Name: Określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę ddPCR do ilościowego oznaczania biomasy bakterii i grzybów w glebie poprzez amplifikację genów 16S i 18S rRNA. Protokół umożliwia precyzyjną ocenę zdrowia gleby i dynamiki mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Ninie Lindstrom-Friggens, dr Liz Cressey, dr Joannie Zaragoza-Castells, Angeli Elliott, dr Kees Jan van Groenigen oraz prof. Iainowi Hartleyowi. Chcielibyśmy również podziękować właścicielom gruntów za udostępnienie gleb do tego badania. Badania te zostały sfinansowane przez Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). Zbiory danych wygenerowane podczas bieżącego badania są dostępne w repozytorium NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

Ogólny schemat tych protokołów przedstawiono na Rysunku 1. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie próbek gleby 
<ol>
	<li>Zbieraj próbki złożonej warstwy gleby (0–20 cm) z pięciu globalnych lokalizacji, z trzema próbkami z losowo wybranych punktów w obszarze 25 m od każdej lokalizacji. UWAGA: Wszystkie próbki zostały zebrane z systemów rolniczych reprezentujących regionalne użytkowanie ziemi, w których się znajdowały. Tekstura gleby była charakteryzowana za pomocą dyfrakcji laserowej, mierzonej za pomocą laserowego analizatora wielkości cząstek (Tabela 1). Próbki były transportowane w temperaturze otoczenia i przechowywane w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA 
UWAGA: Ekstrakcji DNA wykonuj za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA w glebie, zgodnie z instrukcjami producenta. Temperatura pokojowa na wszystkich etapach wynosiła 20 °C.
<ol>
	<li>Krótko obróć tubkę do ubijania koralików o pojemności 2 mL, aby upewnić się, że kulki osiadają na dnie. Dodaj 100 mg gleby i 800 μL roztworu CD1. Krótko zmieszać wir.</li>
	<li>Próbki dokładnie ujednolicaj za pomocą homogenizatora do granulacji, z próbkami lizowanymi przez 40 sekund na odległości 6 m s−1.</li>
	<li>Wirówka probówki do ubijania kulek do mechanicznej lizy komórek w 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przelej supernatant do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL. UWAGA: Supernatant może nadal zawierać cząstki gleby.</li>
	<li>Dodaj 200 μL roztworu CD2 i zacznij wirować przez 5 sekund.</li>
	<li>Wirówka w 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przelej do 700 μL supernatantu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL, unikając pelletu. Granulki powinny być widoczne.</li>
	<li>Dodaj 600 μL roztworu CD3 i zacznij wirować przez 5 sekund.</li>
	<li>Załaduj 650 μL lizatu na kolumnę spinową i wiruj w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzuć przepływ i powtórz krok 2.9, aby upewnić się, że cały lizat przeszedł przez kolumnę spinową.</li>
	<li>Włóż kolumnę spinową do czystej probówki o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Dodaj 500 μL roztworu EA do kolumny spinowej. Wirówka w 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń przepływ i umieść kolumnę spinową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Dodaj 500 μL roztworu C5 do kolumny spinowej. Wirówka w 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń przepływ i umieść kolumnę spinową w nowej probówce zbiorczej 2 mL.</li>
	<li>Wiruj w temperaturze do 16 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Włóż kolumnę spinową do nowej rurki elucijnej o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Do środka białej błony filtracyjnej należy dodać 50–100 μL roztworu C6.</li>
	<li>Wirówka w 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Usuń kolumnę spinową i zachowaj elutę w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Ilościowa identyfikacja oczyszczonego DNA 
UWAGA: Oczyszczone DNA zostało ilościowo zdefiniowane za pomocą fluorometru oraz zestawu do badania dwuniciowego (dsDNA) Broad Range (BR) zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy z proporcją buforu do odczynnika 199:1.</li>
	<li>Dodaj 10 μL każdego standardu DNA do 190 μL roztworu roboczego.</li>
	<li>Dodaj 1–20 μL oczyszczonego DNA do 180–199 μL roztworu roboczego. Ostateczna objętość powinna wynosić 200 μL. Próbki wiru i inkubacji standardowej oraz DNA w temperaturze otoczenia przez 2 minuty.</li>
	<li>Przeanalizuj standardy przed pobraniem próbek DNA na fluorometrze, korzystając z instrukcji na ekranie.</li>
</ol>
4. Wybór podkładu 
<ol>
	<li>Do analizy mikroorganizmów glebowych należy wybrać konkretne podkłady na podstawie odpowiednich źródeł. Dla bakterii użyto primerów rRNA 16S25, 27, a dla grzybów 16S primerów rRNA.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację za pomocą mieszanki głównej PCR (qPCR) opartej na barwniku wiążącym DNA oraz cyklera termicznego. Sekwencje pierwsze są przedstawione w Tabeli 2.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja mikrobiologiczna za pomocą ddPCR 
<ol>
	<li>Rozmrażanie i wirowanie – wszystkie odczynniki na lodzie.</li>
	<li>Ustaw reakcję ddPCR następująco: 0,1 μL (10 μM) do przodu i 0,1 μL (10 μM) odwrotnie 16S lub 18S zapalnika, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng szablon DNA X μL, używając wody wolnej od nukleazy (NFW), aby dostosować końcową objętość reakcji do 22 μL. Stwórz negatywną kontrolę, dodając NFW zamiast szablonu dla każdej kolumny.</li>
	<li>Włóż DG8 do uchwytu na nabój.</li>
	<li>Włóż łącznie 20 μL mieszanki reakcyjnej do dołków próbek w wkładce.</li>
	<li>Dodaj 70 μL oleju generującego krople do Evagreen do wkładu dobrze oznaczonego jako 'olej'.</li>
	<li>Włóż wkład do generatora kropel i przykryj wkład uszczelką.</li>
	<li>Przenieś 40 μL wygenerowanych kropelek na płytę z 96 dołkami (półspódniczą) do amplifikacji PCR.</li>
	<li>Uszczelnij płytę z 96 dołkami za pomocą uszczelniacza płytowego (temperatura 180 °C przez 5 sekund).</li>
	<li>Stosuj następujące warunki cykliczne z podgrzewaną pokrywą ustawioną na 105 °C. UWAGA: (a) Bakterie: 98 °C przez 5 minut, 40 cykli; 94 °C przez 30 s, 61°C przez 60 s, 5 minut przy 4 °C, 10 min przy 98 °C. (b) Grzyby: 95 °C przez 5 minut, 40 cykli; 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 30 s, 5 minut przy 4 °C i 5 minut w 90 °C.</li>
	<li>Przenieś płytkę z 96 dołkami do czytnika płyt.</li>
	<li>Oceń stężenie kopii w każdej studni za pomocą QuantaSoft w wersji 2.1. Dostosuj próg amplitudy, aby oddzielić krople ujemne i dodatnie.</li>
	<li>Oblicz liczbę kopii genów na ng DNA w reakcji, mnożąc kopie/μL przez końcową objętość reakcji (20 μL) i dzieląc przez całkowity wkład DNA do reakcji w następujący sposób: (kopiuje μL-1 x objętość reakcji) / Całkowity wkład DNA do reakcji.</li>
	<li>Oblicz całkowitą liczbę kopii genów na ng wyodrębnionego DNA, mnożąc kopie genów na ng przez całkowitą wyodrębnioną DNA (ng) w następujący sposób: (kopie genów na ng x całkowita wyodrębniona DNA).</li>
	<li>Obliczamy kopie genów na gram, dzieląc łączną liczbę kopii genów na ng wyodrębnionego DNA przez ilość suchej masy gleby przetworzonej podczas ekstrakcji (g), w następujący sposób: kopie genów na gram = (łączna liczba kopii genów na ng wyodrębnionego DNA / gram suchej masy gleby (gdw) przetworzonej podczas ekstrakcji gleby).</li>
	<li>Oblicz liczbę komórek na gdw, konwertując kopie genów za pomocą średniej liczby kopii genu (GCN) zgodnie z równaniem: Liczba komórek = kopie genów na gram / Średnia liczba kopii genu komórki-1).</li>
	<li>Przelicz liczbę komórek na mikrobiologiczną biomasę węgla (MBC) za pomocą następującego równania: MBC dla 16S (mg, C, g-1 gleby) = komórki gdw-1 × (100 fg komórki-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28 MBC dla 18S (mg, C, g-1 gleba) = komórki gdw-1 × (6 fg komórki-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29 Cały proces jest wyjaśniony na Rysunku 2. UWAGA: Średnia kopia genu rRNA 16S (średnia ± SD) dla 46 typów bakteryjnych20 została obliczona i użyta jako współczynnik korekcyjny dla bakterii, z końcową wartością 2,48. Natomiast dla grzybów liczba kopii genu została obliczona z współczynnikiem korekcyjnym 113 według Lofgrena i in.17. Mikrobiologiczna biomasa węgla (MBC) została oszacowana na podstawie liczby komórek pochodzących z ddPCR, zakładając zawartość węgla komórkową 100 fg na komórkębakteryjną 28 oraz 6 pg na komórkę grzyba29.</li>
</ol>
6. Analiza molekularna gleby na podstawie sekwencjonowania całego genomu 
<ol>
	<li>Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania zgodnie z protokołem Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, korzystając z Natywnego zestawu kodowania kreskowego 24 V14 (SQK-NBD114.24) (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że używasz jednego kodu kreskowego dołączonego do zestawu dla każdej próbki.</li>
	<li>Sekwencjonuj przygotowaną bibliotekę za pomocą komórki przepływowej Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.</li>
	<li>Wykonaj wywołanie bazowe w MinKnow podczas sekwencjonowania, wybierając model super accuracy (SUP) i wybierając przycinanie kodów kreskowych "ON". Wersja Dorado: 0.7.2+9ac85c6.</li>
	<li>Wykonaj klasyfikację taksonomiczną odczytów sekwencji DNA względem użycia klasyfikatora taksonomicznego Kraken2 (v2.1.3)30 w porównaniu z bazą danych NCBI o nieredundantnych białkach (nr), pewność 0,05.</li>
	<li>Sprawdź pliki raportów Kraken2 pod kątem klasyfikacji odczytu bakterii i grzybów.</li>
	<li>Oblicz względną liczebność bakterii i grzybów dla każdej próbki.</li>
</ol>
7. Szacowanie biomasy węglowej gleby przez fumigację chloroformową
<ol>
	<li>Waż świeże próbki gleby w wcześniej zważonych blachach i susz w piecu w temperaturze 105 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Obliczaj wilgotność gleby, odejmując masę suchej gleby od masy świeżej i dzieląc różnicę przez masę świeżej. Zawartość wilgoci (%) = ((W mokre – Wsuche)/ Wsuche) × 100</li>
	<li>Użyj wilgotności do obliczenia suchej materii gleby. Sucha materia (%) = 100 – Zawartość wilgoci (%)</li>
	<li>Dodaj 5 g gleby do dwóch indywidualnych rurek wirówek po 50 mL, oznaczonych jako niefumigowane i fumigowane.</li>
	<li>Do niefumigowanej oznaczonej rurki dodaj łącznie 25 mL 0,5 M K2SO4 .</li>
	<li>Potrząsaj niefumigowanymi próbkami w orbitalnym shakerze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 2 mL chloroformu wolnego od etanolu bezpośrednio do gleby w rurkach oznaczonych jako fumigowany. Zamknij i zabezpiecz pokrywki parafilmem i inkubuj w ciemności przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj próbkę niefumigowaną przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przelej supernatant z niefumigowanej próbki, przecedź przez filtr celulozowy o pojemności 0,45 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zdejmij pokrywki z fumigowanych próbek i odwietrzyj w okapie przez 2 godziny, następnie wykonaj ekstrakcję K2SO4 (powtarzając kroki 5-9) i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zmierz stężenie węgla w ekstraktie zarówno dla próbek "fumigowanych", jak i "niefumigowanych", używając analizatora całkowitego węgla organicznego.</li>
	<li>Oblicz biomasę mikroorganizmów węglową (MBC) za pomocą następującego równania: MBC = (Fumigowana zawartość C - Niefumigowana zawartość C)/0,45. Normalizuj dla grama suchej warstwy gleby.</li>
</ol>
8. Szacowanie zawartości materii organicznej w glebie
<ol>
	<li>Susz porcelanowy tygiel w piecu konwekcyjnym w temperaturze 105 °C przez 30 minut, a następnie waż go po ostygnięciu do 20 °C (WC).</li>
	<li>Włóż do 2 g ziemi do wysuszonego tygla i zważ ponownie.</li>
	<li>Próbki gleby suszyć w napełnionym tyglu w piecu konwekcyjnym w temperaturze 105 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Włóż do szczelnego osuszacza do ostygnięcia i ponownie zważ (WS).</li>
	<li>Nagrzej piec muffle do 550 °C, a następnie umieść tygiel z glebą w piecu na 4 godziny.</li>
	<li>Wyjmij tygiel z ziemią z pieca i umieść go w suszarce, aby ostygła.</li>
	<li>Waż tygiel razem z ziemią (WA).</li>
	<li>Zmierz procent SOM, obliczając różnicę suchej masy gleby przed i po inkubacji w temperaturze 550 °C. SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –WC)] × 100</li>
</ol>

