Name: Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj multimodalny protokół analizy regeneracji kości i interfejsu kość-biomateriał. Metoda integruje mikroskopię świetlną, SEM, TEM i EDS do oceny osteointegracji na wielu skalach hierarchicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana grantami dla autorów od następujących brazylijskich agencji: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazylia) oraz Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Dziękujemy LABNANO/CBPF oraz CENABIO/UFRJ za możliwości mikroskopii elektronowej. Udoskonalanie języka i poprawki gramatyki przeprowadzono za pomocą ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Wszystkie poprawki zostały przejrzane i zweryfikowane przez autorów.

<ol><li>Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+hierarchical+structure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Bone hierarchical structure in three dimensions.</a> Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).</li>
<li>Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+of+bone+in+three+dimensions%3A+A+twist+of+twists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%3A+X%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists.</a> J Str Biol: X. 6, (2022).</li>
<li>Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+bone+meets+implant%3A+The+characterization+of+nano-osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration.</a> Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).</li>
<li>Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+fracture+and+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inflammation, fracture and bone repair.</a> Bone. 86, 119-130 (2016).</li>
<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osseointegration+and+current+interpretations+of+the+bone-implant+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface.</a> Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Sim, J. H., Yeo, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Analysis+of+Bone+Response+to+Implant+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Today%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces.</a> Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).</li>
<li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-trabecular+angle%3A+A+parameter+of+trabecular+bone+architecture+in+the+human+proximal+femur+that+reveals+underlying+topological+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs.</a> Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).</li>
<li>Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+microimaging+of+bone+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Hierarchical microimaging of bone structure and function.</a> Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).</li>
<li>Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+architecture+during+the+healing+process+of+a+tibial+diaphysis+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect.</a> Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).</li>
<li>Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossfibrillar+mineral+tessellation+in+normal+and+Hyp+mouse+bone+as+revealed+by+3D+FIB-SEM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy.</a> J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).</li>
<li>Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ellipsoidal+mesoscale+mineralization+pattern+in+human+cortical+bone+revealed+in+3D+by+plasma+focused+ion+beam+serial+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning.</a> J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).</li>
<li>Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+collagen+fibril+organization+in+rat+circumferential+lamellar+bone+using+a+dual+beam+electron+microscope+reveals+ordered+and+disordered+sub-lamellar+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures.</a> Bone. 52 (2), 676-683 (2013).</li>
<li>Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal-like+hierarchical+organization+of+bone+begins+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale.</a> Science. 360 (6388), 2189(2018).</li>
<li>Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+Bone%3A+Hierarchical+Features+from+Nanometer+to+Micrometer+Scale+Revealed+in+Focused+Ion+Beam+Sections+in+the+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM.</a> Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).</li>
<li>Micheletti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mineral+organization+at+the+mesoscale%3A+A+review+of+mineral+ellipsoids+in+bone+and+at+bone+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces.</a> Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).</li>
<li>Micheletti, C., Shah, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+hierarchical+organization+through+the+lens+of+materials+science%3A+Present+opportunities+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Rep%22%5BJournal%5D)">Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges.</a> Bone Rep. 22, (2024).</li>
<li>Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+scanning+electron+microscopy+of+bone-a+comprehensive+overview+of+the+important+discoveries+made+and+insights+gained+into+bone+material+properties+in+health%2C+disease%2C+and+taphonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy.</a> Bone Res. 7 (1), (2019).</li>
