Name: Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj protokół generowania pseudowirusów SARS-CoV-2 opartych na MLV do bezpiecznego badania wejścia wirusowego i przesiewania inhibitorów w warunkach BSL-2. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe odkrywanie leków przeciwwirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sistema Nacional de Investigación (SNI) oraz Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT, Panamá) za wsparcie finansowe w ramach kontraktu SENACYT nr 031-2022 oraz kontraktu SNI nr 050-2023. Jesteśmy również bardzo wdzięczni dr. Gary'emu Whittakerowi za przekazanie plazmidów pCMV-MLVgagpol i pTG-Luc.

<ol><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+and+emerging+variants%3A+Unmasking+structure%2C+function%2C+infection%2C+and+immune+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms.</a> Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).</li>
<li>Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+SARS-CoV-2+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (1), 3-20 (2022).</li>
<li>Le, K., Kannappan, S., Kim, T., Lee, J. H., Lee, H. -R., Kim, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+understanding+of+SARS-CoV-2+virus+entry+to+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Structural understanding of SARS-CoV-2 virus entry to host cells.</a> Front Mol Biosci. 10, 1288686(2023).</li>
<li>Ayoub, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+SARS-CoV-2+spike+glycoproteins+for+pseudotyping+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Virol%22%5BJournal%5D)">Improved SARS-CoV-2 spike glycoproteins for pseudotyping lentiviral vectors.</a> Front Virol. 1, 793320(2021).</li>
<li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+measures+for+preventing+infection+from+COVID-19+in+clinical+laboratories%3AIFCC+Taskforce+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories:IFCC Taskforce Recommendations.</a> Clin Chem Lab Med. 58 (7), 1053-1062 (2020).</li>
<li>Cruz-Cardenas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pseudovirus-based+platform+to+measure+neutralizing+antibodies+in+Mexico+using+SARS-CoV-2+as+proof-of-concept%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept.</a> Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).</li>
<li>Rizatdinova, S. N., Ershova, A. E., Astrakhantseva, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyped+viruses%3A+A+useful+platform+for+pre-clinical+studies+conducted+in+a+BSL-2+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Pseudotyped viruses: A useful platform for pre-clinical studies conducted in a BSL-2 laboratory setting.</a> Biomolecules. 15 (1), 135(2025).</li>
<li>Millet, J. K., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+%28MLV%29-based+coronavirus+spike-pseudotyped+particle+production+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus (MLV)-based coronavirus spike-pseudotyped particle production and infection.</a> Bio Protoc. 6 (23), e2035(2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pseudotyped+particles+to+study+highly+pathogenic+coronaviruses+in+a+biosafety+level+2+setting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting.</a> J Vis Exp. (145), e59010(2019).</li>
<li>Eichler, M., Aksi, E., Pfeilschifter, J., Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudotyped+virus+particles+to+monitor+Ebola+virus+and+SARS-CoV-2+viral+entry+in+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of pseudotyped virus particles to monitor Ebola virus and SARS-CoV-2 viral entry in human cell lines.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100818(2021).</li>
<li>Thomas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pseudo-typed+virus+particle+based+method+to+determine+the+efficacy+of+virucidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a pseudo-typed virus particle based method to determine the efficacy of virucidal agents.</a> Sci Rep. 14 (1), 2174(2024).</li>
<li>Yang, S., Zhou, X., Li, R., Fu, X., Sun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PEI-based+transfection+method+for+transient+transfection+and+lentiviral+production%3APEI-based+transfection+for+lentiviral+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized PEI-based transfection method for transient transfection and lentiviral production:PEI-based transfection for lentiviral production.</a> Curr Protoc Chem Biol. 9 (3), 147-157 (2017).</li>
<li>Gee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nanovesicles+for+packaging+of+CRISPR-Cas9+protein+and+sgRNA+to+induce+therapeutic+exon+skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping.</a> Nat Commun. 11 (1), 1334(2020).</li>
<li>Ferrara, F., Temperton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+neutralization+assays%3AFrom+laboratory+bench+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pseudotype neutralization assays:From laboratory bench to data analysis.</a> Methods Protoc. 1 (1), 8(2018).</li>
