ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają Program Unii Europejskiej H2020 (projekt GAIN4CROPS, Zgromadzenie Generalne nr 862087). Centrum Doskonałości AgroRoślinPrzyszła Agroekologia i nowe uprawy w przyszłych klimatach (Ministerstwo Edukacji i Badań Estonii), Estońska Rada Badawcza (PRG 3201 i PRG 2207 oraz TARISTU24-TK28).

<ol><li>Lawson, T., Blatt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+size%2C+speed%2C+and+responsiveness+impact+on+photosynthesis+and+water+use+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stomatal size, speed, and responsiveness impact on photosynthesis and water use efficiency.</a> Plant Physiol. 164 (4), 1556-1570 (2014).</li>
<li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+photosynthetic+efficiency+toward+food+security%3A+Strategies%2C+advances%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives.</a> Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).</li>
<li>Flexas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+we+learn+from+the+ecophysiology+of+plants+inhabiting+extreme+environments%3F+from+%26%2334%3Bsherplants%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bshercrops.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Botany%22%5BJournal%5D)">What can we learn from the ecophysiology of plants inhabiting extreme environments? from &#34;sherplants&#34; to &#34;shercrops.&#34.</a> J Exp Botany. 76 (17), 4831-4848 (2025).</li>
<li>Wu, S., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+clear+nail+polish+to+make+Arabidopsis+epidermal+impressions+for+measuring+the+change+of+stomatal+aperture+size+in+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pattern+Recognit+Recept.%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using clear nail polish to make Arabidopsis epidermal impressions for measuring the change of stomatal aperture size in immune response.</a> Plant Pattern Recognit Recept.: Methods Protoc. 1578, 243-248 (2017).</li>
<li>Kübarsepp, L., Laanisto, L., Niinemets, Ü, Talts, E., Tosens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+stomata+in+ferns+and+allies+sluggish%3F+Stomatal+responses+to+CO%2C+humidity+and+light+and+their+scaling+with+size+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Are stomata in ferns and allies sluggish? Stomatal responses to CO, humidity and light and their scaling with size and density.</a> New Phytol. 225 (1), 183-195 (2020).</li>
<li>Pathoumthong, P., Zhang, Z., Roy, S. J., El Habti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+non-destructive+method+to+phenotype+stomatal+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid non-destructive method to phenotype stomatal traits.</a> Plant Methods. 19 (1), 36(2023).</li>
<li>Warner, C. A., Biedrzycki, M. L., Jacobs, S. S., Wisser, R. J., Caplan, J. L., Sherrier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiol. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li>
<li>Petruzzellis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+functional+traits+of+tree+of+heaven+is+higher+in+exotic+than+in+native+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Plasticity of functional traits of tree of heaven is higher in exotic than in native habitats.</a> Trees. 33 (2), 411-420 (2019).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+plant+tissues+for+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging.</a> J Vis Exp. (179), e63428(2022).</li>
<li>Hériché, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+tissues%3A+advances+and+promising+clearing+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging plant tissues: advances and promising clearing practices.</a> Trends Plant Sci. 27 (6), 601-615 (2022).</li>
<li>Ensikat, H. J., Malekhosseini, M., Rust, J., Weigend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+calcium+oxalate+crystal+macropatterns+in+plant+leaves+using+an+improved+fast+preparation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Visualisation of calcium oxalate crystal macropatterns in plant leaves using an improved fast preparation method.</a> J Microsc. 290 (3), 168-177 (2023).</li>
<li>Li, Y. M., Fei, T., Zhang, H. X., Xie, Z. S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+development+of+leaf+vein+and+stomata+and+identification+of+candidate+transcription+factors+related+to+vein%2Fstoma+development+in+grapevine+leaf+%28Vitis+vinifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Observation of the development of leaf vein and stomata and identification of candidate transcription factors related to vein/stoma development in grapevine leaf (Vitis vinifera L.).</a> Sci Hortic. 307, 111-518 (2023).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>García-Gutiérrez, E., Ortega-Escalona, F., Angeles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+technique+for+clearing+leaf+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid technique for clearing leaf tissues.</a> Appl Plant Sci. 8 (9), e11391(2020).</li>