<li>Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+assess+bone+ultrastructure+organization%3A+Orientation+and+arrangement+of+mineralized+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Royal+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils.</a> J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).</li>
<li>Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+architecture+during+the+healing+process+of+a+tibial+diaphysis+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect.</a> Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).</li>
<li>Keklikoglou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+for+natural+history+specimens%3A+a+handbook+of+best+practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Taxonomy%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols.</a> Eur J Taxonomy. (522), (2019).</li>
<li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Meth+Primers%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy.</a> Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).</li>
<li>Costa De-Moraes, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphometric+and+microtomographic+evaluation+of+hydroxyapatite+coated+implants+and+L-PRF+in+over+drilled+bone+sites+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep.</a> Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).</li>
<li>Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+X-ray+micro-computed+tomography+imaging+for+the+microarchitecture+evaluation+of+porous+metallic+implants+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds.</a> Micron. 142, (2021).</li>
<li>Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Bone+Fracture+Healing+Using+Micro-Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography.</a> J Vis Exp. (190), e64262(2022).</li>
<li>Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT-based+finite+element+models+as+a+tool+for+virtual+testing+of+cortical+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Physics%22%5BJournal%5D)">MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone.</a> Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).</li>
<li>Shefelbine, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+fracture+callus+mechanical+properties+using+micro-CT+images+and+voxel-based+finite+element+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis.</a> Bone. 36 (3), 480-488 (2005).</li>
<li>O'Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).</li>
<li>Morgan, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+fracture+healing%3A+Relationships+among+callus+structure%2C+composition%2C+and+mechanical%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical.</a> Bone. 44 (2), 335-344 (2009).</li>
<li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-trabecular+angle%3A+A+parameter+of+trabecular+bone+architecture+in+the+human+proximal+femur+that+reveals+underlying+topological+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs.</a> Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).</li>
<li>Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZaborowska%2C+M+%22Bone+Repair+Biomater+Regenerat+Clin+Appl+Second+Edition%22">Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition</a>. , 447-466 (2018).</li>
<li>Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analytical+techniques+for+evaluation+of+osseointegrated+titanium+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants.</a> Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).</li>
<li>Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrotron+radiation+techniques+boost+the+research+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering.</a> Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).</li>
<li>Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-SEM+3D+analysis+of+mineralized+osteonal+bone%3A+lamellae+and+cement+sheath+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures.</a> Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).</li>
<li>McMahon, G., Malis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrotomy+of+nanocrystalline+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultramicrotomy of nanocrystalline materials.</a> Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).</li>
<li>Bassim, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+damage+during+FIB+sample+preparation+of+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials.</a> J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).</li>
<li>Witzke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Sample+Preparation+Using+Focused+Ion+Beam+and+Ultramicrotomy+of+Human+Dental+Enamel+and+Dentine+for+Multimicroscopic+Imaging+at+Micro-+and+Nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale.</a> Materials. 15 (9), 3084(2022).</li>
<li>Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+energy+dispersive+spectroscopy+in+transmission+scanning+electron+microscopy+with+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).</li>
<li>Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biointerfaces+in+three+dimensions%3A+electron+tomography+of+the+bone-hydroxyapatite+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Royal+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface.</a> J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).</li>
<li>Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+laser-modified+Ti6Al4V+and+bone+interface+revealed+with+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.

