Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek
22 maja 2026
Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.
Transkryptomika jednokomórkowa wykazuje heterogeniczność nabłonka dróg oddechowych z mukowiscydozą. Chcemy zrozumieć, jak funkcje i zmiany specyficzne dla typu komórek wpływają na patogenezę choroby. Obecnym wyzwaniem jest dokładne zmierzenie proteomiki i funkcji pojedynczych komórek.
To nadal wymaga rozwoju technicznego. Na początek utrzymuj komórki Calu-3 w kolbach T-25 zawierających Medium Minimum Essential Medium Culture Media, uzupełnione o 20% FBS i 1% penicyliny, streptomycynę. Gdy komórki osiągną około 70% zbiegu się, przemyj je pięcioma mililitrami PBS.
Po umyciu dodaj jeden mililitr TrypLE bezpośrednio do komórek i umieść kolbę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 10 do 15 minut. Następnie zneutralizuj TrypLE, dodając cztery mililitry świeżego, kompletnego pożywki hodowlanego i dokładnie wymieszając zawiesinę komórkową. Nakładaj komórki na płytkę z 96 dołkami przy około 90% do 100% zbiegu się, co odpowiada około 40 000 komórek na odwór.
Pozwól komórkom przykleić się do płytki z 96 dołkami przez noc. Codziennie zmieniaj ośrodek i kontynuuj hodowlę komórek przez dwa do pięciu dni po zbiórce, aby umożliwić różnicowanie. W dniu eksperymentu przemyj komórki Calu-3 i inkubuj je odpowiednimi barwnikami.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów na dołek 2,5 milimolowego probenecidu rozcieńczonego w buforze wapniowym, aby utrzymać barwnik w przestrzeni cytoplazmatycznej, a następnie owinąć płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem do czasu obrazowania. Dla głównych komórek dróg oddechowych. Usuń podłoże bazolateralne z przejścia i przepłucz stronę wierzchołową, dodając 300 mikrolitrów buforu wapnia.
Następnie myję stronę bazolateralną, dodając 750 mikrolitrów buforu wapnia. Usuń bufor, pipetując i powtarzaj mycie z obu stron. Następnie inkubuj komórki z 200 mikrolitrami roztworu barwniczego po stronie wierzchołowej i 600 mikrolitrami po stronie podstawowo-bocznej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Podczas inkubacji przygotuj thapsigargina rozcieńczoną w buforze wapniowym jako trzykrotny zapas pośredni. Dostosuj stężenie do sześciu mikromolów, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch mikromolarów w otworze. Po inkubacji usuń roztwór barwnika zarówno z przedziałów wierzchołkowych, jak i bazolateralnych poprzez pipetowanie.
Umyj komórki dwukrotnie, podając 300 mikrolitrów buforu wapnia po stronie wierzchołkowej i 750 mikrolitrów buforu wapnia po stronie podstawno-bocznej. Następnie usuń bufor przez pipetowanie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 2,5 milimolowego probenecydu w buforze wapniowym do komory wierzchołkowej oraz 500 mikrolitrów tego samego roztworu do przedziału podstawno-bocznego.
Zostawiając wkład przepustkowy wewnątrz płyty, owiń całą płytę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i odłóż owiniętą płytkę na bok do obrazowania. Otwórz wniosek Fidżi. Wybierz Plik i otwórz opcję Otwarte, aby przesłać plik wideo.
W wyskakującym oknie zachowaj wszystkie domyślne ustawienia i potwierdź wybór. Jeśli chcesz, dostosuj wyświetlanie obrazu, wybierając Obraz, wybierając Dostosowanie i klikając Kontrast jasności. Zmodyfikuj jasność i kontrast poszczególnych kanałów fluorescencyjnych, aby uzyskać optymalny widok komórek.
Aby ułatwić śledzenie komórek, łącz kanały, wybierając Obraz, kolor i klikając Scal Kanały. W oknie wyskakującym przypisz odpowiednie pliki do każdego kanału i potwierdź wybór. Do śledzenia wybierz Analizuj, Wybierz Narzędzia i otwórz Menedżera ROI.
W wyskakującym oknie włącz zarówno opcje Pokaż wszystko, jak i Etykiety. Za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego starannie śledz pojedyncze komórki na podstawie granic komórek i barwienia jądrowego. Następnie naciśnij klawisz T, aby dodać każdą śledzoną komórkę do listy ROI.
Upewnij się, że komórki są obrysowane we wszystkich czterech rogach pola widzenia oraz w centrum wideo. Gdy wszystkie komórki zostaną dokładnie prześledzone, w oknie Menedżera ROI kliknij More i wybierz Wiele pomiarów. W powstałym oknie pop-up naciśnij OK, aby rozpocząć pomiar.
Otwórz plik wideo na Fidżi. Optymalizuj kanały fluorescencji jądrowej i zielonej do oglądania za pomocą narzędzi do korekcji obrazu. Gdy kanały zostaną zoptymalizowane, zdubluj pojedynczą klatkę, wybierając Obraz i wybierając Duplikat.
