Name: Walidacja systemu ciśnienia hiperbarycznego za pomocą znieczulenia ksenonowego dla Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj protokół znieczulenia ksenonowego Drosophila melanogaster w warunkach hiperbarycznych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów znieczulenia ogólnego i narkozy u modelowych organizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało finansowo wsparte przez TBD (Tiny Blue Dot) Foundation. Dziękujemy Jennifer Sun i Ting Liu z Google DeepMind za pomoc i wskazówki dotyczące śledzenia.

1. Preparat Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>Zbierz 20 samic i 20 samców much w wieku 1-3 dni na każdy eksperyment z użyciemCO2.</li>
	<li>Wybrane muchy odpoczywać w fiolce z jedzeniem przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem w temperaturze ~22 °C.</li>
</ol>
2. Podanie znieczulenia
<ol>
	<li>Przenieś gazy z ich zbiorników do nieszczelnych worków gazowych do zastosowań eksperymentalnych. Do bezpośredniego transferu gazu z pojemnika do worków użyj rurek silikonowych.</li>
	<li>Przymocuj silikonową rurkę o średnicy 25 mm (3,4 mm) do strzykawki polipropylenowej. Następnie podłącz strzykawkę polipropylenową do worków gazowych i do trójdrogowego kranu. Dla jasności, strzykawka polipropylenowa będzie w dalszej części tekstu określana jako strzykawka #1.</li>
</ol>
3. Montaż układu hiperbarycznego (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Ustaw stół LED w orientacji poziomej na stole (długa krawędź poziomo do powierzchni stołu).</li>
	<li>Umieść pompę wtryskową obok jednej z krótkich stron stołu LED light, dbając o to, aby orientacja pompy pozwoliła eksperymentalnej strzykawce wysunąć się ponad podświetlenie.</li>
	<li>Umieść kamerę nad urządzeniem, aby objąć obszar, w którym znajduje się eksperymentalna strzykawka.</li>
	<li>Wytnij rurkę krzemową o długości 75 mm (średnica 3,4 mm). Podłącz trójdrożny odwór do manometru za pomocą silikonowej rurki z centralnej dyszy.</li>
	<li>Użyj zacisków sprężynowych na dyszę z boku manometru oraz trójprzewodnikowego odczepu, aby upewnić się, że rurka jest szczelna.</li>
	<li>Za pomocą przycisku oznaczonego podwójną strzałką w jednostce sterującej pompy wtryskowej ustaw prędkość na 80 mm/m, a czas trwania na 38 s, aby automatycznie sprężać lub dekompresować tłok.</li>
</ol>
4. Procedura znieczulenia ksenonowego
<ol>
	<li>Ogranicz oświetlenie otoczenia w pomieszczeniu eksperymentalnym, włącz stół LED i ustaw jasność na poziom 3. To pomaga zwiększyć kontrast w filmie.</li>
	<li>Usuń tłok strzykawki poliwęglanowej. Włóż niewielką ilość waty do sutku strzykawki, aby powstrzymać muchy przed ucieczką. Dla jasności, strzykawka poliwęglanowa będzie w dalszej części tekstu określana jako strzykawka #2.</li>
	<li>Aby przenieść 40 much z fiolki do strzykawki #2, najpierw wyjmij pokrywkę fiolki i umieść pojemnik strzykawki pionowo na fiolce. Kołnierz lufy powinien połączyć się z górną częścią fiolki, aby umożliwić muchom wejście do lufy strzykawki. Obróć konstrukcję o 180° i stuknij. To umieszcza muchy na dnie beczki strzykawki. Włóż tłok z powrotem. Włóż strzykawkę z muchami do pompy wtryskowej.</li>
	<li>Ukierunkuj ślady lufy strzykawki po bokach, aby lepiej zobaczyć muchy z perspektywy kamery.</li>
	<li>Przymocuj strzykawkę od lufy i głowicy tłoka do pompy wtryskowej za pomocą regulowanych śrub.</li>
	<li>Usuń watę z końcówki strzykawki #2 i podłącz ją do trójstopniowego kranu.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wideo. Włącz manometr. Przekręć zawor, aby połączyć manometr ze strzykawką #2 i potwierdź ciśnienie 0 kPa w strzykawce za pomocą manometru.</li>
	<li>Przekręć trójstronny odkrążek w pozycję boczną, aby umożliwić wymianę powietrza ze strzykawką przed eksperymentem.</li>
	<li>Przesuń tłok z poziomu 20 do 2 ml za pomocą ręcznej opcji sterowania pompą wtryskową, która została zaprojektowana tak, by ułatwić najszybszą operację.</li>
	<li>Wciągnij 18 mL gazu znieczulącego z worka gazowego do strzykawki #1. Połącz strzykawkę #1 z trójdrożnym odłączeniem z bocznego portu blokady luer. Aby ocenić właściwą objętość, 18 mL gazu znieczulałego w łącznej ilości 20 mL daje 90% procentu gazu. Można to zmieniać zgodnie z pożądanym końcowym procentem gazu.</li>
