Name: Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj protokół przeszczepu domięśniowego ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do myszy immunodeficyjnych. Metoda umożliwia ocenę funkcji wysp trzustkowych in vivo poprzez test GSIS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA) za hojne dostarczenie linii hPSC wykorzystanych w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez granty PID2021-122284NA-I00 i CNS2023-145179 od Ministerstwa Nauki, Innowacji i Uniwersytetów Hiszpanii MICIU/AEI/10.13039/501100011033 i Next GenerationEU/PRTR (A.B.) oraz przez Konsorcjum CIBER ds. Badań Biomedycznych w Sieci, CB07/08/0029 i PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Centrum Badań Biomedycznych nad Cukrzycą i Chorobami Metabolicznymi (CIBERDEM) jest inicjatywą ISCIII i częściowo wspierane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (FEDER).

Wszystkie eksperymenty z udziałem pluripotentalnych komórek macierzystych (hPSC) i zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez instytucjonalne, regionalne i krajowe komitety etyczne. Zastosowane tu linie hPSC zostały pierwotnie wyhodowane i rozprowadzane zgodnie z odpowiednimi zatwierdzeniami etycznymi i procedurami udzielenia zgody świadomie u instytucji źródłowych. Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg procesu, od utrzymania hPSC poprzez ukierunkową różnicowanie linii trzustkowej i dojrzewanie do SC-wysepek nadających się do przeszczepu.
1. Różnicowanie hPSC do przodków trzustkowych
UWAGA: Ten protokół opiera się na dwóch kluczowych krokach przygotowawczych: 1) utrzymaniu i rozmnażaniu hPSC oraz 2) ich ukierunkowanym różnicowaniu w kierunku trzustki dokrewnej. Obie fazy zostały szczegółowo opisane7,17. hPSC są utrzymywane na pokrytych płytkach z pożywką B8 zgodnie z zaleceniami Lyria-Leyte i wsp.17. Zebranie hPSC do różnicowania powinno odbywać się podczas eksponencjalnego wzrostu, zanim stają się zwarte. Przy zalecanej gęstości siewu powinny osiągnąć 90-100% zwartości następnego dnia, gotowe do rozpoczęcia różnicowania. Różnicowanie w kierunku trzustki dokrewnej przeprowadza się zgodnie z procedurą opisana przez Barsby i wsp.7. Pełne szczegóły pożywek znajdują się w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Świeżo pokryć płytki do różnicowania substancją zewnątrzkomórkową pochodzącą z błony podstawnej.</li>
	<li>Zasiew 0,16-0,19 mln komórek/cm2 w Dniu 0 (1,7 mln komórek w dołku z 6-doku płytki). Użyj 1,5-2x objętości pożywki B8 + CEPT, aby zapobiec wyczerpaniu składników odżywczych (3-4 mL na dołek w 6-doku płytki). 
	UWAGA: Podczas przesiewu hPSC lub zasiewu eksperymentów różnicujących, preferujemy uzupełnienie pożywki B8 koktajlem CEPT, zawierającym chroman 1, emricasan, poliaminy i trans-ISRIB, zamiast konwencjonalnego inhibitora ROCK Y-27632, ze względu na jego sprawdzone właściwości poprawiające przeżywalność hPSC18. Mimo to, Y27632 pozostaje ważną alternatywą dla tego protokołu.</li>
	<li>Wykonuj zmiany pożywki za pomocą pożywki do różnicowania S1 do S4 zgodnie z poniższym harmonogramem: S1 (Dni 1-4), S2 (Dni 4-7), S3 (Dni 7-9) i S4 (Dni 9-11). 
	UWAGA: Pełne składniki pożywki znajdują się w Tabeli 1; dodatkowe szczegóły proceduralne opisano przez Barsby i wsp.7.</li>
</ol>
2. Generowanie klastrów 3D i różnicowanie do komórek wytwarzających insulinę
UWAGA: W 11. dniu różnicowane komórki powinny różnicować się w przodków trzustki. Aby promować różnicowanie dokrewne na tym etapie, komórki przechodzą z kultury płaskiej do kultury 3D.
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 mL 5% (w/v) roztworu przeciw przylegającego (zobacz Tabela 1 dla szczegółów) w celu pokrycia dna 24-doku mikrodołka zawierającego odwrócone piramidowe mikrodołki (400 µm średnicy). Wyśrodkuj przez 10 min w 1300 g w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Roztwór przeciw przylegającego tworzy powierzchnię przeciw przylegającą, która uniemożliwia komórkom przyleganie do plastiku i wspomaga jednolite agregację.</li>
	<li>Sprawdź mikrodołki pod mikroskopem pod kątem pęcherzyków powietrza i ponownie wyśrodkuj, jeśli konieczne, aby usunąć uwięzione powietrze (Rysunek 2A). Aspiruj roztwór przeciw przylegającego i wypłucz 2x 0,5 mL PBS/dołek. Pozostaw dołki pokryte PBS do momentu użycia.</li>
	<li>Wypłucz komórki 1 mL PBS-0,5 mM EDTA, zaabsorbuj PBS-EDTA i pokryj dołki trypsyną (1 mL na dołek 6-doku płytki). Inkubuj w 37 °C przez 8-12 min (do momentu, gdy stukanie powoduje zauważalne oderwanie).</li>
	<li>Nie usuwaj trypsyny; zamiast tego, rozcieńcz 2x objętością DMEM-F12 lub PBS i delikatnie zawieś przez pipetowanie. Umieść zawiesinę w stożkowym pojemniku i natychmiast przejdź do następnego kroku. 
	UWAGA: Lepiej inkubaować dłużej w trypsynie niż wykonywać brutalnego mechanicznego rozdrabniania.</li>
	<li>Wyśrodkuj zawiesinę w 200 g przez 3 min w RT. Delikatnie zaabsorbuj nadstan i ponownie zawieś ulotkę w przegrzanym medium S4 (1,25 mL dla każdego dołka 24-doku mikrodołka).</li>
	<li>Zaabsorbuj PBS z mikrodołkowych naczyń. Delikatnie dodaj 1,25 mL zawiesiny komórek do każdego dołka mikrodołkowego. 
	UWAGA: Każdy dołek 24-mikrodołkowej płytki zawiera 1200 mikrodołków. Gęstość zasiewu wymagana do uzyskania odpowiednio wielkich klastrów wynosi 1500 komórek na mikrodołek, co odpo