<li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StomaAI%3A+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytol. 238 (2), 904-915 (2023).</li>
<li>Liu, C., Sack, L., Li, Y., Zhang, J., Yu, K., Zhang, Q., He, N., Yu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+of+stomatal+morphology+to+the+environment+across+plant+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Relationships of stomatal morphology to the environment across plant communities.</a> Nat Commun. 14, 42136(2023).</li>
<li>Lawson, T., Vialet-Chabrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+stomata%2C+photosynthesis+and+plant+water+use+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytolt%22%5BJournal%5D)">Speedy stomata, photosynthesis and plant water use efficiency.</a> New Phytolt. 221 (1), 93-98 (2019).</li>
<li>Stein, R. A., Sheldon, N. D., Smith, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparing+methodologies+for+stomatal+analyses+in+the+context+of+elevated+modern+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">comparing methodologies for stomatal analyses in the context of elevated modern CO2.</a> Life. 14 (1), 78(2024).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2025).</li>
<li>Gibbs, J. A., Burgess, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+deep+learning+for+the+analysis+of+stomata%3A+a+review+of+current+methods+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Application of deep learning for the analysis of stomata: a review of current methods and future directions.</a> J Exp Bot. 75 (21), 6704-6718 (2024).</li>
<li>Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q., Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+stomatal+and+guard+cell+metrics+for+plant+physiology+and+growth+using+StoManager1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measuring stomatal and guard cell metrics for plant physiology and growth using StoManager1.</a> Plant Physiol. 195 (1), 378-394 (2024).</li>
<li>Rikisahedew, J. J., Niinemets, Ü, Scodeller, R., Tosens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+structural+traits+in+Triticum+aestivum+and+Zea+mays+for+C+and+C+photosynthetic+differentiation+using+free-hand+and+semi-thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing structural traits in Triticum aestivum and Zea mays for C and C photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections.</a> J Vis Exp. (209), e66843(2024).</li>
<li>Poole, I., Weyers, J. D. B., Lawson, T., Raven, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+stomatal+density+and+index%3A+implications+for+palaeo+climatic+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Variations in stomatal density and index: implications for palaeo climatic reconstructions.</a> Plant Cell Environ. 19 (6), 705-712 (1996).</li>
<li>Smith, S., Weyers, J. D. B., Berry, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+stomatal+characteristics+over+the+lower+surface+of+Commelina+communis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Variation in stomatal characteristics over the lower surface of Commelina communis leaves.</a> Plant Cell Environ. 12 (6), 653-659 (1989).</li>
<li>Niewiadomski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+illustrated+protocol+for+clearing%2C+mounting%2C+and+imaging+leaf+venation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive illustrated protocol for clearing, mounting, and imaging leaf venation networks.</a> Appl Plant Sci. 13 (2), (2025).</li>
<li>Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeled+temperate+hardwood+tree+stomatal+image+datasets+from+seven+taxa+of+Populus+and+17+hardwood+species%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Labeled temperate hardwood tree stomatal image datasets from seven taxa of Populus and 17 hardwood species.</a> Sci Data. 11 (1), (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Aby uzyskać spójne pomiary szparki, należy pobierać oskórki z centralnej warstwy szparkowej dla standaryzowanych wyników, unikając przy tym dużych żyłek, ponieważ gęstość szparków wykazuje silne zróżnicowanie wewnątrz liścia, malejące w kierunku podstawy liścia, końcówki i brzegów25,26. Świeże liście dają najbardziej niezawodne opanowania, pod warunkiem użycia niekurczącego się, przezroczystego lakieru do paznokci oraz wysokiej jakości przezroczystej taśmy, aby uniknąć zniekształceń lub artefaktów. Opóźnienia powyżej ~12 godzin zmniejszają klarowność konturu przez odwodnienie. Ponieważ peelingi są tymczasowo zamocowane i mogą zatrzymywać powietrze, zaleca się wczesne obrazowanie, ale jakość pozostaje akceptowalna także po miesiącu.
