Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Nasze badania oceniają, jak różne biomateriały wpływały na architekturę kości podczas procesu regeneracji. Regeneracja kości wymaga wieloskalowej oceny, ponieważ jest hierarchicznie zorganizowana w tkance. Protokół ten umożliwia analizę próbki na różnych skalach.

Na początek przymocuj w żywicy, piszczelową z wszczepionym biomateriałem do uchwytu na próbkę i przymocuj ją do ramienia instrumentu. Ukierunkuj próbkę zgodnie z pożądanym kierunkiem przekroju. Pobierz niskoobrotowy diamentowy dysk do piły, aby podzielić kość na około 0,7 milimetra kawałki.

Napełnij zbiornik cieczy tak, aż poziom płynu całkowicie zakryje dolną krawędź łopatki. Upewnij się, że próbka jest stabilna i poziomo wyrównana z powierzchnią dysku. Reguluj pozycję próbki za pomocą pokręteł pozycjonujących, aż docelowy obszar cięcia będzie wyrównany z ostrzem.

Rozpocznij cięcie próbki na wyższym ustawieniu i stosuj niskie ciśnienie, aż powstanie wgłębienie. Następnie zmniejsz prędkość, aby gładko zakończyć cięcie i zminimalizować drgania. Zatrzymaj piłę natychmiast po zakończeniu cięcia.

Następnie zbadać wyciętą próbkę za pomocą mikroskopu stereo do montażu. Do montażu użyj domowego zespołu składającego się z wewnętrznego cylindra ze stali nierdzewnej oraz zewnętrznego pustego cylindra, który zapewnia mechaniczne wsparcie podczas polerowania. Następnie umieść wewnętrzny cylinder na grzewczej płycie i podgrzej go do około 120 do 140 stopni Celsjusza.

Wybierz odpowiedni wosk i nałóż niewielką ilość wosku na powierzchnię podgrzanego cylindra, pozwól mu całkowicie się roztopić. Następnie umieść próbkę tak, aby powierzchnia była skierowana do dołu na powierzchnię pokrytą woskiem i delikatnie dociskając próbkę, aby zapewnić pełny kontakt z roztopionym woskiem. Następnie zdejmij aluminiowy cylinder z płyty grzewczej i pozwól wosku zastygnąć w temperaturze pokojowej.

Do polerowania grubego i pośredniego wybierz papier ścierny o grubości 1, 200, 2, 500 i 4 100, aby zmniejszyć grubość próbki do około 0,15 milimetra. Zacznij od 1 papieru ściernego o ziarnistości 200, a następnie od 2 papierów o granulacji 500, przy lekkim nacisku. Okresowo monitoruj grubość próbki podczas polerowania za pomocą mikroskopii odbicia.

Po osiągnięciu docelowej grubości poleruj obie strony próbki papierem ściernym o ziarnistości 4 o ziarnistości 100. Podczas każdego etapu polerowania nieustannie czyść próbkę wodą destylowaną. Do końcowego polerowania wybierz pastę diamentową o rozmiarze cząstek sześciu lub trzech mikrometrów, w zależności od chropowatości powierzchni próbki.

Nałóż niewielką ilość pasty diamentowej na filcową ściereczkę do polerowania, zamontowaną na tarczy polerskiej, i poleruj próbkę. Aby odłączyć próbkę od cylindra, podgrzej wosk na gorącej płycie. Po wyjęciu jednostki z płyty grzewczej, pobierz próbkę z cylindra.

Następnie delikatnie poleruj obie strony próbki przy minimalnym nacisku i wysusz wypolerowaną powierzchnię papierem filtracyjnym. Przed analizą mikroskopową zamontuj próbkę między szkiełkiem szklanym a pokrywką, używając oleju immersyjnego jako medium montażowego. Zbadaj orientację włókien kolagenowych za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego, zaczynając od niskiego powiększenia od 5x do 10x.

Na koniec przygotować próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej w celu dalszej analizy granicy kości-biomateriał. Po dopracowaniu i wstępnym badaniu mikroskopią optyczną, cechy próbki wewnętrznej pozwoliły dopasować obszar zidentyfikowany mikroskopią świetlną do odpowiedniej lokalizacji w zbiorze mikrotomografii komputerowej. Mikroskopia światła spolaryzowanego rozróżniła istniejące wcześniej kość, pokazaną na niebiesko, od nowo powstałej kości podczas gojenia, przedstawionej na pomarańczowo.

Mikroskopia światła spolaryzowanego o wyższym powiększeniu wykazała interfejs, na którym kość rosła w przeciwieństwie istniejącej kości korowej, z włóknami kolagenu typu I ustawionymi prostopadle w cienkim obszarze. Obrazowanie mikroskopią elektronową skaningową umożliwiało precyzyjną lokalizację obszarów zainteresowania. Objętość wybranego regionu została dalej zbadana za pomocą tomografii slice-and-view.

Na powierzchni rowu widniała morfologia kości rosnącej trawbekuli. Transmisyjna mikroskopia elektronowa umożliwia badanie granicy kości-biomateriał w skali nano, które można łączyć z wybraną dyfrakcją elektronów. Wybrane wzorce dyfrakcji elektronów obszarowych wskazywały, że zarówno region biomateriału, jak i region kości składały się z kryształów hydroksyapatytu.

Mapowanie spektroskopii rentgenowskiej dyspersyjnej w obrazowanym obszarze interfejsu wykazało fosfor i wapń. Ten wielomodalny przepływ pracy dostarcza uzupełniających się wglądów, których nie da się uzyskać pojedynczą techniką obrazowania. Ten proces wymaga znacznego czasu, wiedzy technicznej oraz dostępu do specjalistycznych instrumentów.

Może badać korelacje funkcjonalne, długoterminową remodelację kości oraz projektowanie biomateriałów.