Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów
10 kwietnia 2026
Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.
Badanie rozwoju trzustki dokrewnej człowieka z wykorzystaniem pochodzących z komórek macierzystych zawiązków oczu, aby zrozumieć genetyczne podstawy cukrzycy. Tradycyjna transplantacja kapsułki nerkowej jest bardzo inwazyjna. Protokół przeszczepu domięśniowego oferuje prostszą, bardziej wykonalną i minimalnie inwazyjną alternatywę.
Na początek dodaj 0,5 mililitra 5% roztworu przeciw adhezyjnego, aby pokryć dno 24-dołkowej płytki mikrodołkowej zawierającej odwrócone piramidowe mikrodołki. Wiruj płytkę z prędkością 1300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdź mikrodołki pod mikroskopem pod kątem bąbelek powietrza.
Po ponownym wirowaniu płytki, aby usunąć wszelkie uwięzione powietrze, aspiruj roztwór przeciw adhezyjny. Następnie przemyj każdy dołek 0,5 mililitra PBS i powtórz krok przemywania jeszcze raz. Następnie przemyj hodowanych przodków trzustki rozwijających się z hPSCs jednym mililitrą PBS z 0,5 milimolarem EDTA.
Aspiruj PBS z 0,5 milimolarem EDTA i przykryj dołki trypsyną. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem do 12 minut. Rozcieńcz trypsynę dwiema objętościami DMEM/F12 lub PBS i delikatnie resuspenduj komórki przez pipetowanie.
Przenieś zawiesinę do stożkowego probówka i natychmiast przejdź do następnego kroku. Wiruj zawiesinę z prędkością 200 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie aspiruj nadstan i delikatnie resuspenduj pellet w przegrzanym medium S4.
Następnie aspiruj PBS z miseczek mikrodołkowych. Delikatnie dodaj 1,25 mililitra zawiesiny komórek do każdego dołka płytki mikrodołkowej. Wiruj płytkę z prędkością 100 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby równomiernie rozprowadzić komórki w mikrodołkach.
Ostrożnie przenieś płytkę mikrodołkową do inkubatora zalewanego. Aby wykonać zmiany mediów na różnicujące się media, delikatnie aspiruj i wlewu media wzdłuż ścianek dołka, aby zapobiec turbulencjom i przemieszczaniu klastrów komórek z mikrodołków. Po przeniesieniu odpowiedniej ilości wygenerowanych klastrów do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, podłącz strzykawkę do igłowej złożonej rury i napełnij ją środkiem S7.
Aspiruj klastry do rury bezpośrednio z probówki mikrowirówkowej. Zgiąć rurkę na pół i włożyć złożoną sekcję do 200-mikroliterowego końcówki pipety. Następnie włożyć końcówkę rurkę z igłą do 15-mililitrowej stożkowej probówki i zabezpieczyć końce rury taśmą klejącą.
Wiruj probówkę z prędkością 100 g przez dwie minuty w 4 stopniach Celsjusza, aby zagęścić klastry i natychmiast umieść probówkę na lodzie. Aby przeszczepić klastry do znieczulonych myszy NOD scid gamma, ogolić środkową część prawej nogi poniżej kolana i zdezynfekować 70% etanolem. Następnie odłącz rurkę od końcówki pipety i podłącz ją do strzykawki.
Odciąć rurkę blisko zagęszczonych klastrów i przymocować ją do stępionej końcówki igły. Wpychać fizjologiczny roztwór soli aż pierwszy klaster dotrze do końcówki igły. Następnie ułożyć mysz na brzuchu, pochylić się na prawą stronę i wyprostować prawą nogę.
Wprowadzić igłę na głębokość czterech do pięciu milimetrów do przestrzeni śródmięśniowej prawej udowej między mięśniem przywodzicielem a mięśniem smukłym. Następnie wstrzykiwać klastry, wycofując igłę o około trzy milimetry. Obracać strzykawkę, wycofać igłę i pozwolić myszy na odzyskanie.
Po odzyskaniu przeszczepu sześć tygodni po przeszczepie i po przekrojeniu tkanki, przeprowadzić immunobarwienie, aby umożliwić późniejszą analizę obrazowania. Jednokomórkowe zawiesiny przodków trzustki z fazy czwartej zostały umieszczone na płytkach mikrodołkowych, aby wygenerować kontrolowane rozmiary trójwymiarowe agregaty. W ciągu 24 do 48 godzin utworzyły się zwarte sferyczne klastry.
Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła obecność komórek wytwarzających PDX1 i insulinę w liniach hPSC reporterowych. Po sześciu tygodniach miejsce przeszczepu było widoczne makroskopowo z masami przypominającymi zawiązki oczu w obrębie mięśni. Po wycięciu eksplantaty były widoczne pod mikroskopem stereoskopowym jako blady sferyczne wiązki.
Silne wykrywanie komórek dodatnich dla C-peptydu obserwowano u zwierząt po przeszczepie. Barwienie na insulinę potwierdziło obecność ludzkich komórek przypominających beta w przeszczepie. Wykryto komórki dodatnie dla glukagonu i somatostatyny, co wskazuje na zachowanie populacji komórek alfa i delta.
Ten protokół ułatwia przeprowadzanie in vivo badań funkcjonalnych oraz ocenę przeżywalności i dojrzewania przeszczepów ludzkich. Najważniejszą kwestią jest zapewnienie wysokiej jakości różnicowania komórek macierzystych i delikatne obchodzenie się z komórkami podczas tworzenia klastrów, aby zmaksymalizować ich żywotność i zapewnić dobre przeżycie komórek. Te modele ułatwiają badanie mechanizmów genetycznych leżących u podstawy monogennej cukrzycy i dysfunkcji komórek beta.</
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł JoVE przedstawia szczegółowy protokół dotyczącą transplantacji domięśniowej wyizolowanych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) wysp trzustkowych SC-islets do myszy z niedoborem odporności. Metoda ta stanowi mniej inwazyjną alternatywę dla transplantacji do torebki nerki lub podskórnie, zapewniając prosty dostęp chirurgiczny oraz niezawodne odzyskanie przeszczepu. Protokół umożliwia ocenę funkcji wysp poprzez badanie sekrecji insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) in vivo po podaniu doustnym glukozy oraz ułatwia późniejszą analizę histologiczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Terapia komórkami macierzystymi
- Badania nad cukrzycą
Wstęp
- Komórki endokryniczne trzustki pochodzące z hPSC rokują nadzieje w kontekście terapii komórkowej cukrzycy oraz modelowania chorób.
- Obecne miejsca transplantacji, takie jak torebka nerki czy przestrzeń podskórna, wykazują ograniczenia techniczne lub fizjologiczne.
- Implantacja in vivo jest często wymagana do badania dojrzewania i funkcji wyizelekcjonowanych z komórek macierzystych wysp w kontekście fizjologicznym.
- Istnieje zapotrzebowanie na powtarzalne i dostępne miejsca transplantacji, które umożliwiają odzysk przeszczepu oraz ocenę funkcjonalną.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowego protokołu dla transplantacji domięśniowej wysepek SC pochodzących z hPSC u myszy z niedoborem odporności.
- Umożliwienie oceny przyżycia, przeżywalności i funkcji wysepek w miejscu o minimalnej inwazyjności.
- Wsparcie oceny funkcjonalnej poprzez GSIS in vivo oraz analizę histologiczną po transplantacji.
- Ustanowienie powtarzalnych ram dla przedklinicznych badań nad cukrzycą z wykorzystaniem wysepek pochodzących z komórek macierzystych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i zagęszczanie klastrów SC-wysepek trzustkowych pochodzących z hPSC.
- Operacja przeszczepienia domięśniowego u myszy z niedoborem odporności.
- Ocena sekrecji insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) in vivo po doustnym podaniu glukozy.
- Odzyskiwanie przeszczepu i analiza histologiczna w celu oceny po transplantacji.
Główne wyniki
- Skuteczne zaprowadzenie i przetrwanie wywodzących się z hPSC wysepek w miejscu przeszczepu domięśniowego.
- Wykrycie funkcjonalnej sekrecji insuliny w odpowiedzi na stymulację glukozą za pomocą badania GSIS in vivo.
- Niezawodne odzyskanie przeszczepów do analizy histologicznej potwierdzającej strukturę wysepek oraz ekspresję markerów.