<li>Soneoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+three-plasmid+expression+system+for+the+production+of+high+titer+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 23 (4), 628-633 (1995).</li>
<li>Chen, Y., Miller, W. M., Aiyar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+efficiency+of+pantropic+retroviral+vectors+is+controlled+by+the+envelope+plasmid+to+vector+plasmid+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Transduction efficiency of pantropic retroviral vectors is controlled by the envelope plasmid to vector plasmid ratio.</a> Biotechnol Prog. 21 (1), 274-282 (2005).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3AIdentification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses:Identification of receptor-deficient cell lines.</a> J Virol. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Giroglou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vectors+pseudotyped+with+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+S+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein.</a> J Virol. 78 (17), 9007-9015 (2004).</li>
<li>Ma, M., Kersten, D. B., Kamrud, K. I., Wool-Lewis, R. J., Schmaljohn, C., González-Scarano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+bunyaviruses%3AA+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan bunyaviruses:A system for analysis of cell tropism.</a> Virus Res. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Bruett, L., Clements, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+murine+leukemia+virus+vectors+pseudotyped+with+the+visna+virus+envelope+show+expanded+visna+virus+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism.</a> J Virol. 75 (23), 11464-11473 (2001).</li>
<li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+retroviral+pseudotypes+with+influenza+hemagglutinins+from+H1%2C+H3%2C+and+H5+subtypes+for+sensitive+and+specific+detection+of+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies.</a> J Virol Methods. 153 (2), 111-119 (2008).</li>
<li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).</li>
<li>Sholukh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-based+and+surrogate+SARS-CoV-2+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-based and surrogate SARS-CoV-2 neutralization assays.</a> J Clin Microbiol. 59 (10), e0052721(2021).</li>
<li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine%2C+antiviral-drugs%2C+and+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiol Res. 258, 126993(2022).</li>
<li>Johnson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+pseudotyping+conditions+for+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimized pseudotyping conditions for the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> J Virol. 94 (21), e01062-e01120 (2020).</li>
<li>Xiaojie, S., Yu, L., Lei, Y., Guang, Y., Min, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibodies+targeting+SARS-CoV-2+spike+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibodies targeting SARS-CoV-2 spike protein.</a> Stem Cell Res. 50, 102125(2021).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+of+picomolar+SARS-CoV-2+miniprotein+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors.</a> Science. 370 (6515), 426-431 (2020).</li>
<li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).</li>
<li>Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repurposed+ACE2+inhibitors%3ASARS-CoV-2+entry+blockers+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19.</a> Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).</li>
<li>Alqaaf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+natural+products+as+potential+inhibitors+of+SARS-CoV-2+spike+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins.</a> Sci Rep. 15 (1), 200(2025).</li>
<li>Chan, C. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+small-molecule+inhibitors+of+SARS-CoV-2+by+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics.</a> Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+by+recombinant+ACE2-Ig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig.</a> Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-influenza+virus+drug%2C+arbidol+is+an+efficient+inhibitor+of+SARS-CoV-2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro.</a> Cell Discov. 6 (1), 28(2020).</li>
<li>Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbidol%3AThe+current+demand%2C+strategies%2C+and+antiviral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms.</a> Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta wszechstronność systemu MLV do generowania pseudotypów dla innych wirusów została opisana przez inne ważne wirusy, takie jak wirus Ebola18, MERS-CoV8, SARS-CoV19, wirus La Crosse20, Hantawirus20, wirus Wisna21, Arenawirus22, wirus grypy23 i inne. Te pseudotypy okazały się bardzo przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w badaniu t...