	<li>Przesuń tłok z powrotem do linii 20 mL za pomocą ręcznej opcji pompy wtryskowej.</li>
	<li>Przekręć zawor, aby połączyć manometr ze strzykawką #2. Zazwyczaj manometr pokazuje ciśnienie ~-3 kPa po napełnieniu środka znieczulającego.</li>
	<li>Automatycznie przesuwaj tłok, ustawiając prędkość i czas na 80 mm/s i 38 s. Pompa ma osiągnąć 5 mL bara lufy w ciągu 38 sekund. Gdy tłok się zatrzyma, maksymalne ciśnienie musi wynosić ~200 kPa.</li>
	<li>Zostaw tłok na pozycji 5 mL przez 20 sekund. Zwróć uwagę na szczytowe ciśnienie.</li>
	<li>Stuknij strzykawką, by usunąć muchy przyczepione do tłoka, sprawiając, że osiadają nieruchomo na dnie.</li>
	<li>Rozpocznij automatyczną dekompresję po 20 sekundach. Zakończ eksperyment, gdy tłok wróci do baru 20 mL. Zwróć uwagę na ostateczne ciśnienie do kontroli nieszczelności.</li>
</ol>
5. Analiza danych
UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano emergencję znieczulającą jako punkt końcowy. Ruchy lotu były kwantyfikowane od momentu rozpoczęcia dekompresji tłoka. Opracowano dwie różne metody analizy: analizę pikseli oraz śledzenie much. Każda metoda analizy miała swoje wady, które są przedstawiane w dyskusji.
<ol>
	<li>Analiza pikseli<ol>
		<li>Użyj ScreenFlow do edycji filmów. Przytnij każdy film do interesującego obszaru (ROI), czyli pierwszych 5 ml lufki strzykawki.</li>
		<li>Przytnij wideo do pierwszych 20 sekund po dekompresji strzykawki. Eksportuj edytowane filmy jako GIF-y. Zduplikuj GIF.</li>
		<li>Korzystając z Fidżi, usuń pierwszą klatkę z jednego duplikatu, a ostatnią z drugiego. Aby to osiągnąć, wybierz Edycję obrazu > wideo > Usuń klatki.</li>
		<li>Spraw, by każdy GIF był binarny na Fidżi, tak aby muchy na czarnym tle były białe. Aby to osiągnąć, wybierz Proces > Binarny > Zrób binarny.</li>
		<li>Otwórz oba GIF-y na Fidżi. Oblicz różnicę pikseli między GIF-ami. Aby to osiągnąć, wybierz Process > Image Calculator. Ta operacja tworzy GIF różnicy pikseli.</li>
		<li>Zachowaj GIF różnicy pikseli. Analizuj cząstki w różnych GIF-ach. Aby to zrobić, wybierz Analizuj > Analizuj cząstki na Fidżi. Dostosuj progi rozmiaru pikseli, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Po analizie cząstek Fiji generuje obraz CSV z różnicami pikseli na klatkę. Zachowaj CSV. Dane CSV mogą być używane do wyznaczania ruchu na klatkę. Użyj skumulowanego ruchu przez klatki, aby przypisać statystyczne różnice między eksperymentami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie lotów UWAGA: W metodzie śledzenia much wykorzystano technologię AI do wykrywania i śledzenia środka masy każdej muchy w filmach eksperymentalnych. Do tego celu połączono dwa modele: YOLO (You Only Look Once) do wykrywania oraz MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) do śledzenia. Modele były wykonywane w Google Colab przy użyciu karty Tesla T4.<ol>
		<li>Zainstaluj bibliotekę YOLO Ultralytics w Colabie, a następnie załaduj model yolo11n.pt. Użyj CVAT (Computer Vision Annotation Tool) do adnotacji much w klatkach wyodrębnionych z filmów, a następnie eksportuj zbiór danych w formacie YOLO do treningu. Szczegółowe procedury instalacji i szkolenia opisane są w repozytorium online.</li>
		<li>Zainstaluj repozytorium MASA w Google Colab i zastosuj filtr Kalmana do śledzenia obiektów w kolejnych klatkach. Integruj wytrenowany model detekcji YOLO z ramami śledzącymi MASA.</li>
		<li>Użyj FixTrack, aby ręcznie przejrzeć ścieżki generowane przez połączony potok MASA+YOLO. Identyfikacja i łączenie nieprawidłowo fragmentowanych torów lub korygowanie niezgodności tożsamości, aby uzyskać ciągłe trajektorie dla pojedynczych much. Szczegółowe procedury instalacji i szkolenia opisane są w repozytorium FixTrack.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBert%2C+P+%22Barometric+Pressure%3A+Researches+in+Experimental+Physiology%22">Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology</a>. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).</li>
<li>Grover, C. A., Grover, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albert+Behnke%3A+nitrogen+narcosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Albert Behnke: nitrogen narcosis.</a> J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).</li>