Zastosowano różne techniki obrazowania do badania architektury kości oraz oceny skuteczności biomateriałów w indukowaniu osteointegracji 7,21,22,23,24. W tym protokole ustaliliśmy workflow obejmujący mikrotomografię rentgenowską, mikroskopię optyczną oraz mikroskopię elektronową do analizy zmineralizowanej tkanki kostnej powstałej w wadze kości piszczelowej sz...

Kość to złożona, hierarchicznie zorganizowana tkanka 1,2. Zrozumienie jej struktury jest kluczowe dla rozstrzygnięcia fundamentalnych pytań dotyczących tego, jak komórki przyczyniają się do architektury tkanek oraz jak zmiany strukturalne wpływają na funkcje mechaniczne3. W tym kontekście remodelacja kości po urazie pozostaje centralnym tematem badań. Gojenje złamań to złożony, wieloetapowy proces, rozpoczynający się od początkowej reakcji zapalnej, następnie angiogenezy i różnicowania komórek progenitorowych na chondrocyty i osteoblasty 4,5. Wiele debat toczyło się na temat roli biomateriałów w stymulacji osteointegracji, szczególnie na temat biokompatybilności i ich zdolności do zapobiegania enkapsulacji włóknistej6.
Powszechnie stosowaną metodą oceny osteointegracji stymulowanej biomateriałem jest mikroskopia optyczna, która umożliwia zarówno analizy histologiczne ilościowe, jak i jakościowe. To podejście okazało się wiarygodnym i skutecznym sposobem oceny skuteczności implantów kostnych 7,8. Niemniej jednak, kilku zagadnień związanych z hierarchiczną organizacją kości nie może być zbadanych za pomocą jednej metody obrazowania3, szczególnie histologicznej, która jest przynajmniej częściowo ograniczona przez ograniczenie powiększenia metody.
Postępy w obrazowaniu trójwymiarowym okazały się niezbędne do zrozumienia hierarchicznej organizacji kości. Techniki takie jak tomografia mikrokomputerowa (microCT; promieniowanie synchrotronowe lub konwencjonalne laboratoryjne źródła rentgenowskie) 9,10,11, podwójna skaningowa mikroskopia elektronowa (FIB-SEM) związana z tomografią slice-and-view 12,13,14 oraz transmisyjną tomografia elektronowa15,16 dostarczyły nowych informacji o architekturze kości w wielu łuski.
Na podstawie różnych podejść do obrazowania 3D zaproponowano model hierarchicznej organizacji kości, który początkowo zidentyfikował dziewięć odrębnych poziomów struktury kości1. Ten schemat został niedawno zrewidowany i rozszerzony o około 12 poziomów hierarchicznych, służąc jako cenne źródło do badania relacji między strukturą a funkcją tkanki kostnej 2,17. Co ważne, proponowany model hierarchiczny stanowi podstawę do oceny skuteczności naprawy kości po urazie. Ocena, czy zregenerowana tkanka kostna odtwarza rodzimą strukturę hierarchiczną, jest kluczowym standardem przy ocenie jakości gojenia kości, szczególnie gdy w uszkodzonym miejscu stosuje się biomateriały.
Chociaż omówiono wykorzystanie wielu technik obrazowania do badania organizacji kości 6,7,18,19,20, niewiele zostało zbadane na temat workflow integrującego różne metody obrazowania w celu oceny organizacji minerałów kości na wielu skalach przestrzennych. Jak wspomniano, kość to złożona tkanka kompozytowa, składająca się z fazy organicznej (komórek, kolagenu i makrocząsteczek) oraz zmineralizowanej macierzycy. Z perspektywy przygotowania próbki ta złożoność wiąże się z wyzwaniami technicznymi dotyczącymi przenikania rozpuszczalnika przez próbkę, przekroju twardego preparatu oraz integracji różnych strategii obrazowania na tej samej próbce.
Kluczową innowacją w tych pracach jest ustanowienie powtarzalnego, korelacyjnego i wieloskalowego workflow obrazowania wykorzystującego obrazowanie trójwymiarowe oraz techniki komplementarne. Jak pokazano na rysunku 1A, workflow został zaprojektowany tak, aby ta sama próbka mogła być sekwencyjnie badana przy użyciu różnych metod obrazowania. Ponieważ niektóre z tych technik są destrukcyjne lub wymagają cięcia na części, proces pracy podąża za kolejnością zaczynającą się od metod niedestrukcyjnych, a następnie przechodząc do metod obejmujących cięcie lub usuwanie materiałów.
Ten proces przygotowania i analizy próbek jest szeroko stosowany do próbek twardych lub zmineralizowanych, w tym kości korowej i trabekularnej, rusztowań przedimplantacyjnych oraz oceny interfejsu kość i biomateriał po implantacji. Łącząc metody obrazowania obejmujące różne pola widzenia i zakresy rozdzielczości (Rysunek 1B), workflow umożliwia analizę próbek od skali centymetrowej aż po mikrometrową i nanometrową. Chociaż sekwencja jest zoptymalizowana do wspierania analizy korelacyjnej pojedynczej próbki, każda technika może być również stosowana niezależnie zgodnie z celem eksperymentalnym. Takie podejście umożliwia szczegółową ocenę osteointegracji biomateriałów oraz ocenę regenerowanego wzrostu kości w obszarze gojenia.