Istnieją różne metody oczyszczania dla konkretnych typów tkanek, celów obrazowych oraz kwestii bezpieczeństwa13, 14, 15. Oczyszczanie chemiczne przeprowadzono za pomocą wodnego protokołu opartego na NaOH ze względu na dostępność, niską toksyczność i szeroką skuteczność we wszystkich typach liści. Ponieważ odpowiedzi tkanek różnią się między gatunkami, konieczne są testy i optymalizacja. Liście twardzonofilne mogą wymagać ≥2 tygodni, a pozostała zielona tkanka może zakłócać barwienie i zaciemniać cechy anatomiczne (Ilustracja uzupełniająca 1C). Dla szybszego oczyszczania stężenie NaOH można zwiększyć do 2,5 M lub 5 M. Miękkie liście stają się delikatne po wybielaniu (Sekcja 3.7; Dodatkowy rysunek 1B), oraz nadmierna ekspozycja na podchloryn sodu (NaClO) mogą rozkładać tkanki lub powodować rozdzielanie warstw naskórka. Podczas gdy 30 sekund do 2 minut wybielania wystarcza na większość miękkich liści, twardsze gatunki mogą wymagać nawet 1 godzinyi 27 minut. Chociaż oczyszczanie jest wolniejsze niż przygotowanie do obierek, wymaga ~5 dni i nie wymaga specjalistycznego szkolenia, można go dostosować do różnorodnych gatunków. Oczyszczone i barwione próbki można przechowywać w wodzie destylowanej w temperaturze 4°C, a zalecane jest stałe montaż dla długoterminowej konserwacji15,27.
Specyficzny dla szparków szparkowy StoManager1 niezawodnie wykrywał kompleksy szparkowe na większości typów obrazów (Ilustracja uzupełniająca 2), a wyniki detekcji są zazwyczaj zgodne z ręczną adnotacją dla metod opartych na peelingu. Jednak pomiary powierzchni szparków szparkowych różniły się systematycznie od pomiarów ręcznych (Tabela 2), co wymagało kalibracji na podstawie niewielkiego ręcznie mierzonego podzbioru (np. 10-20 szparków szparkowych na gatunek) przed analizą na dużą skalę. StoManager1 znacznie zwiększa przepustowość, a w niestandardowych przypadkach wymagana jest ręczna weryfikacja.
Równoczesna segmentacja szparków szparkowych i naskórka jest trudna, ponieważ optymalna ostrość różni się, a heterogeniczność morfologii i klarowności błony powoduje błąd segmentacji. Podobnie trening na dużych zbiorach obrazów (np. powierzchnie adaxialne/abaksjalne, odklejone/wyczyszczone) tracą specyficzność. Nie istnieje wstępnie wytrenowany model Cellpose dla naskórka roślin; Standardowe modele "cyto" i "cyto2", trenowane głównie na komórkach zwierzęcych, osiągają gorsze wyniki na obrazach naskórka. Dlatego dla niezawodności wymagane jest szkolenie indywidualne (Uzupełniająca sekcja 2). Nawet po treningu nadmierna segmentacja i fałszywe alarmy pozostają częste, szczególnie na obrazach o niskim kontraście lub niewyczyszczonych (Ilustracja uzupełniająca 3).