W wyskakującym oknie odznacz stos Duplicate i zapisz zduplikowany obraz jako plik PNG. Powtórz duplikację klatek dla drugiego kanału, wybierając Obraz i wybierając Duplikat. W oknie wyskakującym kliknij OK i zapisz obraz jako plik PNG.
Połącz dwa zapisane obrazy, wybierając Obraz, wybierając Kolor i klikając Połącz kanały. Następnie przypisz każdy plik PNG do odpowiedniego kanału i potwierdź połączenie. Prześlij połączony obraz do postgraficznego interfejsu komórki, aby wygenerować maskę komórki.
Segmentuj obraz, używając barwnika jądrowego jako kanału pierwszego, a barwienie cytoplazmatyczne to kanał drugi, wybierając model cyto3. Teraz zapisz wygenerowany obraz maski jako plik PNG. Otwórz go na Fidżi i przekonwertuj na plik TIFF.
Na koniec otwórz zarówno plik maski, jak i oryginalny plik wideo w zestawie Calcium, przeciągając i upuszczając je do interfejsu oprogramowania. Kliknij Analizuj dane, aby wygenerować wykres do pobrania oraz plik CSV zawierający znormalizowane i surowe wartości intensywności dla wszystkich analizowanych komórek. Intensywność fluorescencji znormalizowana do wartości wyjściowej wzrosła z czasem w pojedynczych komórkach Calu-3 po stymulacji thapsigarginą, mierzona zarówno za pomocą Fluo-4AM, jak i Cal-520AM, maksymalna aktywacja fluorescencji zależna od wapnia po thapsigarginie była istotnie wyższa w komórkach Calu-3 mierzonych Cal-520 AM w porównaniu do Fluo-4AM. Podobnie pojedyncze komórki pierwotnych dróg oddechowych i oskrzeli wykazywały wzrost znormalizowanej fluorescencji w czasie po stymulacji thapsigarginą przy użyciu któregokolwiek z barwników.
Dodatkowo, maksymalna aktywacja fluorescencji zależna od wapnia była istotnie wyższa w komórkach wypełnionych Cal-520 AM. Analiza oparta na uczeniu maszynowym zidentyfikowała i ilościowo określiła zmiany fluorescencji zależne od wapnia w 1 441 pojedynczych komórkach, z jednego pola widzenia. Znormalizowane ślady fluorescencji generowane przez oprogramowanie wykazały odpowiedzi wapnia dla wszystkich 1 441 zidentyfikowanych komórek po stymulacji thapsigarginą. Nasze badania pomogą zrozumieć reakcje różnych typów komórek na otoczenie, co pomoże w rozwoju terapii celowanej.
Nasze wyniki mają potencjał do skupienia się na różnych typach komórek, przypisując określone odpowiedzi żywych komórek do bodźców środowiskowych. W przyszłości zamierzamy zbadać, jak sygnalizacja specyficzna dla konkretnych komórek komórkowych w chorobach i komórkach zdrowych jest zmieniana, aby określić typy odpowiedzialne za to.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół monitorowania sygnałów wapniowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w pierwotnych kulturach nabłonka dróg oddechowych. Metoda łączy zastosowanie egzogennych fluorescencyjnych wskaźników barwnikowych, zaawansowanej mikroskopii epifluorescencyjnej oraz nowoczesnego oprogramowania opartego na uczeniu maszynowym do segmentacji komórek i analizy ilościowej. Podejście to umożliwia szybką, obiektywną i wysokoprzepustową analizę przepływu jonów wapnia w złożonych tkankach nabłonkowych, co ułatwia badanie specyficznych dla danego typu komórek odpowiedzi istotnych dla patogenezy chorób oraz rozwoju terapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Sygnalizacja wapniowa
- Badania nad nabłonkiem dróg oddechowych
- Obrazowanie i analiza obliczeniowa
Wstęp
- Sygnalizacja wapniowa jest niezbędna dla licznych procesów biologicznych.
- Badanie przepływu jonów wapnia z rozdzielczością pojedynczych komórek w pierwotnych hodowlach nabłonkowych jest trudne pod względem technicznym.
- Istniejące metody często nie pozwalają na rozdzielenie odpowiedzi poszczególnych komórek w złożonych tkankach.
- Uczenie maszynowe stwarza nowe możliwości dla bezstronnej, wysokoprzepustowej analizy danych obrazowych.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja protokołu obrazowania wapnia w żywych komórkach w pierwotnych kulturach nabłonkowych dróg oddechowych.
- Umożliwienie analizy mobilizacji wapnia w rozdzielczości pojedynczych komórek z wykorzystaniem komórek pochodzenia pacjenta.
- Wprowadzenie oprogramowania opartego na uczeniu maszynowym do automatycznej segmentacji komórek i kwantyfikacji fluorescencji.
Zastosowane Metody
- Kulturowanie komórek Calu-3 oraz pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy powietrze-ciecz (ALI).