<table><tbody><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder aluminiowy</td><td>domowej roboty</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Avizo wersja 2022.1</td><td>ThermoFisher</td><td>Nie ma</td><td>oprogramowanie do filtrowania obrazów, segmentacji i wizualizacji 3D</td></tr><tr><td>Kwas kakodylowy, sól sodowa, trihydrat</td><td>Ted Pella</td><td>18851</td><td>proszek do buforu Cacodylate. Przygotuj roztwór zapasowy 0,2 M</td></tr><tr><td>Pasta do polerowania diamentów 3 & mikro; rozmiar m</td><td>Ted Pella</td><td>895-8</td><td></td></tr><tr><td>Pasta do polerowania diamentów 6 & mikro; rozmiar m</td><td>Ted Pella</td><td>895-9</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowe koło x.006</td><td>South Bay Technology</td><td>DWH 3063</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowe koło x.012</td><td>South Bay Technology</td><td>DWH 4122</td><td></td></tr><tr><td>Filcowa tkanina polerska</td><td>Ted Pella</td><td>816-20</td><td></td></tr><tr><td>Kapsuły z płaskim osadzeniem</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pokrywa</td><td>Knittel</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td>Knittel</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, 25% stężenia EM</td><td>Ted Pella</td><td>18426/18427</td><td></td></tr><tr><td>Złoty sputter K550X</td><td>EMITECH</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH)</td><td></td><td>oprogramowanie do aligacji obrazów, filtrowania, segmentacji i wizualizacji 3D</td></tr><tr><td>IMOD wersja 5.1</td><td>Uniwersytet Kolorado</td><td></td><td>oprogramowanie do alignmentu obrazów, segmentacji i wizualizacji 3D</td></tr><tr><td>Maszyna do polerowania Lapping e</td><td>South Bay Technology</td><td>Model 910</td><td></td></tr><tr><td>Piła diamentowa z niskimi prędkościami&nbsp;</td><td>South Bay Technology</td><td>Model 650</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do osadzania o niskiej lepkości</td><td>EMS</td><td>14300</td><td>zestaw do żywicy SPURR. Przygotować się zgodnie ze specyfikacjami karty technicznej;</td></tr><tr><td>Micro-CT Skyscan 1273&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Jeol 2100F 200kV&nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Tescan Lyra3</td><td>Tescan</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axioplan</td><td>Zeiss</td><td>Nie ma</td><td>wyposażona w płytę lambda pierwszego rzędu</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, stopień EM</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Proszek do roztworu formacji formaldehydu. Przygotuj roztwór buljowy o stężeniu 16%</td></tr><tr><td>Plastikowy zamek</td><td>Exakt</td><td>41500</td><td></td></tr><tr><td>Wosk montażowy QuickStick 135</td><td>South Bay Technology</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Papiery ścierne&nbsp; Rozmiary ziarnistości 1200</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Papiery ścierne&nbsp; Rozmiary ziarnistości 2500</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Papiery ścierne&nbsp; Rozmiary ziarnistości 4100</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Płyn rozpuszczalny w wodzie & nbsp;</td><td>South Bay Technology</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtrujący Whatmann klasy 1</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Multimodal Approach to Assess Bone Regeneration and Scaffold Performance

