Name: Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj metodę izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz fibroblastów kontrolnych od tego samego pacjenta z rakiem przełyku. Protokół eliminuje zmienność między pacjentami i umożliwia badanie interakcji nowotwor-stroma z większą niezawodnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez Juntendo University Young Investigator Award (2024 i 2025) dla P. Z. oraz granty na badania naukowe od Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (23K07362, 21K08693). Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Katedr Patologii i Onkologii oraz Chirurgii Przełykowej i Gastroenterologicznej.

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Abbas, G., Krasna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Overview of esophageal cancer.</a> Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+colorectal+cancer+in+2020+and+2040%3A+Incidence+and+mortality+estimates+from+GLOBOCAN%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN.</a> Gut. 72 (2), 338-344 (2023).</li>
<li>Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Oesophageal cancer.</a> Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).</li>
<li>Lordick, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oesophageal+cancer%3A+ESMO+Clinical+Practice+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).</li>
<li>Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%3A+Unity+in+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity.</a> Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).</li>
<li>Caligiuri, G., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fibroblasts+in+cancer%3A+Perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges.</a> Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).</li>
<li>Mezawa, Y., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+tumor-+and+metastasis-promoting+carcinoma-associated+fibroblasts+in+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas.</a> Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).</li>
<li>Mezawa, Y., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%2C+stability+and+plasticity+in+tumor-promoting+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts.</a> FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).</li>
<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+An+emerging+target+against+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 546, 215860(2022).</li>
<li>Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cancer-associated+fibroblasts+in+the+progression%2C+therapeutic+resistance+and+targeted+therapy+of+oesophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma.</a> Front Oncol. 13, 1257266(2023).</li>
<li>Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+in+esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).</li>
<li>Pimkhaokham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+chromosomal+imbalances+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+cell+lines%3A+Possible+involvement+of+the+ATF3+and+CENPF+genes+in+the+1q32+amplicon%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon.</a> Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).</li>
<li>Kijima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organoids+reveal+therapy+resistance+of+esophageal+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).</li>
<li>Fuchino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+residual+cancer+by+comparison+of+a+pair+of+organoids+established+from+a+patient+with+esophageal+squamous+cell+carcinoma+before+and+after+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy.</a> Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+precision+medicine+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+using+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids.</a> J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).</li>
<li>Zhang, S., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+establish+patient-derived+xenograft+and+organoid+for+radiosensitivity+of+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma.</a> STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Mashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF24+depletion+induces+clustering+of+supernumerary+centrosomes+in+PDAC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells.</a> Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).</li>
<li>Hogstrom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+of+hormone+receptor-positive+breast+cancer+organoids+and+fibroblasts+reveals+stroma-mediated+resistance+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms.</a> J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).</li>
<li>Schuth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+modeling+of+stroma-mediated+chemoresistance+of+pancreatic+cancer+using+a+three-dimensional+organoid-fibroblast+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).</li>
<li>Farin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+organoid-stroma+biobank+allows+subtype-specific+assessment+of+individualized+therapy+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses.</a> Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).</li>
<li>Zapatero, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trellis+tree-based+analysis+reveals+stromal+regulation+of+patient-derived+organoid+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses.</a> Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).</li>
<li>Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-matched+and+unmatched+cancer+associated+fibroblasts+exhibit+differential+effect+on+proliferation+and+FMOD+and+MMP9+gene+expression+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+when+co-cultured+in+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids.</a> Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Poprzednie raporty wykorzystywały organoidy nowotworowe oraz dopasowane do pacjenta CAF do badania roli CAF w proliferacji i oporności na leki w ludzkich rakach jelita grubego, piersi, trzustki oraz głowy i szyi 20,21,22,23,24. Badania te wykazały, że CAF wpływają na proliferację i oporność na leki. Z drugiej strony, według obecnej wiedzy, nie ma opublikowanyc...