Pojawienie się ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) pod koniec 2019 roku doprowadziło do globalnej pandemii, która spowodowała miliony zgonów na całym świecie i nadal stanowi zagrożenie poprzez nowe warianty o zwiększonej zakaźności i potencjale ucieczki immunologicznej1. Jako wirus RNA z rodziny Coronaviridae, SARS-CoV-2 wykorzystuje glikoproteinę trimerycznego kolca (S) do pośredniczenia w wejściu komórki gospodarza poprzez wiązanie się z receptorem enzymu 2 (ACE2) konwertującego angiotensynę i aktywację proteolityczną przez TMPRSS2 oraz inne proteazygospodarza 2,3. Chociaż opracowano kilka opcji leczenia w celu łagodzenia objawów COVID-19, ciągły rozwój i szybki rozwój wariantów wirusowych podkreślają pilną potrzebę bezpiecznych i skalowalnych systemów do badania przenikania wirusa oraz oceny nowych związków przeciwwirusowych wymierzonych w ten wczesny etap zakażenia4.
Wirus SARS-CoV-2 pozostaje klasyfikowany jako środek bezpieczeństwa biologicznego poziomu5 w niektórych regionach ze względu na wysoki potencjał transmisji. Dlatego każde laboratorium replikacyjne wymaga posiadania obiektu o wysokiej izolacji BSL-3, co utrudnia większości laboratoriów w terenie prowadzenie badań naukowych z tym wirusem. Systemy oparte na pseudotypach wirusów, znane również jako pseudowirusy (PV), stanowią praktyczną alternatywę umożliwiającą badania wejścia wirusa w laboratoriach poziomu biosafety 2 (BSL-2), poszerzając dostępność dla globalnych badańnaukowych 6. Pseudotypowane cząstki zawierające białko kolczaste SARS-CoV-2 nie replikują się, co czyni je bezpiecznym zastępcą do oceny wejścia wirusa i przesiewu pod kątem inhibitorów małych cząsteczek7. Cząstki te mogą być zaprojektowane tak, aby przenosiły gen reportera lucyferazy lub fluorescencyjnego, umożliwiając szybkie i ilościowe wykrywanie infekcji poprzez pomiar sygnału reportera w zakażonych komórkach. Systemy oparte na wirusie białaczki mysiej (MLV) lub szkieletach lentiwirusa były szeroko wykorzystywane do badania wejścia SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, wirusa Ebola, między innymi 8,9,10,11.
W tych protokołach opisujemy generowanie PV opartych na MLV przy użyciu systemu trójplazmidowego, na podstawie badań przedstawionych przez Milleta i Whittakera8. Plazmidy używane obejmują plazmid opakujący geny rdzeniowe MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), wektor transferowy kodujący gen reporterowy lucyferazę (pTG-Luc) oraz plazmid ekspresujący glikoproteinę kolczastego SARS-CoV-2 odpowiadającą oryginalnemu wariantowi Wuhan-Hu-1. Dodatkowo pseudowirusy są również generowane przy użyciu G-glikoproteiny wirusa wirusa szparki szparkowej (VSV-G), które później służą do przesiewania potencjalnych trafień. Pseudowirusy powstają w komórkach pochodzących z HEK293 i służą do infekowania bardzo podatnych komórek stabilnie wyrażających hACE2 i TMPRSS2. Wydajność transfekcji jest najpierw oceniana za pomocą plazmidu ekspresującego zielone fluorescencyjne białko (GFP). Następnie, stosując zoptymalizowane warunki transfekcji, PV generuje się przez współtransfekcję tych trzech plazmidów, a następnie miareczkowanie powstałych wirusów. Przy odpowiedniej ilości PV przeprowadza się test na płytkach z 96 dołkami w celu przesiewania związków zdolnych do powstrzymania przedostania się wirusów. Protokół ten wykorzystuje rozgałęzioną polietyliminę (PEI) jako opłacalny odczynnik transfekcyjny, co ułatwia wdrażanie procedur.