Kliniczny sukces implantu w dużej mierze zależy od jego zdolności do wspierania naprawy kości i ułatwiania osteointegracji. Chociaż poczyniono znaczące postępy w projektowaniu nowych rusztowań, dokładna ocena skuteczności implantów na różnych skalach długości kości nie została wystarczająco zbadana. Kość to hierarchicznie zorganizowana tkanka, o złożonej strukturze, obejmującej od organizacji włókien kolagenowych i ich mineralizacji na nanometrach i mikrometrach po makroskopowy układ kości zwartej i gębczastej. Ta hierarchiczna organizacja jest kluczowa dla zapewnienia funkcji kości i sprawności mechanicznej. W tym kontekście kompleksowa ocena wpływu biomateriałów na naprawę kości na wielu skalach długości jest niezbędna do oceny skuteczności i bezpieczeństwa wszczepionych materiałów. Jednak przygotowanie próbek do zintegrowanych analiz multimodalnych stanowi wyzwanie techniczne. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół mający na celu ocenę regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych oraz analizę interfejsu między nowo powstałą kością a wszczepionym rusztowaniem. Takie podejście stanowi solidną metodę oceny skuteczności rusztowań w indukowaniu naprawy kości. Połączenie wybranych technik obrazowania 3D i 2D jest kluczowe dla właściwej oceny złożonej tkanki mineralizowanej powstającej podczas procesu gojenia kości

Początkowa analiza próbek w żywicy przeprowadza się za pomocą tomografii mikrokomputerowej (microCT). Ta technika nieniszcząca umożliwia wizualizację 3D całego obszaru defektu, umożliwiając zarówno analizy ilościowe, jak i jakościowe próbki. Kontrast w obrazowaniu mikroCT wynika głównie z różnic gęstości materiałów obecnych w próbce. Rysunek 1 ilustruje analizę mikroCT niekrytycznego defektu w kości piszczelowej szczura, który został wszczepiony biomateriałem CHA37. Próbka została pobrana 12...

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

The clinical success of an implant largely depends on its ability to promote bone repair and facilitate osteointegration. While significant advancements ...