<ol><li>Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertical+distribution+of+soil+organic+carbon+and+its+relation+to+climate+and+vegetation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Appl%22%5BJournal%5D)">The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation.</a> Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).</li>
<li>Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+carbon+debt+of+12%2C000+years+of+human+land+use%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Soil carbon debt of 12,000 years of human land use.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).</li>
<li>He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+invasion+increases+soil+microbial+biomass+carbon%3A+meta-analysis+and+empirical+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Glob+Change+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests.</a> Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).</li>
<li>de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+fungal-bacterial+co-occurrences+to+soil+ecosystem+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function.</a> Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddPCR+surpasses+classical+qPCR+technology+in+quantitating+bacteria+and+fungi+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment.</a> Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).</li>
<li>Djemiel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogeographical+patterns+of+the+soil+fungal%3Abacterial+ratio+across+France%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France.</a> mSphere. 8 (5), e0036523(2023).</li>
<li>Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal-to-bacterial+ratios+in+soils+investigated+for+enhanced+C+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration.</a> Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).</li>
<li>Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biomass+measurements+in+forest+soils%3A+the+use+of+the+chloroform+fumigation-incubation+method+in+strongly+acid+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils.</a> Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).</li>
<li>Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+the+structure+of+soil+microbial+communities+in+limed+forests+as+revealed+by+phospholipid+fatty+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis.</a> Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).</li>
<li>Cao, Z., Li, D., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fungal+to+bacterial+ratio+in+soil+food+webs%2C+and+its+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ecol+Sin%22%5BJournal%5D)">The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement.</a> Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).</li>
<li>Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assessment+of+bacterial+abundance+in+soils%2C+sediments+and+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge.</a> Front Microbiol. 7, 903(2016).</li>
<li>Joergensen, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide%3A+Estimates+of+microbial+biomass+and+microbial+gene+abundance+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Fertil+Soils%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil.</a> Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).</li>
<li>Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+microbes+can%2C+and+cannot%2C+be+used+to+assess+soil+health%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">How microbes can, and cannot, be used to assess soil health.</a> Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).</li>
<li>Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+assessing+fungi-to-bacteria+ratio+of+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Fertil+Soils%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil.</a> Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).</li>
<li>De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+amplicon+targets+for+sequencing-based+studies+of+fungal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).</li>
<li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FungiQuant%3A+A+broad-coverage+fungal+quantitative+real-time+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay.</a> BMC Microbiol. 12, 255(2012).</li>
<li>Lofgren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-based+estimates+of+fungal+rDNA+copy+number+variation+across+phylogenetic+scales+and+ecological+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles.</a> Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).</li>
<li>Angly, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W.+CopyRighter%3A+A+rapid+tool+for+improving+the+accuracy+of+microbial+community+profiles+through+lineage-specific+gene+copy+number+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction.</a> Microbiome. 2 (1), 11(2014).</li>
<li>Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+16S+gene+copy+number+information+improves+estimates+of+microbial+diversity+and+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance.</a> PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).</li>
<li>Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diversity+biased+estimation+caused+by+intragenomic+heterogeneity+and+interspecific+conservation+of+16S+rRNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).</li>
<li>Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+bacterial+and+fungal+communities+and+their+predictive+functionality+during+pulque+fermentation+by+whole-genome+shotgun+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing.</a> Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).</li>
<li>Bahram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+assessment+of+the+global+diversity+and+distribution+of+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi.</a> Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).</li>
<li>Smith, C. J., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+quantitative+PCR+%28Q-PCR%29-based+approaches+in+microbial+ecology%3A+Application+of+Q-PCR+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology.</a> FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+digital+droplet+PCR+approach+for+the+quantification+of+soil+micro-organisms+involved+in+atmospheric+CO2+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation.</a> Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).</li>
<li>Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+fires+do+not+affect+the+abundance+of+soil+fungi+in+a+frequently+burned+pine+savanna%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Ecol%22%5BJournal%5D)">Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna.</a> Fungal Ecol. 42, 100852(2019).</li>
<li>Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+bacterioplankton+in+meromictic+Lake+Saelenvannet%2C+as+determined+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+of+PCR-amplified+gene+fragments+coding+for+16S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA.</a> Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).</li>
<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+unseen+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The unseen majority.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).</li>
<li>Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+content+of+common+airborne+fungal+species+and+fungal+contribution+to+aerosol+organic+carbon+in+a+subtropical+city%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city.</a> Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).</li>
<li>Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+metagenomic+analysis+with+Kraken+2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved metagenomic analysis with Kraken 2.</a> Genome Biol. 20 (1), 257(2019).</li>
<li>Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+soil+pH+effects+on+fungal+and+bacterial+growth+suggest+functional+redundancy+in+carbon+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).</li>
<li>Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+metagenomics+reveals+interkingdom+association+between+intestinal+bacteria+and+fungi+involving+competition+for+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients.</a> Microbiome. 11 (1), 275(2023).</li>
<li>Větrovský, T., Baldrian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variability+of+the+16S+rRNA+gene+in+bacterial+genomes+and+its+consequences+for+bacterial+community+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses.</a> PLoS One. 8 (2), e57923(2013).</li>
