Name: Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę LC-MS/MS do ilościowej identyfikacji winkrystyny w komórkach pierwotnych ALL. To podejście umożliwia precyzyjne monitorowanie akumulacji leku i optymalizację terapii u dzieci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centro Infantil Boldrini oraz wszystkim pacjentom, którzy przekazali swoje próbki do badania. Adrielli C. Soares otrzymał stypendium od Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) oraz od São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2023/18389-3). José A. Yunes otrzymał stypendium produktywności od National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Prace te były wspierane przez badania z brazylijskiego Ministerstwa Zdrowia w ramach programu PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Próbki białaczki użyte w tym badaniu pochodzą z biobankowanych fiolek pacjentów leczonych w Centro Infantil Boldrini, którzy zezwolili na wykorzystanie swoich komórek na podstawie formularza świadomej zgody. Projekt został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytucjonalnej (CAAE 34601120.7.0000.5376). Protokoły generowania PDX u zwierząt były realizowane zgodnie z przepisami i wytycznymi etycznymi Komitetu Etyki Zwierząt (Comissão de Ética no Uso de Animais) Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).
1. Przygotowanie próbki i inkubacja leków (dzień 1)
<ol>
	<li>Przygotowanie zapasów i roztwory robocze<ol>
		<li>Waż 2,5 mg siarczanu winkrystyny (masa cząsteczkowa: 923 g/mol) i rozpuszcza go w 2,0 mL dimetylosulfoklenku (DMSO) w mikrorurce o pojemności 2,0 mL, aby przygotować roztwór wywarowy o pojemności 1,354 mM. Wir aż do całkowitego rozpuszczenia. UWAGA: DMSO to drażniące; Noś rękawiczki i obsługiwać to w okapu z chemicznym oparem.</li>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy o pojemności 100 μM, mieszając 147,71 μL roztworu zapasowego magnetowida z 1 852,28 μL DMSO w mikrorurce 2,0 mL. Dokładnie przeszukaj wir.</li>
		<li>Rozprowadz 500 μL roztworu roboczego do czterech mikrorurek po 0,6 mL i przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Unikaj rozmrażania aliquotów więcej niż trzy razy.</li>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy o zawartości winblastyny (VINB) o zawartości 100 μM, mieszając 181,81 μL roztworu zapasowego o pojemności 1,1 mM (siarczan winblastyny 1 mg/mL, masa cząsteczkowa: 909,07 g/mol) z 1 818,19 μL sterylnej wody ultraczystej w mikrorurce o pojemności 2,0 mL. Wiruj, aż będą jednorodne.</li>
		<li>Zachowaj rozwiązanie działające VINB w taki sam sposób, jak zrobione z magnetowidami.</li>
		<li>Przygotuj roztwór VINB metanolu + 0,1 μM, mieszając 49,95 mL metanolu z 50 μL roztworu roboczego VINB w probówce o pojemności 50 mL. Wiruj, aż będą jednorodne. Przechowuj ją w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy. UWAGA: Metanol jest toksyczny i łatwopalny; Obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochronnym w okapie wyparowym.</li>
		<li>Przygotuj wodę + 0,1% roztwór kwasu mrówkowego, mieszając 49,95 mL wody ultraczystej z 50 μL kwasu mrówkowego w probówce o pojemności 50 mL. Dobrze wiruj. Przechowuj w temperaturze pokojowej (RT). UWAGA: Kwas mrówkowy jest żrący; Obchodzić się z rękawicami i ochroną oczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie i płukanie komórek pierwotnych<ol>
		<li>Próbki komórek kriokonserwowanych rozmrażać poprzez delikatne mieszanie fiolki w zlewce zawierającej 15 mL wody destylowanej 37 °C, aż do całkowitego rozmrozzenia. UWAGA: Informacje dotyczące protokołów pobierania i zamrażania komórek można znaleźć w poprzednich publikacjach 9,10.</li>