<li>Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+neurochemical+data+on+inert+gas+narcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Undersea+Hyperb+Med%22%5BJournal%5D)">A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis.</a> Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).</li>
<li>Clark, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+in+extreme+environments%3A+inert+gas+narcosis+and+underwater+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Extrem+Physiol+Med%22%5BJournal%5D)">Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities.</a> Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).</li>
<li>Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+observations+on+the+narcotic+effect+of+xenon+with+a+review+of+values+for+solubilities+of+gases+in+water+and+oils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils.</a> J Physiol. 105, 197-204 (1946).</li>
<li>Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+approaches+to+the+mode+of+action+of+general+anesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics.</a> Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).</li>
<li>Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+general+anesthesia%3A+from+molecules+to+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind.</a> Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).</li>
<li>Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon%3A+no+stranger+to+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Xenon: no stranger to anaesthesia.</a> Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).</li>
<li>Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon+anesthesia%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).</li>
<li>Krishnan, K. S., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+study+of+the+anesthetic+response%3A+mutants+of+Drosophila+melanogaster+altered+in+sensitivity+to+halothane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).</li>
<li>Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+electrophysiological+analysis+of+general+anesthesia+in+3+background+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster.</a> Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).</li>
<li>Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+anesthetic+response+to+chloroform+and+isoflurane+in+general+anesthesia+mutants+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster.</a> Anesthesia Res. 2, 12(2025).</li>
<li>Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetics+disrupt+complex+I-linked+respiration+and+reverse+the+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).</li>
<li>Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+effects+in+anaesthesia+and+narcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">High pressure effects in anaesthesia and narcosis.</a> Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).</li>
<li>Koblin, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+alveolar+concentrations+of+noble+gases%2C+nitrogen%2C+and+sulfur+hexafluoride+in+rats%3A+helium+and+neon+as+nonimmobilizers+%28nonanesthetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics).</a> Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).</li>
<li>Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+oxygen+at+high+pressure+and+radiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila.</a> J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).</li>
<li>Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+anesthesia+and+pressure+antagonism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice.</a> Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).</li>
<li>Gunning, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGunning%2C+C+%22FixtrackV2+at+SingleVid%22">FixtrackV2 at SingleVid</a>. , Github. (2025).</li>
<li>Allada, R., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+study+of+general+anesthesia%3A+the+quantitative+response+to+clinical+anesthetics+and+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes.</a> Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów.

