Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS

Naszym celem jest pomiar winkrystyny wewnątrzkomórkowej w próbkach istotnych dla celów klinicznych oraz badanie interakcji między komórkami leków. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest optymalizacja czasu inkubacji w różnych modelach. Dodatkowo, modelowe dostosowanie leków ogranicza odporność, zwłaszcza w próbach pierwotnych pacjentów.

Na początek rozmroz próbkę komórki kriokonserwowanej, delikatnie mieszając fiolkę w zlewce zawierającej 15 mililitrów wody destylowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż zawartość zostanie całkowicie rozmrozona. Przelej zawartość fiolki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 15 mililitrów sterylnego 1X PBS za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Włóż probówkę do wirówki ustawionej na 300G na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu odrzuć supernatant, odwracając rurkę jednym płynnym ruchem. Teraz ponownie zawiesz granulkę ogniwa w 10 mililitrach AIM V Medium za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Licz żywotne komórki za pomocą automatycznego licznika i mierz średni rozmiar komórek.

Oblicz objętość potrzebną do uzyskania 2,5 razy 10 do mocy sześciu żywotnych komórek, używając prostej proporcji opartej na zmierzonym stężeniu komórek. Vortex roztwór wincristyny dobrze przed użyciem. Dodaj medium AIM V do mikrorurki o pojemności dwóch mililitrów, następnie 2,5 razy 10 do mocy sześciu ogniw, a następnie dodaj wymaganą objętość roztworu winkrystyny.

Krótko zawiruj i obróć rurkę przez pięć sekund, aby zebrać płyn z korekci. Następnie inkubuj otwarte mikrorurki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Po inkubacji zamknij pokrywki probówek i wiruj próbki w temperaturze 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie odrzuć supernatant pipetą. Następnie dodaj do rurki jeden mililitr PBS w temperaturze pokojowej. Po powtórzeniu wirowania i mycia ostrożnie usuń cały pozostały supernatant pipetą.

ponownie zawiesz pellet w 100 mikrolitrach PBS i wiru, aż pelet zostanie całkowicie zawieszony. Teraz dodaj 400 mikrolitrów zimnego metanolu zawierającego 0,1 mikromolowego winblastynu przy minus 20 stopniach Celsjusza bezpośrednio do próbki, unikając kontaktu ze ścianami rurki. Przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.

Przed wyjęciem próbek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza schłodź wirówkę do czterech stopni Celsjusza. Zaraz po wyjęciu próbek z zamrażarki wiruj je w temperaturze 13 000G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przelej 300 mikrolitrów supernatantu do mikrorurki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety.

Próbki całkowicie wysusz, umieszczając je w koncentratorze próżniowym ustawionym na 45 stopni Celsjusza na godzinę i 40 minut. Po wysuszeniu ponownie zawiesz każdy pellet w 400 mikrolitrach wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego za pomocą pipety. Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozpuści.

Teraz ponownie wiruj próbki w temperaturze 13 000G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej 300 mikrolitrów supernatantu do fiolki z zakrętką na dwa mililitry do analizy chromatografii cieczowej w tandemowej spektrometrii mas. Na ekranie głównym oprogramowania otwórz listę próbek i stwórz nową, wpisując nazwy próbek, objętości zastrzyków, pozycje fiolek oraz metodę, którą mają zastosować.

Włóż fiolkę z ultraczystą wodą do tacy autosamplera i oznaczyj ją jako pustą w liście próbek. Używaj pustego zaszczepienia między każdym zestawem potrójnych zastrzyków, aby uniknąć przeniesienia się. Wybierz pożądane wiersze z listy próbek i rozpocznij akwizycję danych, klikając "uruchom" i potwierdzając za pomocą OK. Po zakończeniu testu wybierz próbkę z wyników i obejrzyj chromatogramy, klikając chromatogram w górnym menu pasku.

Na koniec, na ekranie głównym, kliknij docelowe linki. Wybierz pliki, które właśnie się uruchomiły, i kliknij "przetworz". Wybierz metodę winkrystyny i kliknij OK, aby wygenerować tabele wyjściowe.

Analiza chromatograficzna pierwotnych komórek ksenotransplantatowych pochodzących od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną, inkubowanych jednym mikromolowym winkrystyną przez trzy godziny, konsekwentnie wykazała symetryczny i dobrze rozdzielony szczyt magnetowidu po 2,85 minuty, potwierdzając odpowiednie retencje i minimalną interferencję macierzową. Krzywe kalibracyjne winkrystyny wygenerowane w AIM V Media wykazały silną liniowość w stężeniach od 0,001 do 10 mikromolowych. Podobnie, gdy dwa razy 10 do potęgi sześciu RS4; Dodano 11 komórek, zaobserwowano liniową odpowiedź od 0,01 do jednego mikrotrzonowca.

Analiza przebiegu czasu nagromadzenia winkrystyny wykazała, że RS4; 11 komórek wykazało plateau w stosunku winkristyny w stosunku winblazyny między dwiema a trzema godzinami z umiarkowanym wzrostem po czterech i pięciu godzinach, podczas gdy pierwotne komórki PDX osiągnęły szczyt po dwóch godzinach i potem spadły, co wspiera wybór trzech godzin jako zrównoważonego czasu inkubacji. Znormalizowane nagromadzenie winkrystyny różniło się w sześciu próbkach pacjentów z PDX, a zaobserwowano dodatnią korelację między nieznormalizowaną winkrystyną przez proporcje winblistyny a średnią objętością komórek. Analiza fragmentacji potwierdziła, że szczyt bazowy winkrystyny odpowiadał jonowi prekursorowi przy stosunku ładunku głównego 413,38, co generowało jon ilościowy na poziomie 392,47 oraz jon potwierdzający na poziomie 383,38 przy energii stożka 40 woltów i energii kolizji 16 woltów.

Nasz protokół przezwycięża ograniczenia podejść pośrednich, umożliwiając bezpośrednie i czułe pomiary leków wewnątrzkomórkowych głównie w komórkach białaczki. Nasze podejście ułatwia bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowej winkrystyny, nawet jeśli liczba głosów komórkowych jest niska. W przyszłości zbadamy, czy różnice w akumulacji leków wewnątrzkomórkowych są związane z opornością in vitro oraz zbadamy powiązane mechanizmy.