		<li>Przelej zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 50 mL zawierającej 10-15 ml sterylnego 1x PBS za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Wirówka na 300 × g przez 5 minut w RT.</li>
		<li>Odrzuć supernatant, odwracając rurkę.</li>
		<li>Ponownie zawiesij granulkę w 10 mL medium AIM V za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Liczyć żywotne komórki i mierzyć średni rozmiar komórek za pomocą automatycznego licznika. UWAGA: Zaleca się stosowanie komórek, które wykazują co najmniej 80% żywotności względem całkowitej liczby pobranych komórek.</li>
		<li>Oblicz objętość potrzebną do zebrania 2,5 × 10 6 żywotnych komórek, stosując prostą proporcję opartą na zmierzonym stężeniu. Na przykład, jeśli stężenie wynosi 5 × 106 komórek/mL, wymagana objętość wynosi 0,5 mL. UWAGA: Wykonaj każde leczenie w trzech egzemplarzach dla powtarzalności danych. Zachowaj średni rozmiar komórek dostępnych w automatycznym liczniku komórek; Użyj go do obliczenia objętości komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Układ leczenia uzależnień<ol>
		<li>Oblicz objętość roztworu roboczego magnetowidu, która jest potrzebna do osiągnięcia końcowego stężenia 1 μM przy całkowitej objętości 2,0 mL. Przed pipetowaniem odłóż roztwór w formie vortex.</li>
		<li>Dodaj medium AIM V, następnie 2,5 × 106 ogniw, a na końcu roztwór magnetowida do mikrorurki 2,0 mL. Krótko zawij i lekko się obróć (5 s), aby zebrać płyn z nakrętki rurki.</li>
		<li>Inkubuj otwarte rurki w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 3 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji zamknąć pokrywki i wirować próbki w 300 × g przez 5 minut w RT.</li>
		<li>Ostrożnie odrzuć supernatant pipetą, a następnie dodaj 1 mL PBS przy RT do rurki.</li>
		<li>Powtarzaj wirowanie przy 300 × g przez 5 minut w RT, usuwam supernatant i płucz PBS jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy płukania.</li>
		<li>Ostrożnie usuń cały supernatant pipetą, ponownie zawiesz granulat w 100 μL PBS i wiruj, aż granulek zostanie całkowicie zawieszony.</li>
		<li>Dodaj 400 μL zimnego metanolu + 0,1 μM winbłastynu (-20 °C) bezpośrednio do próbki, unikając kontaktu ze ściankami probówki.</li>
		<li>Przechowuj próbki na noc w temperaturze -80 °C. UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni (bezpieczny zastawk).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbek dla LC-MS/MS (dzień 2)
<ol>
	<li>Ekstrakcja próbki<ol>
		<li>Przed wyjęciem próbek z zamrażarki o temperaturze -80 °C schłodź wirówkę do 4 °C.</li>
		<li>Bezpośrednio po wyjęciu próbek z zamrażarki wiruj je w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przelej 300 μL supernatantu do mikrorurki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Próbki całkowicie wysusz za pomocą koncentratora próżniowego w temperaturze 40-45 °C przez 1 godzinę i 40 minut. UWAGA: Suszone pellety można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni (bezpieczny zastawk).</li>
		<li>Każdą granulkę ponownie zawiesić w 400 μL wody + 0,1% kwasu mrówkowego (wcześniej przygotowanym). Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Ponownie wiruj próbki w 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przelej 300 μL supernatantu do fiolki z zakrętką 2,0 mL do analizy LC-MS/MS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja LC-MS/MS i akwizycja danych
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy komórkowej i kondycjonowanie kolumny<ol>