W ilastyku (Sekcja uzupełniająca 3, rysunek uzupełniający 4) maski obiektowe powinny być generowane dla klas komórek docelowych (np. klasa 1 dla naskórka), zachowując maski klasowe do audytu i ręcznej korekty. Przetwarzanie wsadowe i późniejsze workflowy ImageJ/Fiji mogą zaoszczędzić czas i zmniejszyć błędy ręczne. Konsekwentne filtrowanie według powierzchni, odchylenia standardowego lub kwantyli jest niezbędne do tłumienia szumu i fałszywych detekcji. Po przefiltrowaniu mediana powierzchni komórek i liczba komórek zbliżają się do wartości ręcznych. Benchmarking z ręcznymi pomiarami i alternatywnymi narzędziami ML (Weka, RootPainter) pozostaje niezbędny do strojenia parametrów i oceny jakości segmentacji. Przetwarzanie wsadowe w ML jest bardzo wymagające zasobów. Stabilne trenowanie i segmentacja wsad na dużą skalę wymagają karty graficznej obsługującej NVIDIA CUDA oraz ≥32 GB RAM. W systemach średniej klasy (np. 16 GB RAM z zintegrowaną grafiką) nadzorowane szkolenie zazwyczaj zajmuje ~5-10 minut na obrazy <10 i często zawiesza się, gdy używano wielu klas adnotacji lub heterogenicznych typów obrazów. CUDA zwiększyła prędkość przetwarzania o ~10-20 razy w porównaniu do wykonania CPU lub zintegrowanej GPU.
Różnice w wydajności między Cellpose, ilastik i StoManager1 wynikają z ich odrębnych reprezentacji cech. Cellpose przewiduje pola wektorowo-przepływowe w kierunku centrów obiektów i jest wrażliwa na aureole optyczne oraz nagłe granice załamania, które zakłócają przepływ i generują skupiska fałszywych alarmów w oczyszczonym F. excelsior. Ilastik, jako klasyfikator pikseli prowadzony przez człowieka, przecina wysokoreliefowe ściany komórkowe lub halo nawierzchni, chyba że wyraźnie oznaczono jako tło. StoManager1 wykrywa kompleksy szparkowe za pomocą wzorców kształtów na poziomie obiektu (parowane komórki strażnicze z centralnym porem) i dobrze sprawdza się na preparatach oskórki, w tym F. excelsior28; jednak rozmycie wywołane halo wpływa na widoczność porów podczas oczyszczania, powodując fałszywe negatywy, a nie błędną klasyfikację (sekcje 1 i 3 pliku uzupełniającego). W związku z tym Cellpose i StoManager1 działają jako automatyczne segmentery, podczas gdy ilastik pełni funkcję klasyfikatora sterowanego przez człowieka (Supplementary filesection 1-3)28.
Architektura komórek specyficznych dla gatunku moduluje wydajność AI. W T. officinale gładkie, eliptyczne marginesy komórek ochronnych odpowiadają rozkładowi treningowemu StoManager1, umożliwiając wykrywanie na odklejonych próbkach (Ilustracja uzupełniająca 2), podczas gdy narzędzia ogólne często myliły komórki strażnicze i nawierzchniowe. U F. excelsior zagłębione szparki szparkowe i komórki nawierzchni o wysokim reliefie prowadzą do fałszywych negatywów na czystych obrazach. Te rozbieżności odzwierciedlają geometrię obrazowania zależną od gatunku i przygotowania. Systematyczne różnice między pomiarami ręcznymi a opartymi na AI wynikają z dwóch źródeł: braku kodowania skali z obrazu przez AI oraz artefaktów optycznych wywołanych przez przygotowanie. Strategie łagodzące obejmują wizualną triażę rozmyć i aureoliek powstałych w przygotowaniu tkanek, preferencyjne stosowanie peelingów w warunkach opisanych powyżej, ręczną kalibrację z korektą liniową na niewielkim podzbiorze szparków szparkowych (manualnie = a + b × AI). Dodatkowe strategie obejmują uzupełnianie specyficzne dla taksonu oraz projektowanie klas pomocniczych do treningu (jednak własne wytrenowane modele prawdopodobnie pozostaną niższe niż modele wstępnie wytrenowane na dużych, zróżnicowanych zbiorach danych) oraz filtrowanie górnych kwantyli po segmentacji.