<li>Doyle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+prokaryotes+in+the+microbiome+by+16S+rRNA+qPCR+or+ddPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR.</a> Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).</li>
<li>Frostegård, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+bias+related+to+the+extraction+of+DNA+directly+from+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).</li>
<li>Lee, E., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+in+qPCR-based+gene+quantification+and+their+dependencies+on+soil+properties%2C+inhibitor+presence%2C+and+DNA+extraction+kit+types%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types.</a> RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).</li>
<li>Buell, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+among+methods+of+estimating+microbial+biomass+across+multiple+soil+orders+and+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes.</a> Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).</li>
<li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).</li>
<li>Child, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+environmental+metagenomics+using+Oxford+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing.</a> BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).</li>
<li>Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+methods+for+estimating+microbial+biomass+in+biochar-amended+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils.</a> Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).</li>
<li>Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microbial+biomass+carbon+by+direct+extraction%3A+comparison+with+chloroform+fumigation-extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Soil+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction.</a> Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Mikroorganizmy glebowe są głównymi czynnikami rozkładającymi się w ekosystemach lądowych i odgrywają kluczową rolę w obiegu składników odżywczych oraz jako magazynowanie węgla w glebie. Pomimo znaczenia mikroorganizmów glebowych, dokładne określenie ich absolutnej liczebności za pomocą metod opartych na kopiowaniu genów jest trudne. Wynika to z wielu czynników, takich jak zmienna liczba genów docelowych u różnych gatunków. Badanie to pokazuje, jak biomasę mikroorganizmów glebowych można ilościowo określić za pomocą ddPCR poprzez celowanie w prokarioty i eukarionty z wykorzystaniem odpowiednich regionów kodujących geny rRNA w 16S i 18S. Zaobserwowano najwyższy stosunek F:B w glebie E, gdzie ta próbka miała również najwyższy procent materii organicznej. Drugi najwyższy stosunek F:B zaobserwowano w próbie C, co koreluje z wysoką kwasowością tych gleb. Oczekiwano tego w przypadku próbek C i E, ponieważ wzrost grzybów wzrasta przy niższym pH31. Sekwencjonowanie całego genomu przeprowadzono na tych samych ekstraktach DNA, które były stosowane w metodach ddPCR. Porównano stosunek F:B między WGS a ddPCR. Stosunek F:B obliczony na podstawie danych WGS był niższy dla wszystkich analizowanych próbek w porównaniu do stosunku F:B obliczonego na podstawie danych ddPCR. Jednak ogólny trend stosunku F:B między próbkami był wizualnie porównywalny między obiema metodami. To dało wyższe stosunki F:B na próbkach gleby w porównaniu do sekwencjonowania całego genomu i wykazało większą zmienność stosunku F:B w różnych typach gleb. Niższy stosunek F:B zaobserwowany w danych WGS prawdopodobnie wynika z różnic w rozmiarze genomu między grzybami a bakteriami, a sekwencje grzybowe mogą być niedoreprezentowane bez wzbogacenia32. Co więcej, mimo że gleba A ma najniższą zawartość materii organicznej, nie wykazywała najmniejszej liczby mikrobiologicznych kopii i biomasy węglowej, co podkreśla, że zawartość materii organicznej nie zawsze jest bezpośrednio skorelowana z biomasą mikroorganizmów. Warto zauważyć, że trendy obserwowane między stężeniem DNA pochodzącym (Rysunek 3A) a całkowitą liczbą komórek mikroorganizmów (Rysunek 3D) były wizualnie podobne, co sugeruje, że stężenie DNA jest dobrym wskaźnikiem biomasy mikroorganizmów.
ddPCR umożliwia dokładne ilościowe określenie liczby kopii genów w próbkach gleby, a ta metoda może być stosowana do szacowania całkowitej liczby komórek mikroorganizmów. Jednak istnieją ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Liczba kopii genów rRNA 16S i 18S znacznie różni się wśród taksonów mikroorganizmów23. W rezultacie użycie pojedynczego współczynnika korekcyjnego dla liczby kopii genu może prowadzić do zawyżenia lub zaniżenia liczebności mikroorganizmów w próbce33. To ograniczenie można rozwiązać, uwzględniając wcześniejszą wiedzęo społeczności mikroorganizmów, wykorzystanie danych sekwencjonowania całego genomu oraz stosowanie odpowiednich korekt kopii genów, które reprezentują konkretną mikrobiotę glebową. Chociaż metody molekularne nadal dostarczają oszacowania, a nie dokładnego zliczenia, oferują dokładniejsze przewidywanie liczebności mikroorganizmów. W połączeniu z danymi o składzie społeczności, to podejście pozwala na interpretacje wykraczające poza samą względną obfitość19,34.
Biomasa mikrobiologiczna węgla (MBC), oszacowana za pomocą fumigacji chloroformowej, nie wykazała istotnych różnic między analizowanymi próbkami, choć zaobserwowano wysokie zróżnicowanie MBC w próbkach A–D. Dla porównania, istotne różnice wykryto w całkowitej liczbie komórek mikroorganizmów mierzonych metodą ddPCR, co wskazuje, że to podejście molekularne może zapewniać większą rozdzielczość niż techniki konwencjonalne. Jednak obliczanie biomasy mikroorganizmów węgla na podstawie liczby komórek mikroorganizmów ma swoje ograniczenia. Zmienność rozmiaru komórek może wpływać na przekształcenie liczby komórek w biomasę. Podobnie jak używanie pojedynczego współczynnika konwersji do liczby kopii genu, stosowanie pojedynczego współczynnika konwersji dla zawartości węgla bakterii i grzybów może prowadzić do zawyżenia lub niedoszacowania biomasy mikroorganizmów w węglu.
Co więcej, metody oparte na DNA mogą być szczególnie problematyczne w porównaniu z glebami, które wykazują duże różnice w stopniu dominacji bakterii i grzybów. Zarówno wydajność DNA, jak i GCN mogą być również zależne od wyboru metody ekstrakcji DNA i projektu startera35,36, co utrudnia porównania laboratoryjne37. Ponadto zarówno metody wydajności GCN, jak i DNA mogą być podatne na przeszacowanie z powodu tzw. "reliktowego DNA", czyli DNA u organizmów martwych lub związanych z glinami14,38. Mimo że metody ddPCR wykazały się lepszą precyzją i powtarzalnością, niektóre wady to skomplikowane procesy, wysokie koszty oraz użycie niespecyficznego barwnika DNA przy użyciu chemii Evagreen5. Może to prowadzić do słabych fałszywie pozytywnych wyników, utrudniając rozdzielenie kropelek dodatnich od ujemnych, a niewielka niekorekta progu może wpłynąć na stosunek F:B, gdy kopie genów są niskie14. Aby zwiększyć liczbę próbek przetwarzanych za pomocą tej metody ddPCR, automatyzacja z robotami do obsługi cieczy może być stosowana do ekstrakcji DNA i konfiguracji reakcji39. Dodatkowo nowy system ddPCR umożliwia większe multipleksowanie, generując krople dla 96 próbek jednocześnie.
Ważne jest, aby zauważyć, że wszystkie pomiary biomasy mikroorganizmów są szacunkami i obejmują uogólnione współczynniki konwersji w celu ustalenia liczby37. Dlatego porównania między metodami należy wykonywać ostrożnie, ponieważ nie wiadomo, które są najbardziej dokładne. Mimo to metody fumigacji chloroformowej są szeroko stosowane w ostatnich dekadach, opierając się na parach chloroformowych do fumigacji gleby. Wzbudziło to wiele obaw ze względu na toksyczność dla ludzi i środowiska oraz skuteczność w lizowaniu komórek mikroorganizmów glebowych40. Ponadto fumigacja chloroformów może prowadzić do zawyżenia szacowania MBC pochodzącego ze źródeł nieożywionych, takich jak resztki roślinne41. Wreszcie, metoda ta opiera się również na stosunkowo dużych ilościach gleby w porównaniu z innymi metodami molekularnymi, które wymagają bardzo małych ilości gleby (<500 mg).
Badanie to dostarcza dowodów na to, że metody oparte na ddPCR do pomiaru biomasy mikroorganizmów glebowych na różnych glebach są solidne i nie są wpływane przez różne typy gleb oraz potencjalne inhibitory. Skuteczność tej metody zależy od powstającej próbki DNA, dlatego zapewnienie skutecznego oczyszczania DNA z próbek jest kluczowe. Metoda ta wykazuje obiecujące możliwości wykrywania i ilościowania mikroorganizmów w różnych typach i teksturach gleb, uzupełniając istniejące metody szacowania biomasy mikroorganizmów i umożliwiając cenne przyszłe zastosowania w monitorowaniu zdrowia gleby i skalowalności w zakresie regionalnego lub globalnego nadzoru mikrobiomu.