		<li>Przygotuj rozpuszczalnik A, mieszając wodę ultraczystą z kwasem mrówkowym o stężeniu 0,1%.</li>
		<li>Przygotuj rozpuszczalnik B, mieszając acetonitryl z kwasem mrówkowym 0,1%. UWAGA: Acetonitryl jest toksyczny i łatwopalny; Uchwyt w okapie chemicznym.</li>
		<li>Każdy rozpuszczalnik przeprowadzić sonikiem do kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut. Podłącz butelki do modułu pompy i przepłukaj system z dużym przepływem, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Zamontować kolumnę BEH C18 o odwróconej fazie (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm). UWAGA: Do przeprowadzenia analizy w tym badaniu użyto systemu chromatograficznego klasy Acquity H-Class sprzężonego z potrójnym spektrometrem mas Xevo TQS-Micro.</li>
		<li>Użyj binarnego gradientu złożonego z rozpuszczalników A i B, oba wcześniej przygotowane.</li>
		<li>Przeprowadź gradient chromatograficzny od 5% do 95% rozpuszczalnika B przez pierwsze 2 minuty, a następnie 2 minuty rozpuszczalnika A do płukania kolumny i ponownego wyważenia.</li>
		<li>Ustaw przepływ na 0,2 mL/min przez cały 4-minutowy bieg. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 40 °C i wstrzykuj 10 μL każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja metody LC-MS/MS<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie LC-MS/MS. Kliknij Plik > Nowa > metoda MS , aby rozpocząć nową metodę.</li>
		<li>Przejdź do zakładki Funkcja i ustaw typ funkcji na monitorowanie wielokrotnych reakcji (MRM). Wprowadź przejścia jonowe i parametry wymienione w Tabeli 1 dla magnetowida i VINB (standard wewnętrzny).</li>
		<li>Ustaw czas nabycia na 4 minuty. Kliknij Aplikuj , aby zapisać. UWAGA: Nie przekraczaj 4 minut, aby zapewnić równowagę kolumny między iniekcjami.</li>
		<li>Konfiguruj parametry UHPLC w Inlet Method > Edytuj LC Method i zapisz jako plik .mth (Tabela 2).</li>
		<li>Ustaw parametry źródłowe w zakładce Tune zgodnie z Tabelą 3. Zapisz jako plik .tun.</li>
		<li>Zapisz pełną metodę: Plikuj > Zapisz jako i eksportuj jako plik .mth.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie listy próbek i rozpoczęcie biegu<ol>
		<li>Na ekranie głównym oprogramowania otwórz Listę próbek i stwórz listę z nazwami próbek, objętościami do zastrzyków, pozycjami fiolek oraz metodą do użycia.</li>
		<li>Włóż fiolkę z wodą ultraczystą do tacy autosamplera i oznacz ją jako pustą. Używaj pustego zaszczepienia między każdym zestawem potrójnych zastrzyków, aby uniknąć przeniesienia się. UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że ciśnienie w kolumnie (ΔP) jest stabilne i niższe niż 10 psi.</li>
		<li>Wybierz pożądane wiersze w Liście Przykładów i kliknij Uruchom > OK , aby rozpocząć akwizycję danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Wizualizacja i eksport danych<ol>
		<li>Po zakończeniu przebiegu obejrzyj chromatogramy, wybierając próbkę i klikając Chromatogram w górnym menu pasku.</li>
		<li>Na ekranie głównym kliknij TargetLynx, wybierz właśnie uruchomione pliki i kliknij Przetwarzaj > Wybierz metodę winkrystyny > OK, aby wygenerować tabele wyjściowe.</li>
		<li>Kliknij Raport > Eksport tabeli i zapisz przetworzone dane jako plik .csv lub .xlsx. UWAGA: Eksportuj surowe obszary szczytowe zarówno dla analitu, jak i standardu wewnętrznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Organizacja danych i obliczanie stosunków<ol>
		<li>Otwórz wyeksportowany plik i utwórz następujące kolumny:<ol>
			<li>Próbka: Dodaj nazwę próbki lub fiolki.</li>
