Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Nasze badania koncentrują się na identyfikacji inhibitorów blokujących wejście do SARS-CoV-2 za pomocą systemów pseudowirusowych. Badanie wejścia w SARS-CoV-2 często wymaga laboratoriów o wysokim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, zazwyczaj BSL-3. Protokół ten umożliwia bezpieczne badania antywirusowe stosowane w pseudowirusach w standardowych laboratoriach BSL-2.

Na początek umieść sześciodołkową płytkę do hodowli tkanek w szafce biosafety i nasiaj 7,5 razy 10 do mocy pięciu komórek pochodzenia HEK 293 na odwierć w dwóch mililitrach kompletnego nośnika. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia potwierdź, że komórki osiągnęły około 50 do 60% konfluencji.

Następnego dnia przygotuj roztwór polietyliminy lub PEI, dodając pięć mikrolitrów jednego miligramu na mililitr zapasu PEI do 50 mikrolitrów zredukowanego medium surowicy w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. W osobnej mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra przygotuj roztwór DNA, dodając 2,5 mikrograma plazmidu GFP ekspresyjnego do 50 mikrolitrów tego samego nośnika. Krótko wymieszaj każdą probówkę przez wirowanie, następnie skręć przez pięć sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej.

Podczas 10-minutowego okresu inkubacji ostrożnie usuń podłoże z każdej dołki na płytce sześciodołkowej, nie zakłócając monowarstwy komórkowej, i dodaj do każdej jamki po mililitrze kompletnego pożywka transfekcyjnego bez antybiotyków. Po inkubacji należy dodać 50 mikrolitrów roztworu DNA do probówki zawierającej roztwór PEI. Szybko wymieszaj, pipetując sześć razy i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzy minuty.

Następnie szybko dodaj kompleks DNA PEI kroplami do odpowiedniego dołku. Teraz uszczelnij krawędzie płyty parafilmem i wiruj w wirówce przy 1000 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy, używając wirnika obrotowego i wiadra płytowego. Po wirowaniu delikatnie usuń parafilm i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny.

Następnie delikatnie zastąpić podłoże transfekcyjne w każdym dołku dwoma mililitrami podgrzewanego gotowego medium DMEM. Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin i oceń efektywność transfekcji, oceniając ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Seed HEK 293T wyprowadził komórki na dwie płyty z 6 dołkami, jak pokazano wcześniej.

Jedną płytkę należy wyznaczyć do generowania pseudowirusów SARS-CoV-2 ze spike, a drugą do pseudowirusów VSVG. Przygotuj mieszankę transfekcyjną i kompleksy DNA PEI w dniu eksperymentu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji ostrożnie usuwaj medium z każdej z sześciu płyt dołków, nie zakłócając monowarstwy komórkowej.

Powoli dodawaj do każdego dołku jeden mililitr podgrzewanego podgrzewczego całkowicie transfekcyjnego medium bez antybiotyków, pozwalając podłożu spływać wzdłuż ściany studni. Dodaj przygotowane kompleksy transfekcyjne do komórek, aby je transfekować, jak pokazano wcześniej. Po 48 godzinach inkubacji po transfekcji należy zebrać supernatanty z każdego odwiertu do 50-mililitrowej sterylnej stożkowej wirówki i wirować w 290 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zbierz bezkomórkowy supernatant i przefiltruj go przez sterylny filtr z butelki o średnicy 0,45 mikrometra z poliwinylinofluorkiem na wierzchu. Przygotuj alikwoty 1 mililitra filtrowanego supernatantu i przechowuj je w temperaturze 2,5 razy 10 stopni Celsjusza do mocy czterech komórek HSI, linii komórkowej o wysokiej podatności na SARS-CoV-2, w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM na dołek w 96-dołkowej płycie do hodowli tkankowej. Przygotuj i oznacz potrójne dołki dla każdego stanu do badania, w tym zakażenia pseudowirusem bez iskry oraz kontrolnych osób niezakażonych.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez noc. W dniu transdukcji rozmroz jedną aliquotę każdej partii pseudowirusa na lodzie i delikatnie wymieszaj przez inwersję, w tym jedną aliquot kontroli bez kolców. Należy dodać wymagane ilości preparatu pseudowirusa bezpośrednio do wyznaczonych dołków.