Gleba jest największą ziemną bazą organicznego węgla, zawierającą więcej węgla niż roślinność i tlen węgla w atmosferzerazem wzięte. 1. W ciągu ostatnich 200 lat z gleb utraciono ponad 133 gigaton (Gt) węgla, a trwające wysiłki na rzecz przywrócenia i utrzymania zasobów węgla w glebie są kluczowe dla globalnego zdrowia gleby2. Biorąc pod uwagę ogromną zdolność magazynowania węgla gleb, precyzyjne określenie głównych źródeł tych zasobów węgla jest fundamentalnie ważne3. Mikroby odgrywają fundamentalną rolę w obiegu składników odżywczych w glebie, a biomasa mikroorganizmów stanowi istotny składnik organicznego węgla glebowego (SOC)3. Grzyby i bakterie są głównymi czynnikami rozkładającymi się w środowiskach glebowych i odgrywają kluczową rolę w biogeochemicznych cyklach tych ekosystemów 4,5. W glebie zdominowanej przez bakterie rozkład materii organicznej i mineralizacja składników odżywczych przebiegają znacznie szybciej niż w glebie zdominowanej przez grzyby5. Stosunek grzybów do bakterii (F:B) jest coraz częściej stosowany jako wskaźnik zdrowia gleby 6,7; dlatego dokładna ocena zarówno grzybów, jak i bakterii jest kluczowa.
Szacunki biomasy mikroorganizmów w glebach często opierają się na zakłócających zabiegach chemicznych, takich jak fumigacja chloroformowa8. Inne podejścia selektywnie celują w aktywną społeczność mikroorganizmów poprzez techniki takie jak oddychanie indukowane przez substrat lub analiza fosfolipidów tłuszczowych (PLFA)9. Analiza PLFA jest szeroko stosowana do oceny składu społeczności mikroorganizmów oraz szacowania stosunku F:B. Jednak istotne różnice wielkości komórek w różnych gatunkach grzybów i bakterii wprowadzają niepewność przy przekształcaniu stężeń PLFA na biomasę lub stosunki F:B oparte na populacji, co czyni takie szacunki potencjalnie niewiarygodnymi10. Inne metody, takie jak cytometria przepływowa, mogą być stosowane do zwiększenia przepustowości próbek w celu określenia liczebności bakterii w glebach; jednak ich dokładność może być zmniejszona z powodu niemikrobialnych cząstek o podobnym rozmiarze, kształcie i właściwościach autofluorescencyjnych do mikroorganizmów11. Fumigacja chloroformowa wymaga stosunkowo dużej ilości gleby (>10 g) do oszacowania biomasy mikroorganizmów, podczas gdy próbka 500 mg gleby wystarcza do metod opartych na DNA podczas ekstrakcji z komercyjnymi zestawami. Wcześniejsze porównanie metod opartych na DNA z fumigacją chloroformową wykazało, że chociaż oba podejścia były w stanie oszacować biomasę mikroorganizmów, ich wspólne użycie pozwoliło na bardziej solidną ocenę biomasy mikroorganizmówglebowych 12.
Oceny społeczności mikrobiologicznych to niedostatecznie wykorzystywany wskaźnik zdrowia gleby, który może zmienić sposób, w jaki mierzymy i rozumiemy gleby13. Podejścia metabarkodowania są konwencjonalnie stosowane do określenia społeczności mikroorganizmów glebowych, przy czym względna liczebność bakterii ocenia się przez amplifikujące obszary genu 16S rRNA, natomiast taksony grzybowe są celowane za pomocą genu 18S rRNA lub wewnętrznego transkrybowanego spacera (ITS) regionu14. Podejścia metabarkodowania dla grzybów mogą opierać się na różnych regionach docelowych genomu, wpływając na różnorodność i liczebność zidentyfikowanych gatunków grzybów. Nierówna długość ITS wśród gatunków grzybów może sprzyjać preferencyjnemu amplifikowaniu i sekwencjonowaniu, co prowadzi do błędnej oceny ich liczebności, prowadząc do błędnej oceny zbiorowisk grzybowych15. Primery Fungiquant zostały opracowane w celu celowania w specyficzne obszary zmienne w genie 18S rRNA, które wykazują kompleksowe pokrycie różnorodnych grzybów i specyficzność w porównaniu z innymi eukariontami16.
Większość bakterii i grzybów ma więcej niż jedną kopię docelowego genu, co prowadzi do błędnych szacunków liczby komórek. Ponadto grzyby często mają wielojądrowe komórki o zmiennej liczbie jąder na komórkę6. Istnieje znaczna zmienność liczby kopii genu rRNA zarówno wewnątrz, jak i pomiędzy grupami taksonomicznymi, zazwyczaj poniżej 15 kopii u prokariontów, a szacuje się, że u grzybów17 wynosi od 28 do 511. Ze względu na tę zmienność techniki molekularne stosowane do analizy struktur wspólnot drobnoustrojów są uważane za półilościowe, ponieważ mogą zniekształcać szacunki względnej liczebności gatunków w społeczności18. Zmierzone liczby kopii genów (GCN) są rutynowo przeliczane na liczebność komórek przy użyciu szacowanej średniej GCN w grupie taksonomicznej zainteresowanej 18,19,20.
Niektóre badania stosowały podejścia metagenomowe, ponieważ oferują one kilka zalet w porównaniu z metabarkodowaniem, w tym eliminację błędu amplifikacyjnego oraz możliwość kompleksowego badania całej społeczności mikrobiologicznej21. Ponadto umożliwiają jednoczesne porównanie składu grzybów i bakterii oraz ich wzajemnych powiązań22. Ogólnie RT qPCR jest powszechnie stosowany do wykrywania zawartości mikrobiologicznej i funkcji23. qPCR ma ograniczenia w porównaniu z cyfrowym kropelkowym PCR (ddPCR) w zakresie ilościowego określenia ze względu na wrażliwość na inhibitory, ponieważ wymaga zewnętrznego standardu24.
ddPCR to przełomowa technologia polegająca na dzieleniu pojedynczych reakcji amplifikacyjnych na oddzielne krople. Szablon jest następnie amplifikowany przez PCR w każdej kropli jako osobna reakcja. ddPCR cechuje się niską czułością na inhibitory enzymatyczne, lepszą precyzją, powtarzalnością, czułością i stabilnością w ilościowości bakteryjnej i grzybowej niż qPCR25. Ponadto jest to metoda, którą można wykorzystać do bezwzględnej ilościowej identyfikacji bakterii i grzybów w glebie5. Ponieważ ddPCR opiera się na tym samym wyodrębnionym DNA używanym do oceny zmian składu mikroorganizmów, dane o obfitości z ddPCR można bezpośrednio powiązać z danymi o składzie społeczności26 i wykorzystać do ilościowego określenia biomasy mikroorganizmów glebowych.  
Niniejsze badanie przedstawia metodologię ilościowej identyfikacji grzybów i bakterii w glebach z wykorzystaniem cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR). Ta zoptymalizowana metoda została zastosowana na glebach z pięciu różnych globalnych lokalizacji i sposobów użytkowania ziemi. Wybrano miejsca próbek, aby obejmować szerokie spektrum właściwości gleby, warunków środowiskowych i praktyk zarządzania, co umożliwiło ocenę odporności i ogólności naszego podejścia w różnych środowiskach. Dane te umożliwiły określenie stosunku F:B jako molekularnego biowskaźnika jakości ekologicznej gleby. Na koniec przeprowadzono porównanie szacowanej biomasy mikroorganizmów pomiędzy danymi ddPCR a konwencjonalnymi metodami fumigacji chloroformów.