Ponieważ błędy segmentacji AI są systematyczne, nielosowe, niezbędne jest postprocessing. Diagnostyka o jakości obrazu może opierać się na prostym drzewie decyzyjnym. Zacznij od sprawdzenia kontrastu i ostrości naskórka: jeśli ostre, przejdź do fałszywie pozytywnych wyników; Jeśli są rozmyte, spodziewaj się drobnych artefaktów wysokiej częstotliwości i dostosuj filtry. Jeśli fałszywie pozytywne wyniki (np. kropki, zanieczyszczenia) są minimalne, zwykle wystarczy filtrowanie odstających ±2-3 SD. Jeśli dominują drobne artefakty, stosuj filtrowanie oparte na kwantyle. Następnie porównaj rozkłady cech (np. mediana Ae) z oczekiwaniami biologicznymi lub danymi ręcznymi. Doprecyzuj progi w razie potrzeby – utrzymywanie tylko górnych 10-50% kwantyli w zbiorach danych bogatych w artefakty zapewnia istotne wyniki (Ilustracje uzupełniające 7 i 8). Ze względu na wysokie wskaźniki fałszywie pozytywnych wyników generowanych przez narzędzia ML naskórka, wiarygodne oszacowania gęstości szparków szparkowych nie mogły być automatycznie oszacowane, podczas gdy StoManager1 zapewniał precyzyjne pomiary szparkiszparkowej 28, gdy granice były wyraźne (patrz Rysunki 6 i 7). Dla mediany naskórkowej Ae okazała się odporna, mniej wrażliwa na małe fałszywe pozytywne wyniki niż średnia.
Wybór metody wpływał na wykrywanie cech. Peeling przewyższał usuwanie gęstości szparków szparkowych dzięki całkowitemu odsłonięciu szparków (Rysunek 3), podczas gdy usuwanie często zasłaniało mniejsze szparki w tkankach warstwowych lub pigmentowanych, mimo że czasem lepiej zachowywało kształt szparkówszparkowych 27. Wśród narzędzi AI StoManager1 konsekwentnie zapewniał solidne pomiary szparków szparkowych przy minimalnym selekcji, szczególnie na preparatach peelingowych23, a peeling poprawiał także pomiary naskórka poprzez zwiększenie prawidłowo zidentyfikowanych komórek i pokrycia obrazów2. Przyszłe korzyści najprawdopodobniej przyniosą duże, taksonomicznie zróżnicowane, wcześniej wytrenowane modele integrujące się z zautomatyzowanymi pipeline'ami obrazowania dla ekofizjologii i poprawy upraw.

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory w naskórku, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wymiany gazowej i transpiracji roślin. Dlatego zrozumienie morfologicznych podstaw funkcjonowania szparków szparkowych jest kluczowe dla poprawy wydajności upraw1. Podczas gdy większość badań nad strukturą i funkcją szparków szparkowych koncentruje się wyłącznie na morfologii szparki, pełne zrozumienie ich reakcji wymaga również charakteryzacji rozmiaru i kształtu otaczających komórek naskórka. Dokładne określenie tych cech jest kluczowe dla zrozumienia relacji struktura-funkcja leżących u podstaw wymiany gazowej i poprawy upraw.
Ponieważ poprawa upraw coraz bardziej opiera się na zaawansowanych metodach edycji genów, kluczowe jest zrozumienie kluczowych cech morfologicznych – takich jak szparki szparkowe – które wpływają na fotosyntezę, efektywność zużycia wody oraz przyrost węgla. Ta potrzeba jest szczególnie pilna w obliczu trwających zmian środowiskowych, gdy rośnie zapotrzebowanie na odporne uprawy, które zachowują zarówno zdolność fotosyntetyczną, jak i plony, w obliczu częstszych susz i fal upałów 2,3. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustandaryzowanych protokołów obrazowania i analizy. Peeling szparków szparkowych z użyciem lakieru/lakieru do paznokci to najprostsza metoda uzyskania odcisków na powierzchni liści, aby zmierzyć rozmiar, kształt i gęstość szparków szparkowych i naskórka 4,5,6. Procedura jest szybka, nieniszcząca, co pozwala na szybkie przetwarzanie próbek. Metoda oczyszczania tkanek to alternatywne podejście umożliwiające jednoczesną charakterystykę sieci żył oraz potencjalnie bardziej kompleksową charakterystykę hydrauliki liści.
