Określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR)

Nasze badanie wykorzystuje cyfrowe PCR kropelkowe oraz sekwencjonowanie całego genomu do dokładnego ilościowego określenia biomasy mikroorganizmów w różnych typach gleb. Tradycyjne metody wymagają dużych ilości próbek gleby i szkodliwych chemikaliów. ddPCR wykorzystuje minimalną ilość gleby do bezwzględnej ilościowej analizy węgla genów i biomasy.

Na początek zbierz odczynniki do zestawu do ekstrakcji DNA gleby, aby izolować DNA od mikroorganizmów glebowych w temperaturze pokojowej 20 stopni Celsjusza. Krótko obróć dwumililitrową rurkę do bicia koralików i sprawdź, czy koraliki osiadły na dnie. Dodaj 100 miligramów gleby, następnie 800 mikrolitrów roztworu CD1 i krótko wymieszaj wir.

Użyj homogenizatora do granulacji kulkowej z prędkością sześciu metrów na sekundę przez 40 sekund, aby dokładnie zlizować próbkę, a następnie wirować probówkę do ubijania koralików o nadawce 15 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać mechaniczną lizę komórek. Przenieś supernatant, który może nadal zawierać cząstki gleby, do czystej rurki mikrowirówki o dwóch mililitrach. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu CD2.

Wiruj przez pięć sekund i wiruj z mocą 15 000 g przez minutę. Przenieś do 700 mikrolitrów supernatantu do czystej rurki mikrowirówki dwumililitrowej, nie naruszając granulki. Dodaj 600 mikrolitrów roztworu CD3 do supernatantu i wiru przez pięć sekund.

Załaduj 650 mikrolitrów mieszanki na kolumnę wirową i wiruj w 15 000 g przez minutę. Usuń przepływ i powtórz ten proces dla pozostałego lizatu. Następnie umieść kolumnę spinową w czystej probówce zbierającej dwa mililitry.

Dodaj 500 mikrolitrów roztworu EA do kolumny wirowej i wiruj w 15 000 g przez minutę w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu C5 do kolumny wirowej i wirulec, jak wcześniej wykazano.

Po odrzuceniu przepływu należy włożyć kolumnę wirową do nowej dwumililitrowej probówki zbiorczej i wirować w temperaturze 16 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umieść kolumnę spinową w nowej rurce elucijnej o średnicy 1,5 mililitra. Dodaj od 50 do 100 mikrolitrów roztworu C6 do środka membrany filtracyjnej kolumny spinowej.

Wirówka z 15 000 g przez minutę. Przechowuj tubę zawierającą eluent w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odrzuceniu kolumny spinowej. Ilościowo określ wyodrębnione DNA za pomocą fluorometru oraz zestawu do badania dwuniciowego DNA o szerokim zakresie, zgodnie z instrukcjami producenta.

Do analizy bakterii i grzybów wybierz konkretne primery 16S rRNA i 18S rRNA. Po rozmrożeniu wszystkie odczynniki zawiruj na lodzie. Ustaw cyfrową reakcję łańcuchową z polimerazą kropelkową, czyli ddPCR.

Włóż wkład generatora kropel, czyli DG8, do uchwytu na naboj. Do każdego z dołków próbek w wkładce dodaj łącznie 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej. Następnie dodaj 70 mikrolitrów oleju generującego krople dla Evagreen do dobrze oznaczonego oleju w wkładzie.

Włóż wkład do generatora kropel i przykryj go uszczelką. Przelej 40 mikrolitrów wygenerowanych kropelek do każdej studni płytki półotoczonej z 96 dołkami do amplifikacji PCR. Uszczelnij płytę za pomocą impregnaty na 180 stopni Celsjusza przez pięć sekund.

Skonfiguruj profil cyklu termicznego i ustaw podgrzewaną pokrywę na 105 stopni Celsjusza. Po zakończeniu PCR przenieś płytę z 96 dołkami do czytnika płyt. Korzystając z wersji QuantaSoft 2.1, dostosuj próg amplitudy, aby oddzielić krople ujemne i dodatnie.

Z każdego odwiertu należy ocenić parametry, takie jak liczba kopii genów na nanogram DNA, całkowita liczba kopii genów na nanogram wyodrębnionego DNA, kopie genów na gram suchej masy gleby przetworzonej podczas ekstrakcji oraz liczba komórek na gram suchej masy gleby. Ponadto oblicz mikrobiologiczną biomasę węgla, czyli MBC, odpowiadającą bakteriom i grzybom na gram suchej masy gleby na odwiert. Potrójna analiza DNA gleby z pięciu lokalizacji dała średnie stężenia DNA mikroorganizmów w zakresie od 32 nanogramów do 4 590 nanogramów na gram suchej gleby na próbkę.

Gleba B zawierała najmniej kopii genu 16S rRNA średnio 8,8 razy 10 do mocy siedmiu i 18S kopii genu rRNA ze średnią 4,6 razy 10 do mocy sześciu kopii na gram suchej gleby. Dla porównania, gleba E miała najwyższą liczbę kopii genów rRNA 16S i 18S ze średnią 4,4 razy 10 do potęgi dziewięciu oraz 2,5 razy 10 do potęgi dziewięciu na gram suchej gleby, co znacząco różni się od pozostałych próbek. Podczas gdy kopie grzybów pozostały podobne na glebach A, B, C i D, liczba bakterii w glebie D różniła się znacząco od poziomu zarówno w glebie, jak i w B. Najwyższa zawartość mikroorganizmów zaobserwowano w glebie E, natomiast najniższą zawartość mikroorganizmów znaleziono w próbkach pobranych z gleby B, różniących się znacząco od A, D i E. Protokół ten pozwala badaczom mierzyć dynamikę i strukturę społeczności glebowej na podstawie biomasy mikroorganizmów oraz stosunku bakterii grzybów do bakterii.

Ten sam szablon DNA używany do cyfrowego PCR kropelkowego może być używany do sekwencjonowania DNA, umożliwiając analizę społeczności i funkcji mikroorganizmów.