<ol><li>Ong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+burden+of+diabetes+from+1990+to+2021%2C+with+projections+of+prevalence+to+2050%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2021%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021.</a> The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).</li>
<li>Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+risk+factors+with+type+2+diabetes%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review.</a> Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).</li>
<li>Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctions%2C+molecular+mechanisms%2C+and+therapeutic+strategies+of+pancreatic+%CE%B2-cells+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes.</a> Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).</li>
<li>Xue, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interrogation+of+twenty+type+2+diabetes-associated+genes+using+isogenic+human+embryonic+stem+cell-derived+%CE%B2-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells.</a> Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).</li>
<li>Bartolomé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+%CE%B2+cells%3A+A+versatile+research+platform+to+interrogate+the+genetic+basis+of+%CE%B2+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).</li>
<li>Balboa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+metabolic+and+transcriptional+maturation+of+human+pancreatic+islets+derived+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells.</a> Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).</li>
<li>Barsby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+functional+human+islet-like+aggregates+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).</li>
<li>Shi, Z. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+hPSCs+reveals+GATA6+haploinsufficiency+and+a+genetic+interaction+with+GATA4+in+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).</li>
<li>Fantuzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+depth+functional+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+beta+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo.</a> Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).</li>
<li>Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+profiling+reveals+%CE%B2+cell+maturation+in+stem+cell-derived+islets+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation.</a> Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+regulation+in+establishing+human+stem+cell-derived+%CE%B2+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation.</a> Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).</li>
<li>Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+and+maturation+of+human+stem+cell-derived+islets+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation.</a> Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).</li>
<li>Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+transplantation+under+the+kidney+capsule+of+mice%3A+Model+of+refinement+for+molecular+and+ex-vivo+graft+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis.</a> Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).</li>
<li>Scholl, V. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+implantation+sites+for+pancreatic+islet+cell+transplantation%3A+Implications+for+type+1+diabetes+mellitus+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment.</a> Bioengineering. 12 (5), 499(2025).</li>
<li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).</li>
<li>Lithovius, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+quantification+of+stem+cell-derived+islet+graft+size+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition.</a> Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).</li>
<li>Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+protocol+for+the+cost-effective+and+weekend-free+culture+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+autotransplantation+in+primary+parathyroid+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia.</a> N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).</li>
<li>Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+pancreatic+islet+implantation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of four pancreatic islet implantation sites.</a> J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).</li>
<li>Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+reversal+of+streptozotocin-induced+diabetes+in+rats+by+intramuscular+islet+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation.</a> Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów o interesie do zadeklarowania.