Chemiczne oczyszczanie zmiękcza i sprawia, że tkanki stają się optycznie przezroczyste, umożliwiając obrazowanie in situ komórek szparków szparkowych i naskórka bez zakłóceń mechanicznych. Oczyszczanie jest szeroko stosowane w różnych typach tkanek, w tym w próbkach suszonych lub delikatnych, i może być wykorzystywane nie tylko do obrazowania szparków szparkowych, ale także do wizualizacji sieci żyłkowych, obrazowania fluorescencyjnego oraz wewnętrznych struktur anatomicznych 7,8,9,10,11,12 , co pozwala na analizę cech szparkowych obok innych cech funkcjonalnych. Istnieją różne metody oczyszczania, obejmujące rozpuszczalniki organiczne, roztwory wodne, hiperhydratację lub osadzanie hydrożelu 13,14,15. Różnią się one czasem trwania, kompatybilnością obrazowania oraz dostępnością odczynników. Stosowany tutaj protokół jest prosty, opłacalny i nie wymaga specjalistycznych umiejętności. Obie techniki są tanie i szybkie w porównaniu do bardziej pracochłonnych metod, takich jak mikroskopia świetlna czy skaningowa mikroskopia elektronowa, które wymagają chemicznego utrwalania, osadzania i sekcjonowania próbek.
Tradycyjne metody analizy cech szparków szparkowych i naskórka często opierają się na ręcznej segmentacji obrazów mikroskopowych, co jest pracochłonne, czasochłonne i podlega błędom obserwatora, ograniczającym przepustowość i zmniejszającym efektywność pipeline'u analitycznego16. Ponadto cechy anatomiczne, takie jak trichomy i nieregularne ściany komórkowe, stanowią dodatkowe wyzwania dla spójnego ilościowego określania cech. Chociaż zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazów dają duże obietnice dla wysokoprzepustowej ekstrakcji danych, zostały zoptymalizowane pod kątem konkretnych tkanek roślinnych i nie są łatwo przenosalne między typami liści i metodami przygotowania. Na przykład StoManager1 (Ilustracja uzupełniająca 1) zapewnia wysoką dokładność wykrywania szparków szparkowych przy użyciu modelu wykrywania obiektów opartego na YOLOv8, ale jest specjalnie trenowany pod kątem cech szparkowych. Cellpose (Ilustracja uzupełniająca 2) to duży, wstępnie wytrenowany, ogólny model segmentacji, który dobrze się sprawdza, gdy dane wejściowe przypominają jego modele wstępnie wytrenowane (np. cyto, cyto2), oparte pierwotnie na komórkach zwierzęcych i organellach. Ilastik (Ilustracja Uzupełniająca 3) to narzędzie klasyfikacyjne oparte na pikselach, oparte na adnotacjach zdefiniowanych przez użytkownika. Zarówno Cellpose, jak i Ilastik są przyjazne dla użytkownika, ale każdy z nich może wymagać ponownego trenowania lub dostrojenia, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu, artefaktach tła i cechach specyficznych dla tkanek.
Ponadto morfologia szparków szparkowych i naskórka wykazuje dużą zmienność w poszczególnych gatunkach17. Cechy takie jak gęstość i rozmiar szparków szparkowych są szczególnie zmienne, jednak zazwyczaj są odwrotnie powiązane i razem determinują różnice gatunkowe w kinetyce szparki. Większe szparki szparkowe mogą częściowo kompensować niższą gęstość, ale zazwyczaj wykazują wolniejszą kinetykę5, co może być niekorzystne podczas coraz częstszych fal upałów, gdzie szybkie reakcje szparków są kluczowe dla utrzymania asymilacji węgla i zapobiegania nadmiernej utracie wody. Łącznie ta zmienność utrudnia pomiar cech szparków szparkowych i może osłabić wiarygodność wybranego protokołu oraz odporność wyników opartych na AI.