<table><tbody><tr><td>Bettersizer S3 Plus&nbsp;</td><td>Bettersize, Chiny</td><td>BT-803</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermoscientific&nbsp;</td><td>SL16&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>L14759. AU&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płyty ddPCR 96-dołkowe</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Dessykator&nbsp;</td><td>Davisil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na naboje DG8</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady DG8 do generatora kropli QX200/QX100</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki DG8 do generatora kropel QX200/QX100</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>Q33265</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Power Soil pro kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Niemcy</td><td>47017</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów dwuniciowych (dsDNA) szerokiego zakresu (BR)</td><td>Invitrogen, Niemcy</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, Wielka Brytania</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>GridION&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies, Wielka Brytania</td><td>GRD-MK1CAPX</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Merck, Wielka Brytania</td><td>7778-80-5</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki Mag-Bind</td><td>Omega Bio-tek, USA</td><td>M1378-01</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwo przepływowe MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies, Wielka Brytania</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Piec tłumiony</td><td>Carbolite&nbsp;</td><td>AAF1100</td><td></td></tr><tr><td>Natywny zestaw kodów kreskowych 24</td><td>Oxford Nanopore Technologies, Wielka Brytania</td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, folia, przebijalna &nbsp;</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz płyt PX1 PCR</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Invitrogen, Niemcy</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>186-4033</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil dla EvaGreen &nbsp;</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QXDx Generator kropli &nbsp;</td><td>Bio-Rad, Watford, Wielka Brytania</td><td>12001049</td><td></td></tr><tr><td>SENSOQUEST LABCYCLER&nbsp;</td><td>Geneflow, Niemcy</td><td>1120280125</td><td></td></tr></tbody></table>

określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego pcr kroplowego (ddpcr)

Determination of Microbial Biomass in Soil using Digital Droplet PCR (ddPCR)

Gleba stanowi największy lądowy zbiornik węgla organicznego, a jednak ponad 133 Gt węgla zostało utraconych z gleb w ciągu ostatnich dwóch stuleci. Dokładne określenie biomasy mikroorganizmów glebowych, szczególnie grzybów i bakterii, głównych rozkładaczy napędzających obieg węgla i składników odżywczych, jest niezbędne do zrozumienia funkcjonowania i zdrowia gleby. Konwencjonalne podejścia, takie jak ekstrakcja fumigacji chloroformem i analiza PLFA, są ograniczone przez wysokie wymagania dotyczące próbek oraz niepewności związane z przekształcaniem markerów biochemicznych w szacunki biomasy mikroorganizmów. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany sposób działania do ilościowego określania liczebności bakterii i grzybów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR) skierowanego do genów rRNA 16S i 18S. Metoda ta umożliwia bezwzględne ilościowe określenie kopii genów mikroorganizmów, konwersję na liczbę komórek za pomocą czynników korekcyjnych kopii genów oraz późniejsze oszacowanie biomasy mikroorganizmów w węglu. Zastosowaliśmy ten protokół do gleb z pięciu globalnie rozmieszczonych systemów rolniczych, różniących się fakturą gleby, użytkowaniem i zawartością materii organicznej. Porównano szacunki oparte na ddPCR z konwencjonalnymi szacunkami fumigacji chloroformem dotyczącymi mikrobiologicznej biomasy węgla. ddPCR zapewniał wysokorozdzielcze ilościowe określenie liczebności mikroorganizmów oraz dostarczał szerszych i bardziej czułych szacunków stosunków F:B w różnych typach gleb niż sekwencjonowanie całego genomu. Chociaż MBC pochodzący z ddPCR wykazał jedynie słabą korelację z wartościami fumigacji chloroformu, ta metoda oferuje skuteczne podejście molekularne do oceny biomasy mikroorganizmów oraz wskaźników ekologicznych, takich jak stosunek F:B. Protokół ten zapewnia powtarzalną i skalowalną strategię integracji miar obfitości mikroorganizmów z analizami składu, aby przyspieszyć ocenę zdrowia gleby.