W tym protokole opisujemy wmażanie domięśniowe wysp SC jako prostą, powtarzalną i minimalnie inwazyjną metodę dojrzewania in vivo, z potencjalną możliwością oceny funkcjonalnej. Chociaż przeszczepienie pod torebkę nerki jest powszechnie uważane za "złoty standard" do przeszczepiania wysp lub SC-wysp u gryzoni, wymaga większej fachowej wiedzy i dłuższego zabiegu chirurgicznego. W przeciwieństwie do tego, miejsce domięśniowe oferuje prostotę zabiegu i szybką realizację, zgodnie z zasadami ulepszania ram 3R poprzez...

Cukrzyca jest heterogenicznym zaburzeniem metabolicznym, którego częstość wystąpienia podwoiła się w ciągu ostatnich trzech dekad i spodziewa się, że do 2050 roku dotrze 1,3 miliarda ludzi1. Podczas gdy czynniki środowiskowe, takie jak dieta i styl życia, odgrywają znaczącą rolę w wystąpieniu cukrzycy typu 2 (T2D), predyspozycje genetyczne również w znacznym stopniu przyczyniają się do jej patogenezy2. Komórki ß trzustki są odpowiedzialne za syntezę i wydzielania insuliny i odgrywają centralną rolę w patofizjologii cukrzycy3. Aby zrozumieć, jak ryzyko genetyczne przyczynia się do dysfunkcji komórek ß, ludzkie komórki macierzyste pochodzenia płodowego zorganizowane jako trójwymiarowe klastry dokrewne (dalej określane jako SC-wysepki) stanowią wysoce pouczający i istotny system modelowy4,5. Ostatnie protokoły skutecznie prowadzą różnicowanie ludzkich komórek macierzystych w komórki ß wytwarzające insulinę, poprzez odtworzenie kluczowych etapów rozwoju trzustki za pomocą specyficznych inhibitorów i czynników wzrostu6,7.
Te systemy niezawodnie replikują kamienie milowe rozwoju w skalowalny, powtarzalny sposób, pokonując ograniczenia wysp pochodzenia dawcy, które nie wspierają modelowania rozwoju i są podatne na ograniczenia zaopatrzenia. Modele na myszach dostarczyły cenny wgląd w rozwój trzustki, ale często nie udaje im się w pełni odtworzyć manifestacji fenotypu obserwowanych u ludzkich pacjentów5. W związku z tym, użycie systemu opartego na komórkach macierzystych umożliwia charakterystykę wariantów genetycznych zaangażowanych w rozwój trzustki człowieka i dysfunkcji komórek ß8.
Mimo tych postępów, SC-wysepki wygenerowane in vitro pozostają transkrypcyjnie i funkcyjnie niedojrzałe w porównaniu z natywnymi komórkami ß dorosłych. Wykazują suboptymalne wydzielanie insuliny stymulowanej glukozą i brak ekspresji dojrzałych markerów komórek ß, takich jak MAFA i G6PC29,10. Aby zapobiec tej luki, często stosuje się dojrzewanie in vivo poprzez przeszczepienie do szczurów immunodeficytarnych; to zazwyczaj poprawia zarówno dynamiki wydzielania insuliny, jak i profile ekspresji genów6.
Metabolizm glukozy jest ściśle regulowany i wymaga integracji wskazówek systemowych. Przeszczepione SC-wysepki są w stanie zintegrować sygnały z wielu narządów, zapewniając bardziej fizjologicznie istotne środowisko, które jest kluczowe dla oceny konsekwencji funkcjonalnych wariacji genetycznych w ludzkich komórkach ß11.
Przeszczepianie SC-wysepek u myszy było wykonywane w różnych miejscach anatomicznych. Konwencjonalnym miejscem jest torebka nerkowa, skuteczna w promowaniu dojrzewania komórek ß i odwracaniu cukrzycy u szczurów leczonych streptozotocynę (STZ)12, ale wiąże się to ze złożoną inwazyjną operacją, co ogranicza jego implementację w laboratoriach13. Co więcej, ta metoda nie jest przenośna do ustawień klinicznych w leczeniu pacjentów z cukrzycą typu 1 z powodu ograniczeń wielkości i unaczynienia14. Zgłaszano alternatywne miejsca przeszczepu, takie jak tkanki mięśniowe, podskórne i tkanki tłuszczowej, oferujące mniej inwazyjne i bardziej stosowalne klinicznie drogi. Chociaż przeszczepienie domięśniowe może stanowić wyzwanie dla osiągnięcia optymalnego dojrzewania komórek ß i wydzielania insuliny w porównaniu z torebką nerkową12, może jednak osiągnąć skuteczne wydzielanie insuliny i utrzymanie homeostazy glukozy, oferując prostszy i bardziej dostępny podejście chirurgiczne15,16.
Dlatego w tym protokole przedstawiamy podejście do przeszczepiania domięśniowego, które rozwiązuje kilka ograniczeń innych protokołów przeszczepiania. Ta metoda jest minimalnie inwazyjna i zapewnia niezawodną strategię in vivo dojrzewania SC-wysepek i badania wariantów genetycznych związanych z dysfunkcją komórek ß.