Rak przełyku wiąże się z wysoką częstością występowania i śmiertelnością na całym świecie1. Ogólnie dzieli się go na dwa główne podtypy histologiczne: raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) oraz gruczolakoraka przełyku (EAC)2. ESCC jest bardziej powszechne niż EAC, z szczególnie wyższą zachorowalnością w Azji Wschodniej i Afryce3. Strategie leczenia ESCC są stosunkowo dobrze ugruntowane 4,5. W przypadku wczesnych zmian ograniczonych do warstwy śluzowej wskazana jest endoskopowa resekcja jako metoda lecznicza i minimalnie inwazyjna. U pacjentów z miejscowo zaawansowaną, ale resekcyjną chorobą, połączenie neoadjuwantnej chemoradioterapii i ezofagektomii wykazało skuteczność kliniczną. W przypadkach nieresekowalnych lub przerzutowych chemioterapia ogólnoustrojowa pozostaje podstawą leczenia. Niemniej jednak oporność terapeutyczna i nawroty choroby nadal stanowią poważne wyzwania kliniczne.
Guzy składają się nie tylko z komórek nowotworowych, ale także ze złożonego mikrośrodowiska nowotworowego obejmującego różne typy komórek stromalnych. Wśród nich fibroblasty związane z rakiem (CAF), główne komórkowe składniki mikrośrodowiska guza, odgrywają kluczową rolę w postępie guza i terapeutycznej reakcji 6,7,8,9. W ESCC coraz częściej zgłaszano udział CAF w nowotworach i oporności na leczenie. 10,11,12. Jednak dokładne molekularne mechanizmy CAF leżące u podstaw nowotworów ESCC pozostają w dużej mierze niejasne.
W większości wcześniejszych badań wpływ CAF na komórki nowotworowe oceniano za pomocą różnych linii komórkowych ESCC propagowanych w szalkach Petriego przez wiele lat, a nawet dekad. Takie linie komórkowe dostosowałyby się do warunków hodowli i niewiele przypominałyby oryginalne guzy13. Ponadto linie komórkowe ESCC pochodzą od różnych pacjentów i wykazują różne zmiany genetyczne oraz epigenetyczne, które są wyraźnie odrębne w poszczególnych komórkach ESCC, pełniąc rolę zmienności między pacjentami. Wyniki eksperymentalne z jednej linii komórek nowotworowych często mogą być niezgodne z wynikami z innej linii nowotworowej. Dlatego eksperymenty z wykorzystaniem różnych linii komórkowych ESCC oraz niedopasowanych CAF do pacjenta mogą utrudniać precyzyjne i wiarygodne uwzględnienie interakcji tych komórek.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowano protokół polegający na jednoczesnym izolowaniu organoidów nowotworowych dopasowanych do pacjenta, CAF oraz fibroblastów nienowotworowych (CF) z tego samego preparatu chirurgicznego ESCC. Organoidy pochodzące od pacjentów zazwyczaj odtwarzają kluczowe cechy architektoniczne i fenotypowe pierwotnych guzów, zachowując jednocześnie heterogeniczność molekularną. Ustalone organoidy tworzyły sferoidy w warunkach trójwymiarowej (3D) hodowli i wykazywały stabilną zdolność proliferacji. Zarówno CAF, jak i CF zostały potwierdzone jako wzbogacone w populacjach komórek fibroblastowych z dodatnim uwzględnieniem vimentyny, markera fibroblastu.
Protokół ten zawiera szczegółowe, powtarzalne kroki dotyczące przetwarzania tkanek, dysocjacji enzymatycznej, zasiewania organoidów, izolacji CAF/CF, przepuszczania oraz krioprezerwacji. Aby pomóc naukowcom ocenić przydatność przed wdrożeniem, uwzględniono praktyczne informacje: organoidy zazwyczaj tworzą się w ciągu 3–5 dni, osiągają gotowość do przejścia w ciągu 7–10 dni i mogą być stabilnie rozszerzane o ponad dziesięć fragmentów. CAF i CF mogą być przekazywane przez co najmniej osiem pokoleń. Organoidy i fibroblasty mogą być krioprezerwowane w ciągu około 20 dni. Wskaźniki sukcesu w zakładach sięgają około 70% dla organoidów oraz 80% dla CAF i CF. Ponadto uwzględniono zwalidowany test warunkowany z użyciem podłoża warunkowanego CAF lub CF, co zapewnia solidne podejście do oceny parakrynnych efektów komórek stromalnych na zachowanie organoidów nowotworowych. Łącznie ta dopasowana platforma organoid–stromal nowotworowa oferuje eksperymentalnie dostępny i biologicznie istotny model do badania interakcji między guzem a stromalem ESCC oraz wspierania rozwoju precyzyjnych strategii terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Antena 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>100x penicylina-streptomycyna (PS)</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Rurka 15 ml</td><td>FastGene</td><td>FG2001</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowla komórek z 24 dołkami</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowla komórkowa z 48 dołkami</td><td>TPP</td><td>92448</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 50 ml</td><td>FastGene</td><td>FG2004</td><td></td></tr><tr><td>Antena 60 mm</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Płyta hodowla komórek 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Kajmany</td><td>9001799</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>Podstawowe ośrodek organoidalny = Zaawansowane DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS</td></tr><tr><td>Alexa488 anty-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Amfocerycyna B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw Vimentynie (V9)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6260</td><td>Rozcieńczenie 1/500 do zastosowania</td></tr><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Filtr na pokrywkę butelki</td><td>Sartorius</td><td>180F15</td><td></td></tr><tr><td>Sitnik komórkowy, 100 & mikro; m pore</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ I</td><td>SIGMA</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Dysze 60 mm powlekany kolagenem</td><td>IWAKI</td><td>4010-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>GODO SHUSEI</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco</td><td>Nacalai</td><td>08459-64</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti2</td><td>Nicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>SERANA</td><td>S-FBS-CO-015</td><td></td></tr><tr><td>Medium wzrostu fibroblastów 2</td><td>PromoCell</td><td>C-23020</td><td>Fibroblastowe medium-1 = Fibroblastowe medium wzrostu 2</td></tr><tr><td>G418</td><td>Invivogen</td><td>ANT-GN-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HFDM-1</td><td>KSK</td><td>87-160</td><td>Fibroblasty medium-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS</td></tr><tr><td>Hoechst33342&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>04929-82</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna</td><td>Invivogen</td><td>ANT-HG-1</td><td></td></tr><tr><td>System IncuCyte</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Macierz błony podstawowej = Matrigel</td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Wako</td><td>017-05131</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PM-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-10</td><td>PEPROTECH</td><td>PEP-100-26</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel, nr 11</td><td>Pióro</td><td>8-3086-02</td><td></td></tr><tr><td>STEMFULL</td><td>Sumitomo bakelite</td><td>MS-90150</td><td>Rurka o niskim przyczepaniu 15 mL = STEMFULL</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>Trypsyna dla organoidów = TrypLE Express</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Nacalai</td><td>35556-44</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Establishment of Tumor Organoids, Carcinoma-Associated Fibroblasts, and Counterpart Fibroblasts from the Same Esophageal Cancer Patient