Pobrano próbki gleby z pięciu miejsc, a zawartość materii organicznej w glebie została określona przez straty podczas zapłonu. Zawartość materii organicznej w glebie wahała się od 3,38% do 10,34% w każdej z gleb używanych w badaniu (Tabela 1). Ekstrakcje DNA przeprowadzono na każdej próbce gleby w trzech egzemplarzach, a uzyskane dane DNA wahały się od 32 ng do 4 590 ng na gram suchej gleby (rysunek 3A).
Stężenie DNA różniło się znacząco między glebami o zmiennej zawartości materii organicznej (jednokierunkowa ANOVA p < 0,0001, R2=0,97). Gleba o najniższej zawartości materii organicznej, gleba A, nie wykazywała najniższego stężenia DNA. Jednak gleba E, która miała najwyższą zawartość materii organicznej, miała znacznie wyższe stężenie DNA ze wszystkich innych gleb (A–D, p < 0,0001), podczas gdy gleba B miała najniższe, różniąc się znacząco od A i D (p < 0,05). Protokół ddPCR został wykonany na DNA oczyszczonym z każdej próbki gleby przy użyciu primerów genów rRNA 16S i 18S. Liczba kopii genów na gram suchej masy gleby dla każdego z genów 16S (rysunek 3B) i 18S rRNA (rysunek 3C) został określony za pomocą ddPCR. We wszystkich próbkach gleby było mniej kopii genu 18S rRNA niż genu 16S rRNA. Testy post-hoc Tukeya wykazały, że gleba B miała najmniej kopii genów rRNA 16S i 18S, ze średnią odpowiednio 8,8 x 107 i 4,6 x 10 6 kopiigenów na gram suchej gleby. Gleba E różniła się znacząco od wszystkich innych gleb i wykazywała największą liczbę kopii genów rRNA 16S i 18S, z odpowiednimi 4,4 x 109 i 2,5 x 10 9 kopiigenów na gram suchej gleby. Kopie grzybowe w glebach A–D nie różniły się znacząco od siebie, podczas gdy kopie bakterii w glebie D różniły się znacząco od gleb B i E.
Na DNA oczyszczonym z każdej próbki gleby zastosowano sekwencjonowanie typu shotgun (WGS) w całym genomie, a klasyfikacje taksonomiczne przeprowadzono za pomocą Kraken2 na podstawie bazy NCBI nr (nr database). Całkowita liczba odczytów sekwencji DNA sklasyfikowanych względem bakterii i grzybów została wykorzystana do obliczenia stosunku grzyb:bakteria (F:B) dla każdej gleby oraz porównana z stosunkiem grzyb:bakteria obliczonym na podstawie liczby kopii genów oszacowanych przez ddPCR (Ilustracja Uzupełniająca 1). Wartości F:B uzyskane za pomocą ddPCR wahały się od 0,022 do 0,66 we wszystkich próbkach gleby i były wyższe niż uzyskane przez sekwencjonowanie całego genomu. Najwyższa średnia F:B zaobserwowano w glebie E, z F:B 0,56 dla ddPCR i 0,038 dla metod WGS. Ponadto w próbkach gleby zidentyfikowano szerszy zakres wartości F:B za pomocą ddPCR zamiast WGS. Ponadto zaobserwowano dodatnią korelację między stosunkiem F:B określonym metodą ddPCR a danymi WGS (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019), jak pokazano na Rysunku Uzupełniającym 1.
Średnia liczba kopii genu dla bakterii i grzybów została użyta do przekształcenia obliczonych kopii genów na liczbę komórek bakterii i grzybów w próbkach pochodzących (Rysunek uzupełniający 2). Dane te zostały połączone, aby oszacować całkowitą liczbę komórek mikroorganizmów w glebie (rysunek 3D) i różniły się istotnie między glebami (jednokierunkowa ANOVA p < 0,0001). Analiza porównawcza Tukeya wykazała, że najwyższa zawartość mikroorganizmów zaobserwowano w glebie E, natomiast najniższą zawartość mikroorganizmów w próbkach pobranych z gleby B, co znacząco różniło się od A, D i E.
Fumigacja chloroformów została przeprowadzona na każdej próbce gleby w trzech egzemplarzach, aby oszacować całkowitą biomasę węgla (MBC) w każdej próbce (Rysunek 4A). Zidentyfikowano od 3,6 do 9,6 mg węgla na gram suchej gleby na użytych glebach, bez istotnych różnic między każdą z próbek (jednokierunkowa ANOVA p = 0,266). Średnia zawartość węgla w komórkach bakteryjnych i grzybowych została wykorzystana do przekształcenia szacowanej liczby komórek mikroorganizmów według ddPCR na szacowaną całkowitą biomasę węgla w mikroorganizmach. Te szacunki pochodzące z ddPCR porównano z metodą fumigacji chloroformem (rysunek 4B). Aby ocenić związek między MBC mierzonym fumigacją chloroformową a metodą ddPCR, przeprowadzono korelację Pearsona (n = 15). Stwierdzono dodatnią korelację między obiema metodami (r = 0,43, R2 = 0,18, p-wartość = 0,05). Odstępstwa z gleby E, charakteryzujące się najwyższą zawartością materii organicznej, prawdopodobnie przyczyniły się nieproporcjonalnie do tego marginalnie istotnego wyniku (Rysunek 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69467/69467fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd przetwarzania próbek gleby. Rysunek ilustruje metody molekularne wykorzystujące DNA gleby do ilościowej identyfikacji mikroorganizmów oraz konwencjonalne metody pomiaru biomasy mikroorganizmów, węgla i materii organicznej gleby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/69467fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69467/69467fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat przepływowy procesu liczenia komórek od kopii ddPCR dla obu 16S i 18S do ostatecznego oszacowania biomasy mikroorganizmów z zakresu węgla, pokazując kroki 5.11–5.16 protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/69467fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69467/69467fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Ilościowa ilościfikacja gleb w zakresie mikroorganizmów. (A) Średnie stężenie DNA oczyszczone z każdej próbki gleby. (B) Średnia całkowita liczba kopii genu rRNA 16S na gram suchej masy gleby przy użyciu ddPCR. (C) Średnia łączna liczba kopii genu rRNA 18S na gram suchej masy gleby według ddPCR. (D) Średnia całkowita liczba komórek mikroorganizmów na gram suchej masy w próbkach gleby. Wszystkie paski błędu pokazują standardowy błąd średniej. Przeprowadzono jednokierunkową ANOVA oraz późniejszy test pooperacyjny Tukeya dla porównań parowych, a istotne różnice pokazano za pomocą zwartego wyświetlania liter (próg istotności = 0,05). Próbki są uporządkowane od najniższego do najwyższego OM%. Pochodzenie gleby (OM%) A: Holandia (3,38), B: Irak (5,14), C: Chiny (6,41), D: Wielka Brytania (8,19) oraz E: Wielka Brytania (10,34). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/69467fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69467/69467fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Węgiel biomasy mikroorganizmów mierzony przez ekstrakcję fumigacji chloroformem oraz oszacowania komórek genetycznych. (A) MBC ekstrahowany przez fumigację chloroformową – ułożony od niskiej do wysokiej zawartości materii organicznej. Paski błędu pokazują standardowy błąd średniej. Przeprowadzono jednokierunkową ANOVA oraz późniejszy test pooperacyjny Tukeya dla porównań parowych, a istotne różnice pokazano za pomocą zwartego wyświetlania liter (próg istotności = 0,05). (B) MBC oszacowany na podstawie liczebności komórek (komórka gdw -1) wyprowadzony z kopii genu ddPCR i przekształcony w biomasę węgla, nakreślony na wykresie z całkowitą materią organiczną dla tej samej próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/69467fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przykład</td>
			<td>Pochodzenie gleby</td>
			<td>pH</td>
			<td>Zawartość wilgoci %</td>
			<td>Materia organiczna%</td>
			<td>Tekstura</td>
			<td>Użytkowanie terenu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Texel, Holandia</td>
			<td>7.16</td>
			<td>19.04</td>
			<td>3.38</td>
			<td>Piaskowa glina</td>
			<td>Ogrodnictwo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Nadżaf, Irak</td>
			<td>7.58</td>
			<td>8.33</td>
			<td>5.14</td>
			<td>Glina mulista</td>
			<td>Ryż</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>Jiangxi, Chiny</td>
			<td>4.11</td>
			<td>8.45</td>
			<td>6.41</td>
			<td>Glina mulista</td>
			<td>Sezam/rzepaki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>Cambridge, Wielka Brytania</td>
			<td>6.81</td>
			<td>21.8</td>
			<td>8.19</td>
			<td>Glina mulista</td>
			<td>Pszenica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>Exeter, Wielka Brytania</td>
			<td>5.44</td>
			<td>20.27</td>
			<td>10.34</td>
			<td>Glina mulista</td>
			<td>Łąki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Właściwości fizjochemiczne i charakterystyka użytkowania ziemi pięciu próbek gleby (A–E), do określenia biomasy mikroorganizmów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cel</td>
			<td>BP</td>
			<td>Naprzód</td>
			<td>Rewers</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S rRNA</td>
			<td>180</td>
			<td>5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG</td>
			<td>5′- ATTACCGCGGCTGCTGG</td>
			<td>(Le Geay i in., 2024; Ovreås i in., 1997)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA</td>
			<td>351</td>
			<td>5′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG</td>
			<td>5′-GSWCTATCCCCAKCACGA</td>
			<td>(Liu i in., 2012)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Pary primerów wybrane do celowania w gen rRNA 16S i 18S za pomocą ddPCR.
Ilustracja uzupełniająca 1: Korelacja między stosunkiem F:B dla wszystkich próbek gleby, ustalana metodą ddPCR i WGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/Supplementary Figure 1.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Liczba komórek w różnych próbkach gleby mierzona metodą ddPCR, celując: (A) bakterie; oraz (B) grzyby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69467/Supplementary Figure 2.png" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Badanie to przedstawia metodę szybkiego ddPCR do ilościowego określania biomasy mikroorganizmów glebowych oraz stosunków grzybów do bakterii. Chociaż węgiel biomasy mikroorganizmów pochodzącej z ddPCR wykazuje jedynie słabą korelację z szacunkami fumigacji chloroformów, metoda ta zapewnia wrażliwe, skalowalne podejście molekularne do oceny liczebności mikroorganizmów bez dodatkowych próbek gleby czy stosowania silnych chemikaliów.

Określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR)

Soil represents the largest terrestrial pool of organic carbon, yet more than 133 Gt of carbon has been lost from soils over the past two centuries. ...

Nasze badanie wykorzystuje cyfrowe PCR kropelkowe oraz sekwencjonowanie całego genomu do dokładnego ilościowego określenia biomasy mikroorganizmów w różnych typach gleb. Tradycyjne metody wymagają dużych ilości próbek gleby i szkodliwych chemikaliów. ddPCR wykorzystuje minimalną ilość gleby do bezwzględnej ilościowej analizy węgla genów i biomasy.Na początek zbierz odczynniki do zestawu do ekstrakcji DNA gleby, aby izolować DNA od mikroorganizmów glebowych w temperaturze pokojowej 20 stopni Celsjusza. Krótko obróć dwumililitrową rurkę do bicia koralików i sprawdź, czy koraliki osiadły na dnie. Dodaj 100 miligramów gleby, następnie 800 mikrolitrów roztworu CD1 i krótko wymieszaj wir.Użyj homogenizatora do granulacji kulkowej z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 40 sekund, aby dokładnie zlizować próbkę, a następnie wirować probówkę do ubijania koralików o nadawce 15 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać mechaniczną lizę komórek. Przenieś supernatant, który może nadal zawierać cząstki gleby, do czystej rurki mikrowirówki o dwóch mililitrach. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu CD2.Wiruj przez pięć sekund i wiruj z mocą 15 000 g przez minutę. Przenieś do 700 mikrolitrów supernatantu do czystej rurki mikrowirówki dwumililitrowej, nie naruszając granulki. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu CD3 do supernatantu i wiru przez pięć sekund.Załaduj 650 mikrolitrów mieszanki na kolumnę wirową i wiruj w 15 000 g przez minutę. Usuń przepływ i powtórz ten proces dla pozostałego lizatu. Następnie umieść kolumnę spinową w czystej probówce zbierającej dwa mililitry.Dodaj 500 mikrolitrów roztworu EA do kolumny wirowej i wiruj w 15 000 g przez minutę w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu C5 do kolumny wirowej i wirulec, jak wcześniej wykazano.Po odrzuceniu przepływu należy włożyć kolumnę wirową do nowej dwumililitrowej probówki zbiorczej i wirować w temperaturze 16 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umieść kolumnę spinową w nowej rurce elucijnej o średnicy 1,5 mililitra. Dodaj od 50 do 100 mikrolitrów roztworu C6 do środka membrany filtracyjnej kolumny spinowej.Wirówka z 15 000 g przez minutę. Przechowuj tubę zawierającą eluent w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odrzuceniu kolumny spinowej. Ilościowo określ wyodrębnione DNA za pomocą fluorometru oraz zestawu do badania dwuniciowego DNA o szerokim zakresie, zgodnie z instrukcjami producenta.Do analizy bakterii i grzybów wybierz konkretne primery 16S rRNA i 18S rRNA. Po rozmrożeniu wszystkie odczynniki zawiruj na lodzie. Ustaw cyfrową reakcję łańcuchową z polimerazą kropelkową, czyli ddPCR.Włóż wkład generatora kropel, czyli DG8, do uchwytu na naboj. Do każdego z dołków próbek w wkładce dodaj łącznie 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej. Następnie dodaj 70 mikrolitrów oleju generującego krople dla Evagreen do dobrze oznaczonego oleju w wkładzie.Włóż wkład do generatora kropel i przykryj go uszczelką. Przelej 40 mikrolitrów wygenerowanych kropelek do każdej studni płytki półotoczonej z 96 dołkami do amplifikacji PCR. Uszczelnij płytę za pomocą impregnaty na 180 stopni Celsjusza przez pięć sekund.Skonfiguruj profil cyklu termicznego i ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 stopni Celsjusza. Po zakończeniu PCR przenieś płytę z 96 dołkami do czytnika płyt. Korzystając z wersji QuantaSoft 2.1, dostosuj próg amplitudy, aby oddzielić krople ujemne i dodatnie.Z każdego odwiertu należy ocenić parametry, takie jak liczba kopii genów na nanogram DNA, całkowita liczba kopii genów na nanogram wyodrębnionego DNA, kopie genów na gram suchej masy gleby przetworzonej podczas ekstrakcji oraz liczba komórek na gram suchej masy gleby. Ponadto oblicz mikrobiologiczną biomasę węgla, czyli MBC, odpowiadającą bakteriom i grzybom na gram suchej masy gleby na odwiert. Potrójna analiza DNA gleby z pięciu lokalizacji dała średnie stężenia DNA mikroorganizmów w zakresie od 32 nanogramów do 4 590 nanogramów na gram suchej gleby na próbkę.Gleba B zawierała najmniej kopii genu 16S rRNA średnio 8,8 razy 10 do mocy siedmiu i 18S kopii genu rRNA ze średnią 4,6 razy 10 do mocy sześciu kopii na gram suchej gleby. Dla porównania, gleba E miała najwyższą liczbę kopii genów rRNA 16S i 18S ze średnią 4,4 razy 10 do potęgi dziewięciu oraz 2,5 razy 10 do potęgi dziewięciu na gram suchej gleby, co znacząco różni się od pozostałych próbek. Podczas gdy kopie grzybów pozostały podobne na glebach A, B, C i D, liczba bakterii w glebie D różniła się znacząco od poziomu zarówno w glebie, jak i w B. Najwyższa zawartość mikroorganizmów zaobserwowano w glebie E, natomiast najniższą zawartość mikroorganizmów znaleziono w próbkach pobranych z gleby B, różniących się znacząco od A, D i E. Protokół ten pozwala badaczom mierzyć dynamikę i strukturę społeczności glebowej na podstawie biomasy mikroorganizmów oraz stosunku bakterii grzybów do bakterii.Ten sam szablon DNA używany do cyfrowego PCR kropelkowego może być używany do sekwencjonowania DNA, umożliwiając analizę społeczności i funkcji mikroorganizmów.

determination-microbial-biomass-soil-using-digital-droplet-pcr

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Poznaj metodę ddPCR do ilościowego oznaczania biomasy bakterii i grzybów w glebie poprzez amplifikację genów 16S i 18S rRNA. Protokół umożliwia precyzyjną ocenę zdrowia gleby i dynamiki mikroorganizmów.

Określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR)

Przeglądaj więcej filmów