Nasze badania oceniają, jak różne biomateriały wpływały na architekturę kości podczas procesu regeneracji. Regeneracja kości wymaga wieloskalowej oceny, ponieważ jest hierarchicznie zorganizowana w tkance. Protokół ten umożliwia analizę próbki na różnych skalach.Na początek przymocuj w żywicy, piszczelową z wszczepionym biomateriałem do uchwytu na próbkę i przymocuj ją do ramienia instrumentu. Ukierunkuj próbkę zgodnie z pożądanym kierunkiem przekroju. Pobierz niskoobrotowy diamentowy dysk do piły, aby podzielić kość na około 0,7 milimetra kawałki.Napełnij zbiornik cieczy tak, aż poziom płynu całkowicie zakryje dolną krawędź łopatki. Upewnij się, że próbka jest stabilna i poziomo wyrównana z powierzchnią dysku. Reguluj pozycję próbki za pomocą pokręteł pozycjonujących, aż docelowy obszar cięcia będzie wyrównany z ostrzem.Rozpocznij cięcie próbki na wyższym ustawieniu i stosuj niskie ciśnienie, aż powstanie wgłębienie. Następnie zmniejsz prędkość, aby gładko zakończyć cięcie i zminimalizować drgania. Zatrzymaj piłę natychmiast po zakończeniu cięcia.Następnie zbadać wyciętą próbkę za pomocą mikroskopu stereo do montażu. Do montażu użyj domowego zespołu składającego się z wewnętrznego cylindra ze stali nierdzewnej oraz zewnętrznego pustego cylindra, który zapewnia mechaniczne wsparcie podczas polerowania. Następnie umieść wewnętrzny cylinder na grzewczej płycie i podgrzej go do około 120 do 140 stopni Celsjusza.Wybierz odpowiedni wosk i nałóż niewielką ilość wosku na powierzchnię podgrzanego cylindra, pozwól mu całkowicie się roztopić. Następnie umieść próbkę tak, aby powierzchnia była skierowana do dołu na powierzchnię pokrytą woskiem i delikatnie dociskając próbkę, aby zapewnić pełny kontakt z roztopionym woskiem. Następnie zdejmij aluminiowy cylinder z płyty grzewczej i pozwól wosku zastygnąć w temperaturze pokojowej.Do polerowania grubego i pośredniego wybierz papier ścierny o grubości 1, 200, 2, 500 i 4 100, aby zmniejszyć grubość próbki do około 0,15 milimetra. Zacznij od 1 papieru ściernego o ziarnistości 200, a następnie od 2 papierów o granulacji 500, przy lekkim nacisku. Okresowo monitoruj grubość próbki podczas polerowania za pomocą mikroskopii odbicia.Po osiągnięciu docelowej grubości poleruj obie strony próbki papierem ściernym o ziarnistości 4 o ziarnistości 100. Podczas każdego etapu polerowania nieustannie czyść próbkę wodą destylowaną. Do końcowego polerowania wybierz pastę diamentową o rozmiarze cząstek sześciu lub trzech mikrometrów, w zależności od chropowatości powierzchni próbki.Nałóż niewielką ilość pasty diamentowej na filcową ściereczkę do polerowania, zamontowaną na tarczy polerskiej, i poleruj próbkę. Aby odłączyć próbkę od cylindra, podgrzej wosk na gorącej płycie. Po wyjęciu jednostki z płyty grzewczej, pobierz próbkę z cylindra.Następnie delikatnie poleruj obie strony próbki przy minimalnym nacisku i wysusz wypolerowaną powierzchnię papierem filtracyjnym. Przed analizą mikroskopową zamontuj próbkę między szkiełkiem szklanym a pokrywką, używając oleju immersyjnego jako medium montażowego. Zbadaj orientację włókien kolagenowych za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego, zaczynając od niskiego powiększenia od 5x do 10x.Na koniec przygotować próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej w celu dalszej analizy granicy kości-biomateriał. Po dopracowaniu i wstępnym badaniu mikroskopią optyczną, cechy próbki wewnętrznej pozwoliły dopasować obszar zidentyfikowany mikroskopią świetlną do odpowiedniej lokalizacji w zbiorze mikrotomografii komputerowej. Mikroskopia światła spolaryzowanego rozróżniła istniejące wcześniej kość, pokazaną na niebiesko, od nowo powstałej kości podczas gojenia, przedstawionej na pomarańczowo.Mikroskopia światła spolaryzowanego o wyższym powiększeniu wykazała interfejs, na którym kość rosła w przeciwieństwie istniejącej kości korowej, z włóknami kolagenu typu I ustawionymi prostopadle w cienkim obszarze. Obrazowanie mikroskopią elektronową skaningową umożliwiało precyzyjną lokalizację obszarów zainteresowania. Objętość wybranego regionu została dalej zbadana za pomocą tomografii slice-and-view.Na powierzchni rowu widniała morfologia kości rosnącej trawbekuli. Transmisyjna mikroskopia elektronowa umożliwia badanie granicy kości-biomateriał w skali nano, które można łączyć z wybraną dyfrakcją elektronów. Wybrane wzorce dyfrakcji elektronów obszarowych wskazywały, że zarówno region biomateriału, jak i region kości składały się z kryształów hydroksyapatytu.Mapowanie spektroskopii rentgenowskiej dyspersyjnej w obrazowanym obszarze interfejsu wykazało fosfor i wapń. Ten wielomodalny przepływ pracy dostarcza uzupełniających się wglądów, których nie da się uzyskać pojedynczą techniką obrazowania. Ten proces wymaga znacznego czasu, wiedzy technicznej oraz dostępu do specjalistycznych instrumentów.Może badać korelacje funkcjonalne, długoterminową remodelację kości oraz projektowanie biomateriałów.

multimodal-approach-to-assess-bone-regeneration-scaffold

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Poznaj multimodalny protokół analizy regeneracji kości i interfejsu kość-biomateriał. Metoda integruje mikroskopię świetlną, SEM, TEM i EDS do oceny osteointegracji na wielu skalach hierarchicznych.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Przeglądaj więcej filmów