<table><tbody><tr><td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Qkine</td><td>Qk001</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 400 24-well (microwell plate)</td><td>Stemcell</td><td>34415</td><td></td></tr><tr><td>Betacellulin</td><td>GenScript</td><td>Z03102</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid Free</td><td>Goldbio</td><td>A-421</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>LC labs</td><td>C-6556&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chroman-1</td><td>Medchem Express</td><td>HY-15392</td><td>CEPT cocktail</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-84600</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzazepine (DBZ)</td><td>Syncom</td><td>Custom product</td><td>Gamma-secretase inhibitor</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham&rsquo;s F12 media (DMEM/F12)</td><td>Corning</td><td>15383541</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Qkine</td><td>Qk011</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchem Express</td><td>HY-10396</td><td>CEPT cocktail</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>FGF2-G3</td><td>GenScript</td><td>Custom product</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>GenScript</td><td>Z03047</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Gibco</td><td>30284510</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine</td><td>Linus</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-202686</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Lipid Concentrate</td><td>Gibco</td><td>11548846</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)</td><td>Falcon</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Thermo Scientific</td><td>10521221</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553325</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NRG-1</td><td>Qkine</td><td>Qk045</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (anti-adherence solution)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82184</td><td>Used at 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Polyamine Supplement (1000&times;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8483</td><td>CEPT cocktail</td></tr><tr><td>RepSox</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13012</td><td>Alk5 Inhibitor</td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Selleckchem</td><td>S7092</td><td></td></tr><tr><td>Sobetirome (GC1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML1900-5MG</td><td>Cell-permeable T3 analog</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta;1&nbsp;</td><td>Qkine</td><td>Qk010</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>Tocris</td><td>5343</td><td></td></tr><tr><td>Trace Elements A</td><td>Corning</td><td>15333641</td><td></td></tr><tr><td>Trace Elements B</td><td>Corning</td><td>15343641</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Medchem Express</td><td>HY-12495</td><td>CEPT cocktail</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>InVitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11488696</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>11538856</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>LC Laboratories</td><td>Y-5301</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>ZM-447439&nbsp;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10128</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-Human C-peptide (insulin)</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-s</td><td>Used at 150 ng/mL</td></tr><tr><td>Mouse anti-glucagon</td><td>Proteintech</td><td>67286-1-Ig</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Rabbit anti-somatostatin</td><td>Millipore</td><td>AB5494</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rat AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr></tbody></table>

przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Intramuscular Transplantation of Human Pluripotent Stem Cell-derived Pancreatic Endocrine Cells in Mice

Pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) komórki endokrynnego trzustki stanowią obiecujące źródło dla terapii komórkowej cukrzycy i modelowania choroby. Chociaż ustanowiono kilka protokołów różnicowania, do badania dojrzewania i funkcji w fizjologicznym kontekście zwykle wymagana jest implantacja in vivo. Większość podejść transplantacyjnych opiera się na miejscach takich jak torebka nerki lub przestrzeń podskórna, które mogą stwarzać ograniczenia techniczne lub fizjologiczne. Przedstawiamy tu szczegółowy protokół dotyczący wewnątrzmięśniowej transplantacji wywodzących się z hPSC wysp SC trzustki do szczurów immunodeficytarnych. To miejsce pozwala na bezpośredni dostęp chirurgiczny, zmniejsza inwazyjność i zapewnia niezawodne pobranie przeszczepu do dalszej analizy. Procedura umożliwia wewnątrzmięśniową implantację wysp pochodzenia komórkowego macierzystej i wspiera ich odzyskanie do dalszej oceny wydzielanie insuliny po doustnym podaniu glukozy. Protokół obejmuje kroki przygotowania i zagęszczania klastrów, operację przeszczepienia, in vivo wydzielanie insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) i pobranie przeszczepu do analizy histologicznej, zapewniając reproduktywalny rachunek dla wewnątrzmięśniowej transplantacji w preklinicznych modelach mysich.

Przedstawione wyniki odpowiadają transplantacji śródmięśniowej wysepek SC na 7. etapie do myszy immunodeficytarnych i analizie przeprowadzonej 6 tygodni po przeszczepie. Analizie poddano ograniczoną liczbę zwierząt z reprezentatywnymi przeszczepami w celu przedstawienia wykonalności procedury. W niniejszym badaniu, sukces określany jest jako makroskopowe odzyskanie śródmięśniowego przeszczepu wraz z potwierdzeniem histologicznym przeżywalności i tożsamości endokrynne przeszczepowanych wys...

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic endocrine cells constitute a promising source for diabetes cell therapy and disease modeling. ...