- Obciążanie komórek zewnętrznymi fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi wapnia (Fluo-4 AM i Cal-520 AM).
- Stymulacja tapsigarginą w celu wywołania mobilizacji wapnia.
- Mikroskopia epifluorescencyjna do obrazowania na żywo przepływu wapnia.
- Ręczna i oparta na uczeniu maszynowym segmentacja komórek z wykorzystaniem programu Fiji i specjalistycznego oprogramowania.
- Ilościowa analiza zmian intensywności fluorescencji na poziomie pojedynczych komórek.
Główne wyniki
- Zarówno komórki Calu-3, jak i pierwotne komórki dróg oddechowych wykazały zwiększoną znormalizowaną fluorescencję po stymulacji tapsigarginą, co wskazuje na mobilizację wapnia.
- Barwnik Cal-520 AM zapewnił znacząco wyższą maksymalną aktywację fluorescencji zależną od wapnia w porównaniu z Fluo-4 AM.
- Analiza oparta na uczeniu maszynowym umożliwiła identyfikację i kwantyfikację odpowiedzi wapniowych w 1 441 pojedynczych komórkach z jednego pola widzenia.
- Znormalizowane przebiegi fluorescencji ujawniły wyraźne odpowiedzi wapniowe we wszystkich analizowanych komórkach.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szybką, bezstronną i wysokoprzepustową analizę sygnalizacji wapniowej z rozdzielczością pojedynczych komórek w pierwotnych kulturach nabłonkowych.
- Segmentacja i analiza oparta na uczeniu maszynowym poprawiają dokładność i skalowalność badań w obrębie pojedynczych komórek.
- Podejście to ułatwia identyfikację odpowiedzi specyficznych dla danego typu komórek, co wspiera przyszłe badania nad mechanizmami chorób oraz terapiami celowanymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach pierwotnych kultur nabłonka dróg oddechowych człowieka pozwala wypełnić krytyczną lukę w zrozumieniu specyficznego dla poszczególnych typów komórek sygnalizowania, istotnego dla patogenezy chorób układu oddechowego. Zautomatyzowana segmentacja komórek z wykorzystaniem uczenia maszynowego umożliwia skalowalną i obiektywną analizę, co zwiększa pewność predykcyjną w fazie wczesnych odkryć i walidacji celów terapeutycznych. Możliwość ta usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfela badań poprzez wyjaśnienie heterogeniczności funkcjonalnej i zapewnienie ciągłości translacyjnej od etapu odkryć do badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę specyficznych dla typu komórek szlaków sygnalizacji wapniowej w pierwotnej tkance ludzkiej.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację heterogeniczności funkcjonalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu dzięki solidnym, ilościowym odczytom.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w odpowiedzi komórkowe istotne dla przebiegu choroby w celu selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, fizjologicznie istotne układy nabłonkowe do dalszych etapów przesiewowych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe wyniki analiz opartych na fluorescencji.
- Umożliwia wysokoprzepustową, zautomatyzowaną analizę odpowiednią do skalowalnej oceny związków.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy analitycznej w różnych modelach chorób dróg oddechowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie funkcjonalnych odczytów z pojedynczych komórek z biomarkerami istotnymi dla choroby w nabłonku dróg oddechowych.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od kultur pochodzących od pacjentów do walidacji przedklinicznej.
- Pomaga w podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie odpowiedzi specyficznych dla poszczególnych typów komórek.
- Minimalizuje ryzyko związane z hipotezami mechanistycznymi przed przystąpieniem do badań in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne, zapewniając wielokrotnego użytku schemat postępowania dla analizy funkcjonalnej w pierwotnych modelach dróg oddechowych człowieka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie przepływu wapnia w poszczególnych typach komórek.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testów i ewaluacji związków.
- Analityka: Zapewnia znormalizowane pomiary intensywności fluorescencji oraz wyniki statystyczne dla wiarygodnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi pojedynczych komórek in vitro z biomarkerami translacyjnymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalną, zautomatyzowaną możliwość wielokrotnego zastosowania w ramach portfeli badawczych nad chorobami dróg oddechowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i automatyzuje analizę pojedynczych komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie heterogeniczności funkcjonalnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów dotyczących chorób układu oddechowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizie obliczeniowej.
- Zależy od dostępu do mikroskopów epifluorescencyjnych i oprogramowania do segmentacji opartego na uczeniu maszynowym.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i analizy pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych pierwotnych źródeł tkanek lub modeli chorobowych.
- Przepustowość i skalowalność są uzależnione od infrastruktury obrazowania oraz zasobów obliczeniowych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Calu-3 Cell Culturing for Live Calcium Imaging
1:40
Loading Calu-3 Cells and the Primary Airway Cells with Cal-520 AM or Fluo-4 AM
3:51
Calcium Imaging Analysis Using the Fiji Software
5:28
Calcium Imaging Analysis Using the Calcium Suite
7:13
Results
8:31
Conclusion