			<li>Run: Wskaz, do której replikacji odpowiada ta wartość.</li>
			<li>Obszar magnetowidu: Wprowadź obszar poniżej szczytu dla winkrystyny.</li>
			<li>Obszar VINB: Wprowadź obszar poniżej szczytu dla winblastyny.</li>
			<li>Stosunek VCR/VINB: Normalizuj każdą wartość magnetowidu, dzieląc ją przez odpowiadającą jej wartość VINB.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodaj kolumny dla wartości odchylenia standardowego: powierzchni magnetowidu VCR, obszaru VINB oraz stosunku VCR/VINB dla każdego zestawu potrójnego. UWAGA: Normalizacja z użyciem wewnętrznego standardu pozwala na korektę zmienności w objętości ekstrakcji lub wtrysku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyniki wykresów<ol>
		<li>Otwórz preferowane oprogramowanie do grafowania i wybierz format Grupowanej Tabeli .</li>
		<li>Wybierz Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli, a w Opcje wybierz Wprowadź 3 wartości w podkolumnach obok siebie.</li>
		<li>Dla każdej próbki należy wykreślić tylko znormalizowane stosunki VCR/VINB, pomijając surowe wartości powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Dokładna ocena poziomu leków wewnątrzkomórkowych w komórkach pierwotnej białaczki jest kluczowa dla zrozumienia obsługi leków na poziomie komórkowym oraz wspierania rozwoju testów funkcjonalnych uzupełniających profilowanie molekularne. Istniejące podejścia analityczne często wymagają dużej liczby komórek, obejmują długie etapy przetwarzania lub opierają się na pośrednich odczytach, które nie odzwierciedlają rzeczywistej dostępności środków chemioterapeutycznych wewnątrzkomórkowych 5,6<...

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) odpowiada za około 25% wszystkich nowotworów dziecięcych i pozostaje najczęstszym nowotworem u dzieci 1,2. Chociaż postępy w terapii znacznie poprawiły wskaźniki przeżywalności, przekraczające obecnie 90% – biologiczna złożoność ALL nadal napędza wysiłki na rzecz opracowania narzędzi lepiej charakteryzujących chorobę na poziomie komórkowym3.
Alkaloidy vinca, szczególnie magnetowidy, są kluczowymi elementami WSZYSTKICH protokołów leczenia4. Ponieważ VCR wywiera swoje cytotoksyczne efekty wewnątrzkomórkowe, zrozumienie jego pobierania i gromadzenia w komórkach białaczkowych jest kluczowe dla badań dotyczących odpowiedzi na leki, farmakodynamiki i zachowań komórkowych w systemach ex vivo. Jednak większość dostępnych podejść do oceny poziomu leków wewnątrzkomórkowych opiera się na pomiarach pośrednich lub metodach półilościowych, co ogranicza powtarzalność i czułość 5,6,7.
Równolegle wiele badań nadal opiera się w dużej mierze na liniach komórkowych białaczki, które nie mają biologicznej heterogeniczności i klinicznego znaczenia komórek pierwotnych pochodzących od pacjentów. Próbki pierwotne często stanowią wyzwania, takie jak ograniczona liczba komórek, zmienna jakość próbek oraz konieczność stosowania wysoce czułych technik analitycznych zdolnych do wykrywaniazwiązków wewnątrzkomórkowych o niskiej ilości.
Chromatografia cieczowa – tandemomowa spektrometria mas (LC-MS/MS) zapewnia specyficzność i czułość niezbędne do precyzyjnego ilościowego określenia środków chemioterapeutycznych, jednak standaryzowane protokoły pomiaru wewnątrzkomórkowego magnetowidu bezpośrednio w komórkach białaczki pierwotnej pozostają rzadkie. Ustanowienie solidnych mikrometod zgodnych z ograniczonym materiałem pacjenta może ułatwić szeroki zakres zastosowań, w tym profilowanie farmakologiczne, ocenę interakcji lek-komórki oraz badania porównawcze między podtypami chorób lub stanami terapeutycznymi.