Protokół ten integruje dwie klasyczne techniki przygotowawcze – peelingi naskórkowe i chemiczne oczyszczania – z nowoczesnymi narzędziami sztucznej inteligencji (AI) i uczenia maszynowego (ML) do segmentacji i pomiaru cech. Wykorzystując dwa powszechne gatunki dwukątnych o dwóch powszechnych gatunkach dwukątnych wymagających światła o kontrastujących strategiach ekologicznych (F. excelsior i T. officinale), zbadaliśmy zmienność cech szparkowych i naskórkowych, aby ocenić, jak trzy metody się porównują i gdzie mogą pojawić się potencjalne nieścisłości. Oceniono wydajność trzech narzędzi AI: StoManager1 (model głębokiego uczenia opartego na YOLOv8 do wykrywania szparków szparkowych), Cellpose (ogólne narzędzie do segmentacji głębokiego uczenia) oraz ilastik (klasyfikator pikselowy dla tkanek naskórkowych). To integracyjne podejście umożliwia powtarzalną, wysokoprzepustową ilościową ilościową identyfikację cech szparkowych i naskórkowych, oferując solidne i skalowalne ramy do analizy fenotypowej zarówno w badaniach ekologicznych, jak i rolniczych. Jednak cechy anatomiczne, takie jak gęste trichome, grube skórki czy niski kontrast między granicami komórek, mogą obniżać dokładność segmentacji i powinny być brane pod uwagę przy wyborze między metodami obierania a oczyszczania oraz przy stosowaniu ilościfikacji opartej na AI.
Z naszej wiedzy jest to pierwszy krok po kroku protokół porównujący bezpośrednio peeling naskórkowy i metody chemicznego oczyszczania w połączeniu z wieloma narzędziami segmentacyjnymi opartymi na AI, aby kwantyfikować cechy szparkowe i naskórki. Łącząc klasyczne techniki mikroskopii z dostępnymi workflowami ML, protokół zmniejsza stronniczość użytkownika, zwiększa przepustowość i ułatwia powtarzalne fenotypowanie między gatunkami. Dzięki temu podejście jest szeroko stosowane w ekologii, poprawie upraw oraz badaniach nad zmianami klimatu, a także stanowi podstawę do ciągłego rozszerzania narzędzi poprzez przeszkolenie modeli lub naukę transferową.

<table><tbody><tr><td>Dezynfekujący płyn do czyszczenia NaClO &lt; 5%</td><td>Domestos, Wielka Brytania</td><td>H000023244</td><td>  Oparzenia skóry  </td></tr><tr><td>Disodowy fosforan wodoru (Na2HPO4. 2H2O) </td><td>PENTA, CZ</td><td>10028-24-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>Etanol, abs. 100% a.r.</td><td>Chem-Lab NV, BE</td><td>CL00.0505.1000</td><td>  Wysoce łatwopalny </td></tr><tr><td>Fiolka szklana 2 mL</td><td>VWR Life Science, USA</td><td>548-0045</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glutaraldehydu 50%</td><td>VWR Life Science, USA</td><td>23H2856331</td><td>Śmiertelne przy wdychaniu. Toksyczny po połknięciu. Noś rękawiczki ochronne,   odzież i inne ubrania; okulary.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Normax, PT</td><td>5470308A</td><td>NA</td></tr><tr><td>Lakier do pielęgnacji paznokci szybko schnący</td><td>B<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/69615/69615eq3.jpg" style="margin: auto; ">K (INEZA), porucznik</td><td>LT-02244</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 i Nikon DS0Fi1 5 MP</td><td>Nikon Corporation, JP</td><td>https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipeta i końcówki pipety</td><td>Thermo Scientific, FI</td><td>KJ16047</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ostrza stalowe jednokraczne</td><td>Instrumenty oksfordzkie</td><td>51-1625-0182</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dihydrofosforan sodu (NaH2PO4 . 2H2O) czysty</td><td>PENTA, CZ</td><td>13472-35-0</td><td>NA</td></tr><tr><td>Czyste pellety wodorotlenku sodu (NaOH)</td><td>Merck KGaA, DE</td><td>1310-73-2</td><td>Poważne oparzenia.</td></tr><tr><td>Taśma papierowa przezroczysta</td><td>FOROFIS, LV</td><td>91231</td><td>NA</td></tr><tr><td>Toluidynowy błękit, klasa ogólnego przeznaczenia</td><td>ThermoFisher Scientific, GB</td><td>2045836</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na ai