<table><tbody><tr><td>0,2 & mikro; m Filtry strzykawkowe o niskiej zawartości wiążących białko&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>720-1320</td><td>Filtry strzykawkowe (0,2 &mu; m,13 mm, PES, bezpłodny)</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA 1X roztwór</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>0,45 & mikro; m PVDF Filtry Butelkowe & nbsp;</td><td>Avantor</td><td>514-1045</td><td>Systemy filtracji próżniowej na pokrywkach od butelek (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 i mikro; m)</td></tr><tr><td>1,5 mL rurki sterylnych mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>30123611</td><td>Sejf&nbsp; Lampy</td></tr><tr><td>100 x roztwór streptomycyny penicyliny</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Roztwór penicylina i streptomycyna, 100x</td></tr><tr><td>5 X buforu lizyjowego z testu lucyferazy;</td><td>Promega</td><td>E2650</td><td>część systemu testów lucyferazy jasnych i jasnych (Promega Bright-Glo Luciferase Assay Assay)</td></tr><tr><td>50 mL stożkowe rurki</td><td>Corning &nbsp;</td><td>352070</td><td>50 mL rurka do wirówki PP o wysokiej klarowności, stożkowaty dno, sterylna</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkanek z 6 dołkami</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>Wielonaczynia poddane hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkanek z 96 dołkami</td><td>Thermo Scientific</td><td>168055</td><td>Nunc&trade; MicroWell&trade; 96-studnia, mikropłytka z płaskim dnem obrobiona delta z nanoklonem</td></tr><tr><td>Arbidol chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0860</td><td></td></tr><tr><td>Rozgałęziona polietylimina, 25 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop laserowy &nbsp; (FV 3000)</td><td>Olympus Co.</td><td>SKU: FV3000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Zmodyfikowane medium Dulbecco) z: wysoką glukozą, L-glutaminą, fenolową czerwienią, pirotrowianem sodu)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>Dezaktywowany termicznie (56 stopni; C, 30 min)</td></tr><tr><td>Komórki pochodzące z HEK293T (Linia komórkowa Lenti-X 293T)</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td>Wysoce transfektywalny subklon linii komórkowej HEK293 i wspierający wysoki poziom ekspresji białek wirusowych</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Komórki o wysokiej podatności na infekcję (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Linia komórkowa)</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-55293</td><td>HEK293T linia komórkowa zmodyfikowana do stabilnej ekspresji ACE2 i TMPRSS2</td></tr><tr><td>Kwas solny &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Olympus Co.&nbsp;</td><td>SKU: 2404040005</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże lucyferazowe</td><td>Promega</td><td>E2650</td><td>część systemu testów jasno-glo lucyferazy</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt z detekcją luminescencji</td><td>Agilent BioTek</td><td>BTH1MG</td><td></td></tr><tr><td>MTT [3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolowy bromek]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzezroczyste białe płyty z 96 dołkami</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>96-dołkowa mikropłyta z płaskim polistyrenem TC z 96-dołkami</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pcDNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>pcDNA3-EGFP był darem od Douga Golenbocka (plazmid addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)</td></tr><tr><td>plazmid pCMV-MLVgagpol</td><td>-</td><td>-</td><td>Uprzejmie przekazane przez dr. Gary'ego Whittakera&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym bez Ca2+ i Mg2+ (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanow, 1X bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Promega PureYield Plasmid Maxiprep System</td><td>Promega</td><td>A2393</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pTG-Luc</td><td>-</td><td>-</td><td>Uprzejmie przekazane przez dr. Gary'ego Whittakera&nbsp;</td></tr><tr><td>plazmid kolców pUNO1-SARS-CoV-2 (Wuhan)</td><td>Invivogen</td><td>P1-spike</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pVSV-G</td><td>Addgene</td><td>138479</td><td>pVSV-G był darem od Akitsu Hotty (plazmid addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko fuzyjne ACE2-Fc</td><td>Invivogen</td><td>FC-HaCE2</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowane medium surowicowe (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Opti-MEM Medium Zredukowane Serum</td></tr></tbody></table>

procedury identyfikacji inhibitorów wejścia sars-cov-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na mlv