- Zaprezentowanie powtarzalnej, małoinwazyjnej metody do przedklinicznych badań nad transplantacją wysepek.
Wnioski
- Przeszczepienie domięśniowe jest wykonalnym i dostępnym miejscem wszczepienia wyizek pochodzących z hPSC u myszy.
- Procedura ta umożliwia funkcjonalną ocenę wyizek pochodzących z komórek macierzystych poprzez badanie GSIS in vivo.
- Odzyskanie przeszczepu pozwala na kompleksową analizę histologiczną i molekularną po transplantacji.
- Niniejszy protokół zapewnia powtarzalny model przedkliniczny służący rozwojowi badań nad terapią komórkową cukrzycy.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dożylne przeszczepianie komórek endokrynnych trzustki pochodzenia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zapewnia małoinwazyjny, powtarzalny model przedkliniczny do rozwoju terapii komórkowej cukrzycy. Podejście to umożliwia funkcjonalną ocenę wysepek pochodzących z komórek macierzystych poprzez pomiar wydzielania insuliny stymulowanego glukozą in vivo oraz wspiera niezawodne odzyskiwanie przeszczepu do dalszych analiz, rozwiązując kluczowe ograniczenia tradycyjnych miejsc transplantacji. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w ocenie przedklinicznej, zapewniając kontekst fizjologiczny dla dojrzewania i funkcji wysepek, przy jednoczesnej poprawie dostępności chirurgicznej i zmniejszeniu inwazyjności zabiegu u zwierząt.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ocenę funkcjonalnego dojrzewania wyizelekcjonowanych z komórek macierzystych wysepek w kontekście fizjologicznym.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki niezawodnemu przeżyciu przeszczepu oraz insulinosekreccji zależnej od poziomu glukozy u myszy z niedoborem odporności.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez zapewnienie powtarzalnych odczytów funkcjonalnych przed optymalizacją wiodących związków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego screeningu związków poprzez ustanowienie funkcjonalnego przeszczepu wysepek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury transplantacji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w badaniach przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość testów poprzez umożliwienie ilościowych wyników funkcjonalnych za pomocą in vivo GSIS do oceny działania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez modelowanie funkcji ludzkich wysepek in vivo, co wspomaga dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki spójnemu odzyskiwaniu przeszczepów i analizie histologicznej.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o postępach skorygowane o ryzyko, dostarczając danych funkcjonalnych i strukturalnych na temat przyjmowania i dojrzewania wysepek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez na wczesnym etapie badań, umożliwiając standaryzację testów do celów przesiewowych oraz dostarczając funkcjonalnych odczytów, które pomagają w identyfikacji wiodących związków i podejmowaniu decyzji dotyczących etapu przedklinicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ocenę funkcji wysp w fizjologicznym miejscu transplantacji.
- Przesiewanie: Zwiększa gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanej transplantacji i powtarzalnym pomiarom wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych za pomocą in vivo GSIS w celu porównania funkcji przeszczepów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając analizę histologiczną i molekularną pobranych przeszczepów w celu oceny ich dojrzewania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę przedkliniczną dla iteracyjnych cykli projektowania i testowania w rozwoju terapii cukrzycy opartych na komórkach macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie funkcji i dojrzewania wysepek pochodzących z komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procedur transplantacyjnych w różnych ośrodkach badawczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczanie wiarygodnych danych funkcjonalnych, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach programów dotyczących cukrzycy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki powtarzalnemu przyżyciu i walidacji funkcjonalnej wysepek pochodzących z komórek macierzystych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie różnicowania komórek macierzystych, mikrochirurgicznych technik transplantacji oraz metabolicznych testów in vivo.
- Zależność od sterylnej infrastruktury chirurgicznej, systemów testów obciążenia glukozą oraz testów wykrywania insuliny w celu uzyskania odczytów funkcjonalnych.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy zespołami przetwarzania komórek, chirurgicznymi i analitycznymi w celu zapewnienia spójnych wyników.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji dla różnych szczepów myszy z niedoborem odporności oraz harmonogramów dojrzewania wysepek.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby monitorowania pooperacyjnego i procedur odzyskiwania przeszczepów, co może wpływać na przepustowość w badaniach na dużą skalę.