Characterizing Stomatal and Epidermal Traits Using Peels, Clearing, and AI-Based Image Analysis

Dokładna charakterystyka morfologii szparki szparkowej oraz otaczających cech naskórka jest niezbędna do zrozumienia funkcji szparki. Przedstawiono protokół porównawczy z wykorzystaniem dwóch uzupełniających się technik – peelingów naskórnych i usuwania liści – aby ocenić rozmiar, kształt i gęstość komórek szparkowych i naskórnych u dwóch ekologicznie odrębnych gatunków dwukątnych: Fraxinus excelsior i Taraxacum officinale. Protokół obejmuje szczegółowe kroki przygotowania próbki, obrazowania i kwantyfikacji cech z wykorzystaniem kosztowo i efektywnych prac pomiarów ręcznych (czyszczenie tkanek i obieranie) oraz analizy obrazów wspomaganej AI, które mogą ułatwić zastosowania o wysokiej przepustowości. Oceniono trzy narzędzia segmentacji – model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8, ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek oraz klasyfikator oparty na pikselach – pod kątem ich dokładności i przydatności w różnych metodach. Istotne różnice w cechach szparkowych i naskórnych są konsekwentnie obserwowane pomiędzy technikami obierania i oczyszczania zarówno w analizach ręcznych, jak i AI. Narzędzia AI umożliwiły powtarzalną ilościowość, przy czym model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8 (StoManager1) najlepiej sprawdza się dla cech szparkowych, a ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek (Cellpose) dla segmentacji naskórka. Wykrywanie cech opartych na AI było bardzo spójne u T. officinale , ale ograniczone w F. excelsior; wyniki nadal różniły się od pomiarów ręcznych, co ilustruje, jak anatomia specyficzna dla gatunku i jakość obrazu wpływają na odpowiedniość metody. Wyniki te sugerują, że choć analiza wspomagana przez AI stanowi użyteczne ramy do kwantyfikacji cech szparkowych i naskórkowych, walidacja ekspertów i testy pilotażowe pozostają niezbędne przed szerszym lub wysokoprzepustowym zastosowaniem.

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Accurate characterization of stomatal morphology and surrounding epidermal traits is essential for understanding stomatal function. A comparative protocol ...

characterizing-stomatal-epidermal-traits-using-peels-clearing-ai

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Odkrycie, w jaki sposób fizjologia i morfologia są ze sobą powiązane, pozwala na głębsze zrozumienie mechanistycznego funkcjonowania liści roślin. Przedstawiono zarówno procedurę wyprowadzania parametrów regulacji aparatów szparkowych na podstawie pomiarów przewodności aparatów szparkowych, jak i korelacje z tradycyjnymi funkcjonalnymi cechami liści.

Powiązanie przewodnictwa aparatów szparkowych z cechami funkcjonalnymi liści

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.

Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Centre of Estonian Rural Research and Knowledge.  This protocol presents a comparative method to assess stomatal and epidermal traits in two distinct species using epidermal peels, clearing techniques, and AI-assisted image analysis. The goal is to enable high-throughput, reproducible quantification of cellular structures underlying stomatal function for agricultural applications and broad plant research.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Przeglądaj więcej filmów