Procedures for the Identification of SARS-CoV-2 Entry Inhibitors as Potential Antivirals using MLV-Based Pseudoviruses

Wirus SARS-CoV-2 to nowy, zoonotyczny patogen, który od momentu pojawienia się w 2019 roku spowodował ogromne obciążenie chorobami i śmiertelnością na całym świecie. Bezpieczne i dostępne platformy do oceny przeniknięcia wirusa i potencjalnych związków przeciwwirusowych pozostają niezbędne do dalszego odkrywania leków przeciwko nowym wariantom. Artykuł ten opisuje wysoce zoptymalizowany protokół generowania pseudotypowanych cząstek opartych na wirusie białaczki mysiej (MLV), które ekspresują białko kolca SARS-CoV-2 i przenoszą gen reportera lucyferazy, umożliwiając badanie wejścia wirusa w warunkach poziomu 2 bezpieczeństwa biologicznego. Opisane metody opisują wykorzystanie zoptymalizowanych linii komórkowych, wysoką efektywność transfekcji przy użyciu opłacalnych odczynników, produkcję wysoce skutecznych pseudowirusów oraz miareczkowanie zakaźności w celu określenia minimalnego wkładu wirusa do testów przesiewowych. Reprezentatywne wyniki wykazują silną aktywność lucyferazy w komórkach zakażonych w porównaniu z kontrolą niezakażoną, podczas gdy kontrolne pseudowirusy bez kolców i VSV-G potwierdzają specyficzność testu. Ponadto system wspiera badania związków przesiewowych poprzez ilościowe określenie efektów hamujących na wejście wirusa oraz ocenę cytotoksyczności za pomocą testu żywotności MTT. Ogólnie rzecz biorąc, ten powtarzalny i skalowalny protokół stanowi niezawodną platformę do średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań nowych inhibitorów wejścia wirusa, przyczyniając się do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe oraz postępu badań nad mechanizmami wejścia SARS-CoV-2.

Zgłoszono kilka metod transfekcji, które generują PV, w tym fosforan wapnia15, metody lipidowe16 oraz PEI, zarówno liniowe, jak i rozgałęzione. Artykuł pokazuje, że transfekcja komórek pochodzących od HEK293T z rozgałęzionymi PEI umożliwia wysoką efektywność transfekcji (Rysunek 1), zwykle porównywalną z metodami transfekcji z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych środków transfekcyjnych opartych na lipidach (dane nie pokazane). Przedstawiono r...

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

The SARS-CoV-2 virus is an emergent, zoonotic pathogen that has caused a huge burden of disease and mortality around the world since its emergence in ...

