menu Trace w programie.Przerysuj obwód, aby uzyskać długość warstwy korowej 2, obejmującej zarówno paleokorteks, jak i neokorteks. Wybierz preferowane symbole do liczenia komórek z paska narzędzi Znaczniki. Liczba komórek typu 1 identyfikowanych przez małą somatę o kształcie dwubiegunowym i średnicy somy od 3 do 9 mikrometrów w każdym obszarze zainteresowania.Liczba komórek typu 2 identyfikowanych przez większą somatę o złożonej dendrytycznej arboryzacji i średnicy somy od 9 do 18 mikrometrów. Teraz zbierz dane do analizy filogenetycznej z paleokorteksu, neokorteksu i kory mózgowej, uzyskane przez połączenie danych z paleokorteksu i neokorteksu. Zbierz obwód warstwy korowej 2, mierzony w milimetrach i widoczny w pasku narzędzi pomiarów konturów, do pliku arkusza kalkulacyjnego.W tym samym arkuszu kalkulacyjnym zbierz liczbę komórek typu 1 i typu 2 widocznych na pasku narzędzi znaczników. Oblicz i zapisz łączną liczbę komórek, dodając komórki typu 1 i 2 dla każdego mózgu, regionu i poziomu mózgu, używając trzech sekcji na poziom, co daje łącznie 12 sekcji na próbkę. Wykorzystaj zebrane wartości do obliczenia liniowej gęstości komórek dla każdego przekroju w każdym regionie, dzieląc liczbę komórek przez obwód w milimetrach.Oblicz procent komórek typu 1 i typu 2, dzieląc liczbę komórek typu 1 lub typu 2 przez całkowitą liczbę komórek i mnożąc przez 100. Następnie oblicz procent komórek typu 1 i typu 2 w każdym okazie według wzoru. Uzyskaj średnią wartość tych procentów spośród czterech rozważanych okazów na gatunek, używając funkcji średniej w arkuszu kalkulacyjnym.Użyj liniowej gęstości komórek do analizy filogenetycznych oraz wykorzystaj łączną liczbę komórek zliczonych w każdym przekroju koronalnym do oszacowania liczby niedojrzałych neuronów na półkulę. Oblicz wartość mediany gęstości dla 12 rozważanych sekcji na próbkę, używając funkcji mediany w arkuszu kalkulacyjnym. Użyj mediany jako miary centralnej, ponieważ próba na grupę jest stosunkowo mała, a niektóre grupy wykazują rozkłady asymetryczne.Użyj narzędzia do konturowania wolnoręcznie w oprogramowaniu Neurolucida, aby narysować linię przez średnicę soma prostopadle do osi głównej. Zmierz co najmniej 100 losowo wybranych komórek DCX pozytywnych obu typów w każdym gatunku, używając 25 komórek na próbkę w każdej części mózgu, aby uzyskać zakres średnic soma dla komórek typu 1 i typu 2. Teraz stwórz listę analizowanych gatunków w notatniku, używając ich nazw naukowych.Prześlij listę do timetree na stronie internetowej. org i eksport jako plik NWK. W oprogramowaniu Mesquite Project prześciągnij plik NWK, zintegruj dane i zapisz powstały plik jako plik PDF.Na koniec, w wcześniej utworzonej kartce danych, dodaj kolumnę zawierającą rozmiar mózgu dla każdego gatunku. Oblicz naturalny logarytm dodatniej gęstości komórek DCX oraz naturalny logarytm wielkości mózgu. Wykonaj analizę statystyczną wybranego oprogramowania statystycznego i pobierz uzyskane pliki.Wprowadź reszty do nowej kolumny w kartce katalogowej, aby można było stworzyć wykres reszt. Komórki DCX pozytywne w korze mózgowej wszystkich badanych gatunków konsekwentnie wykazywały ułożenie topograficzne tworzące monowarstwę wzdłuż warstwy drugiej kory, obejmujące głównie małe, unipolarne lub dwubiegunowe komórki oraz niewielką część dużych komórek złożonych. Komórki współekspresywały PSAN-NCAM i DCX, ale nie wykazywały ekspresji Ki67.Zawierała podpopulację złożonych komórek ekspresyjnie NeuN. Liniowa gęstość neuronów niedojrzałych kory znacznie różniła się w zależności od gatunku. Analizy porównawcze filogenetyczne wykazały, że grupa Laurasiatheria miała większą gęstość neuronów korowych, niedojrzałych niż euarchontogliry.Zaobserwowano silną kowariancję między gęstością neuronów w korze niedojrzałej a objętością mózgu. Oraz pomiędzy niedojrzałą gęstością neuronów korowej a obwodem drugiej warstwy neokortykalnej. Nasze wyniki mogą ujawnić ewolucyjne kompromisy między różnymi typami plastyczności, a także między różnymi obszarami mózgu.

a-comparative-approach-for-quantitative-cell-counting-studies-widely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Anatomiczna organizacja mózgu naczelnych może dostarczyć istotnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi. Obiektywna stereologia jest metodą dokładnego i wydajnego szacowania całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze referencyjnym1.

Wiedza o tym, co liczy się w analizie: nieobciążona stereologia w mózgu naczelnych zwierząt niebędących ludźmi

Podejście oparte na porównaniu gatunków pozwala neurobiologom behawioralnym badać różne czynniki neurobiologiczne związane z określonymi zachowaniami, uznawanymi za charakterystyczne dla danego modelu zwierzęcego. Wykorzystując naturalnie występujące różnice w zachowaniu między blisko spokrewnionymi gatunkami, technika ta nie wymaga stosowania inwazyjnych metod w celu manipulacji ekspresją danego zachowania.

Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

Źródło: Olesen, M. V., et al. Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej. J. Vis. exp. (2017).  Film demonstruje technikę ilościowego określania nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej. Wycinki tkanki hipokampa zawierające neurony znakowane bromodeoksyurydyną (BrdU) wybarwiono za pomocą immunohistochemii, a następnie określono ilościowo na całej grubości tkanki przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego.

Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Tutaj prezentujemy metodę stereologiczną, frakcjonator optyczny, używany do ilościowego określenia powstawania nowych neuronów i ich przeżycia w hipokampie szczura po stymulacji elektrowstrząsowej. Przy prawidłowym wdrożeniu, czułość i wydajność metod stereologicznych zapewnia dokładne oszacowania ze stałą i z góry określoną precyzją.

Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Poznaj metody ilościowego liczenia komórek nerwowych w mózgach ssaków. Badanie porównawcze ujawnia różnice międzygatunkowe w populacjach neuronów gryzoni i ludzi, pomagając zrozumieć ewolucyjne wzorce rozwoju mózgu.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Przeglądaj więcej filmów