W tym protokole opisujemy rozwój i optymalizację mikrometody ilościowej ex vivo intrakomórkowej magnetowidy w komórkach pierwotnej białaczki z użyciem LC-MS/MS. Aby uzyskać wystarczający materiał do opracowania metody, próbki pacjentów zostały przeszczepione do niedoborczych myszy NSG w celu opracowania modeli PDX9. Po rozszerzeniu in vivo izolowano ludzkie komórki białaczki i kriokonserwowano10. Następnie zostały rozmrozzone, inkubowane w magnetowidzie, przemyte, zanalizowane i przeanalizowane przez LC-MS/MS w celu określenia poziomu leków wewnątrzkomórkowych.
Metoda ta oferuje kilka zalet: wymaga niewielkiej liczby komórek (2,5 miliona), jest czuła i szybka oraz kompatybilna z klinicznie istotnymi próbkami pierwotnymi. Ponieważ bezpośrednio mierzy zawartość leków wewnątrzkomórkowych, stanowi wiarygodne narzędzie ilościowe dla badaczy badających przyjmowanie leków, odpowiedzi komórkowe na chemiopeutyki lub inne kwestie farmakologiczne w nowotworach hematologicznych.
Ogólnie protokół ten rozszerza dostępny zestaw narzędzi analitycznych do badania ALL u dzieci i może być łatwo dostosowany do innych leków lub typów próbek, wspierając przyszłe badania nad biologią białaczki, zachowaniem leków oraz precyzyjną farmakologią.

<table><tbody><tr><td>2,0 mL fiolka z zakrętką</td><td>Przepływ</td><td>8-2400</td><td>Używany z szklanymi wkładkami ze sprężyną (5 x 29 mm) tej samej firmy (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>2,0 mL fiolka z zakrętką</td><td>Przepływ</td><td>8-2400</td><td>Używany z szklanymi wkładkami ze sprężyną (5 x 29 mm) tej samej firmy (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>System chromatograficzny Acquity UPLC Klasa H</td><td>Spółka Waters</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurka 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Spółka Waters</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy potrójny kwadrupolowy Xevo TQ-S micro</td><td>Spółka Waters</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator ultradźwiękowy</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>Winblastyna 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>Siarczan winblastyny</td></tr><tr><td>Winkrystyna</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych all przez lc-ms/ms

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

Ilościowe określenie winkrystyny wewnątrzkomórkowej (VCR) w pierwotnych pediatrycznych ostrych komórkach białaczki limfoblastycznej (ALL) jest niezbędne dla zrozumienia różnic specyficznych dla próbek w przyjmowaniu leków oraz do wsparcia badań eksperymentalnych z wykorzystaniem niedostępnych materiałów pacjentów. Przedstawiamy tutaj uprościoną mikrometodę LC-MS/MS, zoptymalizowaną specjalnie pod komórki pierwotne ALL uzyskane za pomocą ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX), odpowiadając na kluczowe wyzwania, takie jak ograniczona dostępność komórek, rozmiar małych komórek oraz potrzeba powtarzalnej regeneracji po wielu etapach mycia. Testy czasowe o długości od 1 do 5 godzin wykazały, że okres inkubacji 3 godzin daje najwyższe i najbardziej spójne poziomy wewnątrzkomórkowego magnetowidu, z mniejszą zmiennością między replikacjami. Optymalizacja metod wykazała również, że stosowanie 2,5 × 106 komórek na warunki poprawia odporność analityczną w porównaniu do 1 × 106 komórek, które wykazały większą dyspersję w powtarzanych eksperymentach. Dodatkowe istotne udoskonalenia obejmowały użycie zimnego metanolu w celu zwiększenia efektywności wytrącania białek oraz wprowadzenie wewnętrznego standardu monitorującego i minimalizującego zmienność proceduralną. Metoda umożliwia czułe i precyzyjne ilościowe określenie magnetowida wewnątrzkomórkowego w odpowiednich zakresach stężeń, chociaż najniższa testowana dawka (0,01 μM) nie była mierzalna po 3-godzinnej inkubacji. Ogólnie rzecz biorąc, ta mikrometoda zapewnia praktyczne, powtarzalne i skalowalne podejście do pomiaru magnetowidu wewnątrzkomórkowego w pierwotnych próbkach ALL. Jego projekt wspiera analizy porównawcze, walidację modeli ex vivo oraz przyszłe zastosowania metodologiczne mające na celu integrację wewnątrzkomórkowej ilościowej analizy leków w szerszych ocenach farmakologicznych.