W przypadku raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) nabycie oporności na leczenie oraz nawroty guza pozostają poważnym wyzwaniem klinicznym. Fibroblasty związane z rakem (CAF), kluczowe składniki mikrośrodowiska guza, są znane z wpływu na progresję ESCC i odpowiedź terapeutyczną. Jednak wiele aspektów roli CAF w nowotworze pozostaje nieznanych, prawdopodobnie ze względu na zmienność między pacjentami u pacjentów ESCC. Uważa się, że różne ludzkie linie komórkowe ESCC dostępne do badań częściowo naśladują charakter ludzkiego raka. Są również rozmnażane in vitro przez lata i dekady w szalce Petriego, co pozwala na adaptację do warunków hodowlanych. Ponadto ludzkie linie komórkowe ESCC wykazują różne zmiany genetyczne i epigenetyczne, charakterystyczne dla pierwotnych pacjentów, co skutkuje zmiennością między pacjentami. Niemniej jednak, długoterminowe hodowle komórek nowotworowych były wykorzystywane w większości wcześniejszych badań do eksperymentów z niedopasowanymi CAF pacjenta. Zmienność między pacjentami w obrębie każdej linii nowotworowej oraz między komórkami nowotworowymi a CAF może zatem powodować obniżoną powtarzalność i wiarygodność wyników. Aby wyeliminować zmienność między pacjentami, z tego samego pacjenta wyizolowano trzy odrębne typy komórek: organoidy nowotworowe i CAF z chirurgicznie rozciętego regionu ESCC oraz odpowiedniki fibroblastów (CF) z sąsiedniego obszaru nienowotworowego jako specyficzne dla pacjenta kontrolne dla CAF. Przedstawiony jest szczegółowy protokół umożliwiający jednoczesną izolację organoidów nowotworowych, CAF i CF. Organoidy nowotworowe dobrze rosły w warunkach trójwymiarowych. CAF i CF pozytywnie barwiły wimentynę, jeden z markerów fibroblastów, wspierając wzbogacenie tych komórek w liniach fibroblastycznych. Opisany protokół pozwala nam ustalić organoidy ESCC oraz fibroblasty dopasowane do pacjenta, zapewniając cenną platformę eksperymentalną, która wyklucza zmienność między pacjentami w badaniu interakcji guz-stromal.

Pobrano próbki tkanek z obszaru guza oraz sąsiedniego obszaru nieguzowego, położonego 3 cm od guza, chirurgicznie usuniętych u pacjenta z ESCC, który nie otrzymał neoadiuwantowej chemioterapii. Organoidy nowotworowe i CAF izolowano z obszaru guza, natomiast CF z obszaru nie-nowotworowego. Tkanki chirurgiczne były mielone na kawałki o wielkości około 0,5 mm (Rysunek 2A), następnie enzymatycznie leczone, po czym organoidy nowotworowe i fibroblasty izolowano osobno. Organoidy i fibroblasty potr...

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

In esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), the acquisition of treatment resistance and tumor recurrence remain major clinical challenges. ...

establishment-tumor-organoids-carcinoma-associated-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół opisuje metody subhodowli i kriokonserwacji organoidów gruczolakoraka przełyku z trawieniem pojedynczych komórek i bez niego, aby umożliwić badaczom wybór odpowiednich strategii w oparciu o ich eksperymentalny projekt.

Subkultura i kriokonserwacja organoidów gruczolakoraka przełyku: plusy i minusy trawienia pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Dostępny jest protokół jednoczesnego wstrzykiwania komórek rakowych i fibroblastów oraz monitorowania wzrostu guza w czasie. Protokół ten można wykorzystać do zrozumienia molekularnych podstaw roli fibroblastów jako regulatorów wzrostu guza.

Mysi model do badania roli fibroblastów związanych z rakiem we wzroście guza

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Poznaj metodę izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz fibroblastów kontrolnych od tego samego pacjenta z rakiem przełyku. Protokół eliminuje zmienność między pacjentami i umożliwia badanie interakcji nowotwor-stroma z większą niezawodnością.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku (Wideo) | JoVE Journal

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Przeglądaj więcej filmów