Badanie rozwoju trzustki dokrewnej człowieka z wykorzystaniem pochodzących z komórek macierzystych zawiązków oczu, aby zrozumieć genetyczne podstawy cukrzycy. Tradycyjna transplantacja kapsułki nerkowej jest bardzo inwazyjna. Protokół przeszczepu domięśniowego oferuje prostszą, bardziej wykonalną i minimalnie inwazyjną alternatywę.Na początek dodaj 0,5 mililitra 5% roztworu przeciw adhezyjnego, aby pokryć dno 24-dołkowej płytki mikrodołkowej zawierającej odwrócone piramidowe mikrodołki. Wiruj płytkę z prędkością 1300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdź mikrodołki pod mikroskopem pod kątem bąbelek powietrza.Po ponownym wirowaniu płytki, aby usunąć wszelkie uwięzione powietrze, aspiruj roztwór przeciw adhezyjny. Następnie przemyj każdy dołek 0,5 mililitra PBS i powtórz krok przemywania jeszcze raz. Następnie przemyj hodowanych przodków trzustki rozwijających się z hPSCs jednym mililitrą PBS z 0,5 milimolarem EDTA.Aspiruj PBS z 0,5 milimolarem EDTA i przykryj dołki trypsyną. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem do 12 minut. Rozcieńcz trypsynę dwiema objętościami DMEM/F12 lub PBS i delikatnie resuspenduj komórki przez pipetowanie.Przenieś zawiesinę do stożkowego probówka i natychmiast przejdź do następnego kroku. Wiruj zawiesinę z prędkością 200 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie aspiruj nadstan i delikatnie resuspenduj pellet w przegrzanym medium S4.Następnie aspiruj PBS z miseczek mikrodołkowych. Delikatnie dodaj 1,25 mililitra zawiesiny komórek do każdego dołka płytki mikrodołkowej. Wiruj płytkę z prędkością 100 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby równomiernie rozprowadzić komórki w mikrodołkach.Ostrożnie przenieś płytkę mikrodołkową do inkubatora zalewanego. Aby wykonać zmiany mediów na różnicujące się media, delikatnie aspiruj i wlewu media wzdłuż ścianek dołka, aby zapobiec turbulencjom i przemieszczaniu klastrów komórek z mikrodołków. Po przeniesieniu odpowiedniej ilości wygenerowanych klastrów do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, podłącz strzykawkę do igłowej złożonej rury i napełnij ją środkiem S7.Aspiruj klastry do rury bezpośrednio z probówki mikrowirówkowej. Zgiąć rurkę na pół i włożyć złożoną sekcję do 200-mikroliterowego końcówki pipety. Następnie włożyć końcówkę rurkę z igłą do 15-mililitrowej stożkowej probówki i zabezpieczyć końce rury taśmą klejącą.Wiruj probówkę z prędkością 100 g przez dwie minuty w 4 stopniach Celsjusza, aby zagęścić klastry i natychmiast umieść probówkę na lodzie. Aby przeszczepić klastry do znieczulonych myszy NOD scid gamma, ogolić środkową część prawej nogi poniżej kolana i zdezynfekować 70% etanolem. Następnie odłącz rurkę od końcówki pipety i podłącz ją do strzykawki.Odciąć rurkę blisko zagęszczonych klastrów i przymocować ją do stępionej końcówki igły. Wpychać fizjologiczny roztwór soli aż pierwszy klaster dotrze do końcówki igły. Następnie ułożyć mysz na brzuchu, pochylić się na prawą stronę i wyprostować prawą nogę.Wprowadzić igłę na głębokość czterech do pięciu milimetrów do przestrzeni śródmięśniowej prawej udowej między mięśniem przywodzicielem a mięśniem smukłym. Następnie wstrzykiwać klastry, wycofując igłę o około trzy milimetry. Obracać strzykawkę, wycofać igłę i pozwolić myszy na odzyskanie.Po odzyskaniu przeszczepu sześć tygodni po przeszczepie i po przekrojeniu tkanki, przeprowadzić immunobarwienie, aby umożliwić późniejszą analizę obrazowania. Jednokomórkowe zawiesiny przodków trzustki z fazy czwartej zostały umieszczone na płytkach mikrodołkowych, aby wygenerować kontrolowane rozmiary trójwymiarowe agregaty. W ciągu 24 do 48 godzin utworzyły się zwarte sferyczne klastry.Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła obecność komórek wytwarzających PDX1 i insulinę w liniach hPSC reporterowych. Po sześciu tygodniach miejsce przeszczepu było widoczne makroskopowo z masami przypominającymi zawiązki oczu w obrębie mięśni. Po wycięciu eksplantaty były widoczne pod mikroskopem stereoskopowym jako blady sferyczne wiązki.Silne wykrywanie komórek dodatnich dla C-peptydu obserwowano u zwierząt po przeszczepie. Barwienie na insulinę potwierdziło obecność ludzkich komórek przypominających beta w przeszczepie. Wykryto komórki dodatnie dla glukagonu i somatostatyny, co wskazuje na zachowanie populacji komórek alfa i delta.Ten protokół ułatwia przeprowadzanie in vivo badań funkcjonalnych oraz ocenę przeżywalności i dojrzewania przeszczepów ludzkich. Najważniejszą kwestią jest zapewnienie wysokiej jakości różnicowania komórek macierzystych i delikatne obchodzenie się z komórkami podczas tworzenia klastrów, aby zmaksymalizować ich żywotność i zapewnić dobre przeżycie komórek. Te modele ułatwiają badanie mechanizmów genetycznych leżących u podstawy monogennej cukrzycy i dysfunkcji komórek beta.</

intramuscular-transplantation-human-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Ten film opisuje protokół szczepienia ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu monitorowania rewaskularyzacji ludzkich przeszczepów wysp trzustkowych in vivo. Pomaga również zrozumieć udział komórek biorcy i dawcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu.

Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

Przedstawiamy protokół generowania minimalnie inwazyjnego modelu ortotopowego raka trzustki poprzez wstrzykiwanie ludzkich komórek raka trzustki pod kontrolą ultradźwięków i późniejsze monitorowanie wzrostu guza in vivo za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.

Wytwarzanie ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki za pomocą iniekcji pod kontrolą ultradźwięków

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Syngeneic mysie ortotopowe alloprzeszczepy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) podsumowują biologię, fenotypy i reakcje terapeutyczne podtypów choroby. Ze względu na szybką, powtarzalną progresję nowotworu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych. Tutaj pokazujemy powszechne praktyki generowania tych modeli, wstrzykiwania syngenicznych mysich kultur PDAC do trzustki.

Syngeniczne ortotopowe alloprzeszczepy myszy do modelowania raka trzustki

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół przeszczepu domięśniowego ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do myszy immunodeficyjnych. Metoda umożliwia ocenę funkcji wysp trzustkowych in vivo poprzez test GSIS.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Przeglądaj więcej filmów