Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Celem naszych badań jest więc identyfikacja interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi definiującymi linię a białkami remodelującymi chromatynę w różnych typach drobnokomórkowego raka płuca, regulując krajobrazy transkrypcyjne oraz to, jak te interakcje mogą wpływać na procesy chorobowe, w tym inicjowanie i postęp nowotworów. Naszym celem jest przeprowadzenie eksperymentów takich jak CUT&RUN, czyli technika sekwencjonowania nowej generacji, która może profilować lub identyfikować na skalę globalną lokalizacje genomowe, w których występują te różnicowo zmodyfikowane histony i DNA czynniki transkrypcyjne. Ostatecznie mamy nadzieję zidentyfikować nowe ścieżki regulowane epigenetycznie, które mogą być terapeutycznie możliwe do zastosowania w opracowywaniu nowych terapii dla pacjentów z tą bardzo agresywną formą raka płuc.

Na początek usuń hodowlane komórki neuroendokrynne raka płuc drobnokomórkowego z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zbadaj je pod mikroskopem, aby upewnić się o ich jakości. Następnie przeniesiono zawiesiny do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i wiruj ją w 1 200 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aspiruj medium z stożkowej rurki, używając próżni w okapie i płucz powstały pellet komórkowy 20 mililitrami PBS.

Ponownie wiruj probówkę w 1 200 g przez pięć minut i zasysaj PBS. Dodaj Accutazę w zależności od wielkości pelletu i inkubuj przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby strawić granulki komórkowe. Następnie zakończ trawienie, dodając pięć mililitrów PBS o 10% FBS i mieszając w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Po ponownym wirowaniu ogniw, jak wcześniej pokazano, ponownie zawiesij granulek w pięciu mililitrach PBS. Policz komórki startowe i potwierdź ich żywotność oraz integralność za pomocą automatycznego licznika komórek. Oblicz łączną liczbę potrzebnych komórek i dodaj 20% nadwyżki, aby uwzględnić błędy pipetowania.

Przenieś obliczoną liczbę ogniw do probówek o pojemności 1,5 mililitra i wiruj je w 600 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesijcie komórki w buforze płukania z gęstością pięciokrotnie 10, do mocy pięciu komórek na reakcję, co daje łącznie sześć reakcji. Stosuj 100 mikrolitrów buforu na reakcję i delikatnie, ale dokładnie pipetować, aby zapewnić równomierną zawiesinę.

Ponownie wiruj ogniwa, usuwaj supernatant i powtarzaj mycie. Należy zastosować 100 mikrolitrów wypranych komórek do każdej rurki zestawu ośmiu pasków zawierającego 10 mikrolitrów aktywowanych kulek Concanavalin A. Delikatnie pipetuj, żeby wymieszać zawartość.

Inkubuj zawiesinę z komórek kulek przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie komórek z kulkami, a następnie szybko obróć rurki w mini wirówce, aby zebrać zawiesinę bez pozwalania kulkom na osadzanie się. Umieść lampy na stojaku z magnesami rur 0,2 mililitra. Pozwól zawiesinie się rozdrożyć, a następnie podaj pipetę, aby usunąć nadmiar.

Następnie wyjmij rurki z magnesu. Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów buforu przeciwciał lodowatych do każdej reakcji i delikatnie pipetuj, aby ponownie zawiesować kulki. Odpowiednio oznacz osiem rurek z paskami.

Do każdej probówki reagującej dodaj po 0,5 mikrograma przeciwciał H3K4me3, H3K4me1 i immunoglobuliny oraz 0,6 mikrograma poliklonalnych przeciwciał E2F7 z różnych źródeł do każdej probówki. Delikatnie pipetuj, aby dokładnie wymieszać zawartość każdej probówki i inkubuj ją przez noc na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza z podniesionymi kapslami rurek. Usuń osiem rurek pasków z nutatora i wykonaj szybkie obrócenie, aby zebrać ciecz na dnie każdej rurki.

Teraz umieść rurki na stojaku magnetycznym, aż zawiesina się rozproszy. Następnie ostrożnie pipetuj, aby usunąć i wyrzucić supernatant. Trzymając rurki na stojaku magnetycznym, przemyj każdą probówkę dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu przepuszczalnego z zimnych komórek i użyj pipety wielokanałowej do usuwania supernatantu po każdym płukaniu.

Następnie zdejmij rurki ze stojaka magnetycznego. Natychmiast dodaj 50 mikrolitrów przepuszczalnego buforu z zimnymi komórkami do każdej reakcji i delikatnie pipetuj, aby ponownie zawiesić komórki i kulki. Następnie do każdej reakcji dodaj 2,5 mikrolitra białka AG-mikrokokowej nukleazy i dobrze wymieszaj przez delikatne pipetowanie.

Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej wykonaj szybkie obrócenie rurek. Umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym, aż zawiesina się rozproszy, a następnie usuń supernatant. Po dwukrotnym umyciu kulek buforem permeabilizacyjnym zimnych komórek, delikatnie zawiesić je w 50 mikrolitrach przepuszczalnego buforu komórkowego.

Podczas przechowywania probarek na lodzie dodaj jeden mikrolitr 100 milimolowych chlorków wapnia do każdej reakcji w pasku ośmiu probówek z poprzedniego etapu. Delikatnie pipetuj, aby kulki całkowicie zawiesować i ułatwić trawienie. Inkubuj rurki na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, utrzymując pokrywki w uniesionych przez cały okres inkubacji.

Teraz w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra przygotuj mieszankę buforu stop, łącząc 33 mikrolitry bufora stopowego z jednym mikrolitrem impulsu escherichia coli w DNA o stężeniu 0,5 nanograma na reakcję. Delikatnie przemieszaj roztwór, aby wymieszać roztwór. Po dwugodzinnej inkubacji dodaj 33 mikrolitry przygotowanej mieszaniny buforu stopowego do każdej probówki i dokładnie wymieszaj.

Inkubuj probówki reakcyjne w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po szybkim obrócie umieść rurki na stojaku magnesów, aż roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie przelej około 85 mikrolitrów supernatantu zawierającego DNA uwalniające CUT&RUN do świeżych rurek o pojemności 1,5 mililitra.

Oczyść odzyskane DNA, ocenić jego ilość i wykonać dystrybucję wielkości fragmentów w celu kontroli jakości. Następnie przejdź do przygotowania biblioteki CUT&RUN, ilościfikacji, pulowania bibliotek indeksowanych oraz sekwencjonowania następnej generacji z parą i zakończenia. Linie komórkowe o wysokiej liczbie komórek homolognych achaet-scute, DMS79 i H146 oraz linie o wysokim poziomie Neurogenic Differentiation Factor 1, H82 rosły jako nieprzylegające agregaty lub zwarte sferoidy w zawiesinach, podczas gdy H446 wykazywał morfologię mieszaną, z około 80% komórkami inherentnymi i 20% zawiesiną.

Analiza fragmentów DNA metodą CUT&RUN wykazała, że znak histonowy wzmacniający H3K4me1 dał najwyższe ilości DNA we wszystkich liniach komórkowych, następnie H3K4me3, przy czym E2F7 i IgG dały najniższe wartości. Dla wyodrębnionego CUT&RUN DNA, rozkład wielkości fragmentów dla H3K4me1 i H3K4me3 wykazał wyraźne piki dla mononukleosomu i dinukleosomu wraz z DNA genomowym. Dla porównania, nie wykryto wyraźnych pików dla E2F7 ani kontroli IgG.

Pomimo niskiego wejścia DNA, biblioteki sekwencjonowania nowej generacji zostały pomyślnie zbudowane dla wszystkich celów CUT&RUN, w tym E2F7 i IgG. Analiza map cieplnych w komórkach mutantów typu dzikiego DMS79 i heterozygotycznych H146 wykazała, że sygnały H3K4me3 i E2F7 były wzbogacone w pobliżu miejsc rozpoczęcia transkrypcji, podczas gdy sygnały H3K4me1 były szerzej rozproszone. Wizualizacja przeglądarki genomu w losowo wybranym regionie chromatyny wykazała wyraźne szczyty dla H3K4me3, H3K4me1 i E2F7, podczas gdy IgG nie wykazało wzbogacenia.

Tradycyjnie naukowcy i badacze stosowali immunoprecipitację chromatyny, a następnie sekwencjonowanie lub ChIP-seq, aby odpowiadać na pytania podobne do tych, które my zadajemy. Jednak ChIP-seq wymaga dość dużej ilości materiałów wejściowych, co nie zawsze jest wykonalne, w zależności od używanego modelu. CUT&RUN natomiast wymaga znacznie mniej materiału wejściowego, nawet 50 000 komórek, i wymaga mniej odczytów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, co oznacza, że jest tańszy i generuje znacznie mniej tła przy generowaniu danych.

CUT&RUN to technika, którą można zastosować nie tylko do komórek w hodowli 2D, ale także do innych modeli przedklinicznych, takich jak organoidy pochodzące od pacjentów i ksenotransplantty. Może być również używany do profilowania krajobrazu chromatyny w tkankach, zarówno w tkankach zdrowych, jak i chorych. Jest to niezwykle przydatna technologia lub technika dla badaczy raka, ale może być też bardzo przydatna dla badaczy spoza badań nad rakiem, którzy zajmują się badaniem różnych chorób u ludzi.

Protokół ten pozwala na mapowanie modyfikacji histonów oraz trwałych profili różnorodnych białek in situ w genomie komórkowym. Dostarczanie histonowych PTM oraz wiązania TF między podtypami SCLC może ujawnić geny i elementy regulacyjne specyficzne dla podtypu, takie jak wzmacniacze i superwzmacniacze.