Nasze badania koncentrują się na identyfikacji inhibitorów blokujących wejście do SARS-CoV-2 za pomocą systemów pseudowirusowych. Badanie wejścia w SARS-CoV-2 często wymaga laboratoriów o wysokim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, zazwyczaj BSL-3. Protokół ten umożliwia bezpieczne badania antywirusowe stosowane w pseudowirusach w standardowych laboratoriach BSL-2.Na początek umieść sześciodołkową płytkę do hodowli tkanek w szafce biosafety i nasiaj 7,5 razy 10 do mocy pięciu komórek pochodzenia HEK 293 na odwierć w dwóch mililitrach kompletnego nośnika. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia potwierdź, że komórki osiągnęły około 50 do 60% konfluencji.Następnego dnia przygotuj roztwór polietyliminy lub PEI, dodając pięć mikrolitrów jednego miligramu na mililitr zapasu PEI do 50 mikrolitrów zredukowanego medium surowicy w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. W osobnej mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra przygotuj roztwór DNA, dodając 2,5 mikrograma plazmidu GFP ekspresyjnego do 50 mikrolitrów tego samego nośnika. Krótko wymieszaj każdą probówkę przez wirowanie, następnie skręć przez pięć sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej.Podczas 10-minutowego okresu inkubacji ostrożnie usuń podłoże z każdej dołki na płytce sześciodołkowej, nie zakłócając monowarstwy komórkowej, i dodaj do każdej jamki po mililitrze kompletnego pożywka transfekcyjnego bez antybiotyków. Po inkubacji należy dodać 50 mikrolitrów roztworu DNA do probówki zawierającej roztwór PEI. Szybko wymieszaj, pipetując sześć razy i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzy minuty.Następnie szybko dodaj kompleks DNA PEI kroplami do odpowiedniego dołku. Teraz uszczelnij krawędzie płyty parafilmem i wiruj w wirówce przy 1000 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy, używając wirnika obrotowego i wiadra płytowego. Po wirowaniu delikatnie usuń parafilm i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny.Następnie delikatnie zastąpić podłoże transfekcyjne w każdym dołku dwoma mililitrami podgrzewanego gotowego medium DMEM. Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin i oceń efektywność transfekcji, oceniając ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Seed HEK 293T wyprowadził komórki na dwie płyty z 6 dołkami, jak pokazano wcześniej.Jedną płytkę należy wyznaczyć do generowania pseudowirusów SARS-CoV-2 ze spike, a drugą do pseudowirusów VSVG. Przygotuj mieszankę transfekcyjną i kompleksy DNA PEI w dniu eksperymentu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji ostrożnie usuwaj medium z każdej z sześciu płyt dołków, nie zakłócając monowarstwy komórkowej.Powoli dodawaj do każdego dołku jeden mililitr podgrzewanego podgrzewczego całkowicie transfekcyjnego medium bez antybiotyków, pozwalając podłożu spływać wzdłuż ściany studni. Dodaj przygotowane kompleksy transfekcyjne do komórek, aby je transfekować, jak pokazano wcześniej. Po 48 godzinach inkubacji po transfekcji należy zebrać supernatanty z każdego odwiertu do 50-mililitrowej sterylnej stożkowej wirówki i wirować w 290 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zbierz bezkomórkowy supernatant i przefiltruj go przez sterylny filtr z butelki o średnicy 0,45 mikrometra z poliwinylinofluorkiem na wierzchu. Przygotuj alikwoty 1 mililitra filtrowanego supernatantu i przechowuj je w temperaturze 2,5 razy 10 stopni Celsjusza do mocy czterech komórek HSI, linii komórkowej o wysokiej podatności na SARS-CoV-2, w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM na dołek w 96-dołkowej płycie do hodowli tkankowej. Przygotuj i oznacz potrójne dołki dla każdego stanu do badania, w tym zakażenia pseudowirusem bez iskry oraz kontrolnych osób niezakażonych.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez noc. W dniu transdukcji rozmroz jedną aliquotę każdej partii pseudowirusa na lodzie i delikatnie wymieszaj przez inwersję, w tym jedną aliquot kontroli bez kolców. Należy dodać wymagane ilości preparatu pseudowirusa bezpośrednio do wyznaczonych dołków.Reguluj objętość każdego dołka do 150 mikrolitrów przy pełnym DMEM. Teraz uszczelnij płytę parafilmem i zachwyć w wirówce przy 2 500 G przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Usuń uszczelkę parafilmową i inkubuj płytkę przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po inkubacji przygotuj odczynniki do testu lucyferazowego zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmroź podłoże z lucyferazy i bufor lizy z testu 5X lucyferazy w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Rozcieńcz bufor lizy testu 5X z lucyferazą do 1X sterylnej wody.Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant. Następnie do każdego dołku dodaj 30 mikrolitrów buforu lizycznego 1X. Umieść talerz na potrząsaczce i potrząsaj przez 10 minut z prędkością 150 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej.Zweryfikować pełną lizę komórek pod mikroskopem odwróconym, aby potwierdzić, że komórki są w pełni zlizowane i nie da się ich rozróżnić. Następnie przelej lizaty na nieprzezroczystą białą płytkę o 96 dołkach. Do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów substratu z lucyferazą.Wymieszaj krótko, delikatnie poruszając płytką w okrężnym ruchu, umieść ją w luminometrze i mierz luminescencję. Nasiono 2,5 razy 10 do mocy czterech komórek HSI w 50 mikrolitrach kompletnego DMEM na odwiert w płycie 96-dołkowej, jak opisano wcześniej. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla.Następnego dnia przygotuj jedną do trzech seryjną rozcieńczeń związków do badania, takich jak arbidol w pełnym DMEM zawierającym 0,5% dimetylosulfenoksen. Używając pipety wielokanałowej, delikatnie zasysaj medium z każdej dołki. Dodaj 50 mikrolitrów odpowiadającego rozcieńczenia związku do każdej dołki, a do kolumny 12 dołków kontrolnych dodaj tylko cały DMEM.Inkubuj przez godzinę w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Bez usuwania związków należy bezpośrednio dodać 50 mikrolitrów pseudowirusa kolczastego SARS-CoV-2 do każdego dołka rozcieńczonego w kompletnym medium zawierającym te same stężenia związku. Uszczelnij płytę parfilmem.Wirówka w temperaturze 2 500 G przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Po usunięciu parfilmu inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Na koniec, ilościowo określ zakaźność za pomocą testu lucyferazowego, jak wykazano wcześniej.Transfekcja komórek pochodzących z HEK 293T z rozgałęzionymi PEI skutkowała wysoką efektywnością transfekcji, co skutkowało około 70% dodatnimi komórkami GFP. 48 godzin po transfekcji. Zakażenie podatnych komórek HSI malejącą ilością pseudowirusów SARS-CoV-2 lub pseudowirusów VSVG wykazało zależny od dawki wzrost luminescencji wraz ze wzrostem liczby pseudowirusów.Pseudowirusy bez spike'ów i niezainfekowane komórki wykazywały bardzo niski poziom luminescencji. Związek arbidol został przetestowany pod kątem zdolności hamowania wejścia do pseudowirusa i wykazał wyraźną odpowiedź dawkową aktywności lucyferazy wywołanej przez pseudowirusy spike, przy mniejszym zahamowaniu zaobserwowanym dla pseudowirusów VSVG. Test wykazał współczynnik Z (Z) wynoszący 0,54, co wskazuje na przydatność do celów przesiewowych.Leczenie arbidolem w stężeniach zaczynających się od 30 mikromolów nie wpłynęło istotnie na żywotność komórek w porównaniu z komórkami leczonymi samym nośnikiem dimetylosulfoksidu 0,5%. Protokół ten umożliwiał produkcję pseudowirusów o wysokim mianie w warunkach optymalnych. Pozwala to naukowcom mierzyć wejście pseudowirusa i identyfikować związki hamujące infekcję wywołaną impulsem SARS-CoV-2.Wysoka wydajność transfekcji jest kluczowa do generowania pseudowirusów o wysokiej mianie oraz uzyskania wiarygodnych sygnałów infekcji w dalszych testach. System ten wspiera wysokoprzepustowe badania antywirusowe oraz dewaluację inhibitorów wejścia wobec nowych wariantów SARS-CoV-2 i może być łatwo adaptowany do generowania pseudowirusów wykazujących białka otoczkowe pochodzące z innych wirusów.

procedures-for-identification-sars-cov-2-entry-inhibitors-as

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Poznaj protokół generowania pseudowirusów SARS-CoV-2 opartych na MLV do bezpiecznego badania wejścia wirusowego i przesiewania inhibitorów w warunkach BSL-2. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe odkrywanie leków przeciwwirusowych.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV (Wideo) | JoVE Journal

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Przeglądaj więcej filmów