Reprezentatywne wyniki chromatograficzne uzyskane po testach akumulacyjnych wewnątrzkomórkowych z użyciem pierwotnych WSZYSTKICH komórek PDX inkubowanych z VCR i VINB przedstawiono na Rysunku 1. Próbki przygotowywano przy użyciu 2,5 × 106 komórek na warunki. W opisanych warunkach chromatograficznych magnetowid był konsekwentnie utrzymywany przez 2,85 minuty przy minimalnym efekcie macierzowym, a kształt szczytu był symetryczny i dobrze rozdzielony. Profile te ilustrują oczekiwane ...

Protokół ten miał na celu ustanowienie i optymalizację metody LC-MS/MS do względnej ilościowej ilościowej akumulacji winkrystyny w pierwotnych komórkach WSZYSTKICH dzieci u dzieci.

Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

Naszym celem jest pomiar winkrystyny wewnątrzkomórkowej w próbkach istotnych dla celów klinicznych oraz badanie interakcji między komórkami leków. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest optymalizacja czasu inkubacji w różnych modelach. Dodatkowo, modelowe dostosowanie leków ogranicza odporność, zwłaszcza w próbach pierwotnych pacjentów.Na początek rozmroz próbkę komórki kriokonserwowanej, delikatnie mieszając fiolkę w zlewce zawierającej 15 mililitrów wody destylowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż zawartość zostanie całkowicie rozmrozona. Przelej zawartość fiolki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 15 mililitrów sterylnego 1X PBS za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Włóż probówkę do wirówki ustawionej na 300G na pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu odrzuć supernatant, odwracając rurkę jednym płynnym ruchem. Teraz ponownie zawiesz granulkę ogniwa w 10 mililitrach AIM V Medium za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Licz żywotne komórki za pomocą automatycznego licznika i mierz średni rozmiar komórek.Oblicz objętość potrzebną do uzyskania 2,5 razy 10 do mocy sześciu żywotnych komórek, używając prostej proporcji opartej na zmierzonym stężeniu komórek. Vortex roztwór wincristyny dobrze przed użyciem. Dodaj medium AIM V do mikrorurki o pojemności dwóch mililitrów, następnie 2,5 razy 10 do mocy sześciu ogniw, a następnie dodaj wymaganą objętość roztworu winkrystyny.Krótko zawiruj i obróć rurkę przez pięć sekund, aby zebrać płyn z korekci. Następnie inkubuj otwarte mikrorurki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Po inkubacji zamknij pokrywki probówek i wiruj próbki w temperaturze 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odrzuć supernatant pipetą. Następnie dodaj do rurki jeden mililitr PBS w temperaturze pokojowej. Po powtórzeniu wirowania i mycia ostrożnie usuń cały pozostały supernatant pipetą.ponownie zawiesz pellet w 100 mikrolitrach PBS i wiru, aż pelet zostanie całkowicie zawieszony. Teraz dodaj 400 mikrolitrów zimnego metanolu zawierającego 0,1 mikromolowego winblastynu przy minus 20 stopniach Celsjusza bezpośrednio do próbki, unikając kontaktu ze ścianami rurki. Przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.Przed wyjęciem próbek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza schłodź wirówkę do czterech stopni Celsjusza. Zaraz po wyjęciu próbek z zamrażarki wiruj je w temperaturze 13 000G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przelej 300 mikrolitrów supernatantu do mikrorurki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety.Próbki całkowicie wysusz, umieszczając je w koncentratorze próżniowym ustawionym na 45 stopni Celsjusza na godzinę i 40 minut. Po wysuszeniu ponownie zawiesz każdy pellet w 400 mikrolitrach wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego za pomocą pipety. Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozpuści.Teraz ponownie wiruj próbki w temperaturze 13 000G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej 300 mikrolitrów supernatantu do fiolki z zakrętką na dwa mililitry do analizy chromatografii cieczowej w tandemowej spektrometrii mas. Na ekranie głównym oprogramowania otwórz listę próbek i stwórz nową, wpisując nazwy próbek, objętości zastrzyków, pozycje fiolek oraz metodę, którą mają zastosować.Włóż fiolkę z ultraczystą wodą do tacy autosamplera i oznaczyj ją jako pustą w liście próbek. Używaj pustego zaszczepienia między każdym zestawem potrójnych zastrzyków, aby uniknąć przeniesienia się. Wybierz pożądane wiersze z listy próbek i rozpocznij akwizycję danych, klikając "uruchom" i potwierdzając za pomocą OK. Po zakończeniu testu wybierz próbkę z wyników i obejrzyj chromatogramy, klikając chromatogram w górnym menu pasku.Na koniec, na ekranie głównym, kliknij docelowe linki. Wybierz pliki, które właśnie się uruchomiły, i kliknij "przetworz". Wybierz metodę winkrystyny i kliknij OK, aby wygenerować tabele wyjściowe.Analiza chromatograficzna pierwotnych komórek ksenotransplantatowych pochodzących od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną, inkubowanych jednym mikromolowym winkrystyną przez trzy godziny, konsekwentnie wykazała symetryczny i dobrze rozdzielony szczyt magnetowidu po 2,85 minuty, potwierdzając odpowiednie retencje i minimalną interferencję macierzową. Krzywe kalibracyjne winkrystyny wygenerowane w AIM V Media wykazały silną liniowość w stężeniach od 0,001 do 10 mikromolowych. Podobnie, gdy dwa razy 10 do potęgi sześciu RS4; Dodano 11 komórek, zaobserwowano liniową odpowiedź od 0,01 do jednego mikrotrzonowca.Analiza przebiegu czasu nagromadzenia winkrystyny wykazała, że RS4; 11 komórek wykazało plateau w stosunku winkristyny w stosunku winblazyny między dwiema a trzema godzinami z umiarkowanym wzrostem po czterech i pięciu godzinach, podczas gdy pierwotne komórki PDX osiągnęły szczyt po dwóch godzinach i potem spadły, co wspiera wybór trzech godzin jako zrównoważonego czasu inkubacji. Znormalizowane nagromadzenie winkrystyny różniło się w sześciu próbkach pacjentów z PDX, a zaobserwowano dodatnią korelację między nieznormalizowaną winkrystyną przez proporcje winblistyny a średnią objętością komórek. Analiza fragmentacji potwierdziła, że szczyt bazowy winkrystyny odpowiadał jonowi prekursorowi przy stosunku ładunku głównego 413,38, co generowało jon ilościowy na poziomie 392,47 oraz jon potwierdzający na poziomie 383,38 przy energii stożka 40 woltów i energii kolizji 16 woltów.Nasz protokół przezwycięża ograniczenia podejść pośrednich, umożliwiając bezpośrednie i czułe pomiary leków wewnątrzkomórkowych głównie w komórkach białaczki. Nasze podejście ułatwia bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowej winkrystyny, nawet jeśli liczba głosów komórkowych jest niska. W przyszłości zbadamy, czy różnice w akumulacji leków wewnątrzkomórkowych są związane z opornością in vitro oraz zbadamy powiązane mechanizmy.

development-standardization-an-ex-vivo-micromethod-for-intracellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Poznaj metodę LC-MS/MS do ilościowej identyfikacji winkrystyny w komórkach pierwotnych ALL. To podejście umożliwia precyzyjne monitorowanie akumulacji leku i optymalizację terapii u dzieci.

Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS

Przeglądaj więcej filmów