Reguluj objętość każdego dołka do 150 mikrolitrów przy pełnym DMEM. Teraz uszczelnij płytę parafilmem i zachwyć w wirówce przy 2 500 G przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Usuń uszczelkę parafilmową i inkubuj płytkę przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po inkubacji przygotuj odczynniki do testu lucyferazowego zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmroź podłoże z lucyferazy i bufor lizy z testu 5X lucyferazy w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Rozcieńcz bufor lizy testu 5X z lucyferazą do 1X sterylnej wody.

Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant. Następnie do każdego dołku dodaj 30 mikrolitrów buforu lizycznego 1X. Umieść talerz na potrząsaczce i potrząsaj przez 10 minut z prędkością 150 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej.

Zweryfikować pełną lizę komórek pod mikroskopem odwróconym, aby potwierdzić, że komórki są w pełni zlizowane i nie da się ich rozróżnić. Następnie przelej lizaty na nieprzezroczystą białą płytkę o 96 dołkach. Do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów substratu z lucyferazą.

Wymieszaj krótko, delikatnie poruszając płytką w okrężnym ruchu, umieść ją w luminometrze i mierz luminescencję. Nasiono 2,5 razy 10 do mocy czterech komórek HSI w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM na odwiert w płycie 96-dołkowej, jak opisano wcześniej. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia przygotuj jedną do trzech seryjną rozcieńczeń związków do badania, takich jak arbidol w pełnym DMEM zawierającym 0,5% dimetylosulfenoksen. Używając pipety wielokanałowej, delikatnie zasysaj medium z każdej dołki. Dodaj 50 mikrolitrów odpowiadającego rozcieńczenia związku do każdej dołki, a do kolumny 12 dołków kontrolnych dodaj tylko cały DMEM.

Inkubuj przez godzinę w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Bez usuwania związków należy bezpośrednio dodać 50 mikrolitrów pseudowirusa kolczastego SARS-CoV-2 do każdego dołka rozcieńczonego w kompletnym medium zawierającym te same stężenia związku. Uszczelnij płytę parfilmem.

Wirówka w temperaturze 2 500 G przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Po usunięciu parfilmu inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Na koniec, ilościowo określ zakaźność za pomocą testu lucyferazowego, jak wykazano wcześniej.

Transfekcja komórek pochodzących z HEK 293T z rozgałęzionymi PEI skutkowała wysoką efektywnością transfekcji, co skutkowało około 70% dodatnimi komórkami GFP. 48 godzin po transfekcji. Zakażenie podatnych komórek HSI malejącą ilością pseudowirusów SARS-CoV-2 lub pseudowirusów VSVG wykazało zależny od dawki wzrost luminescencji wraz ze wzrostem liczby pseudowirusów.

Pseudowirusy bez spike'ów i niezainfekowane komórki wykazywały bardzo niski poziom luminescencji. Związek arbidol został przetestowany pod kątem zdolności hamowania wejścia do pseudowirusa i wykazał wyraźną odpowiedź dawkową aktywności lucyferazy wywołanej przez pseudowirusy spike, przy mniejszym zahamowaniu zaobserwowanym dla pseudowirusów VSVG. Test wykazał współczynnik Z (Z) wynoszący 0,54, co wskazuje na przydatność do celów przesiewowych.

Leczenie arbidolem w stężeniach zaczynających się od 30 mikromolów nie wpłynęło istotnie na żywotność komórek w porównaniu z komórkami leczonymi samym nośnikiem dimetylosulfoksidu 0,5%. Protokół ten umożliwiał produkcję pseudowirusów o wysokim mianie w warunkach optymalnych. Pozwala to naukowcom mierzyć wejście pseudowirusa i identyfikować związki hamujące infekcję wywołaną impulsem SARS-CoV-2.

Wysoka wydajność transfekcji jest kluczowa do generowania pseudowirusów o wysokiej mianie oraz uzyskania wiarygodnych sygnałów infekcji w dalszych testach. System ten wspiera wysokoprzepustowe badania antywirusowe oraz dewaluację inhibitorów wejścia wobec nowych wariantów SARS-CoV-2 i może być łatwo adaptowany do generowania pseudowirusów wykazujących białka otoczkowe pochodzące z innych wirusów.