To proste, niskokosztowe rozwiązanie sprawia, że badania behawioralne hiperbaryczne u Drosophila są szeroko dostępne, umożliwiając szybkie i powtarzalne eksperymenty bez stosowania specjalistycznych zbiorników ciśnieniowych. Jednak ma to pewne ograniczenia. Jednym z ważnych kompromisów jest niższe maksymalne ciśnienie w porównaniu do istniejących układów. Najwyższe ciśnienie, jakie możemy wywołać w tym układzie, to ~4 atm, podczas gdy naczynia ciśnieniowe stosowane dla Drosophili osiągają około dwukrotn...

Dwa skrajne aspekty efektów behawioralnych zaobserwowane u zwierząt w warunkach hiperbarycznych to drgawki spowodowane tlenem oraz narkozę azotu 1,2. Co ciekawe, zgłaszano zaburzenia poznawcze, takie jak halucynacje i zaburzenia pamięci, przy stężeniu azotu i wodoru przy wartościach ciśnienia przed poziomem nieprzytomności 3,4. Znieczulenie wywołane ksenonem, kryptonem i podtlenkiem azotu w warunkach hiperbarycznych zostało zgłaszane przed 5,6.
Znieczulenie ogólne jest zarówno fundamentem medycyny, jak i zjawiskiem o znacznym znaczeniu naukowym. Pomimo długotrwałego i powszechnego stosowania, nasza wiedza pozostaje ograniczona, jak dokładnie niektóre substancje chemiczne wywołują tymczasowy brak ruchu, pamięci, bólu i świadomości7. Xenon, będąc gazem szlachetnym, można by mianować najbardziej osobliwym członkiem wśród środków znieczulających. Uważana jest za bezpieczną opcję znieczulenia, oferującą szybkie indukcje i rekonwalescencję, minimalne zaburzenia fizjologiczne oraz jedynie łagodne skutki uboczne, takie jak nudności pooperacyjne 8,9.
Biorąc pod uwagę medyczne znaczenie znieczulenia oraz nietypowe właściwości chemiczne ksenonu, celem tego badania są zbadanie znieczulenia wywołanego ksenonem za pomocą prostego modelu zwierzęcego Drosophila melanogaster. Przeprowadzono różnorodne badania badawcze z użyciem muszek owocowych do badania znieczulenia ogólnego, z wieloma proponowanymi ustawieniami oraz stosowaniem różnych lotnych środków znieczulających 10,11,12,13. Jednak nie odnotowano znieczulenia ksenonowym u Drosophila. W warunkach normobarycznych ksenon nie wywołuje znieczulenia u Drosophila melanogaster, powszechnie znanych jako muszki owocowe. Aby rozwiązać to ograniczenie, badanie oferuje system hiperbariczny umożliwiający kontrolowaną manipulację ciśnieniem otoczenia w zakresie od 1 atm do około 4 atm. Przeprowadzono kilka badań z wykorzystaniem komór hiperbarycznych do odpowiedzi na podobne pytania14,15. Jednak większość komercyjnych komór hiperbarycznych korzysta z wytrzymałych, nieszczelnych materiałów, ale mają dużą objętość (~3 L) i są systematycznie skomplikowane w obsłudze oraz kosztowne. Zamiast tego metoda opisana w tym artykule jest prosta i niedroga, umożliwiając badanie wpływu różnych gazów i ich kombinacji. Zapewnia to rozwiązanie odpowiednie dla modeli zwierząt, takich jak D. melanogaster i C. elegans.

<table><tbody><tr><td>Szczelne poduszki gazowe (0,5 L)</td><td>Techinstro</td><td>7440440</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Apple</td><td>iPhone 15</td><td></td></tr><tr><td>Podwójne zaciski sprężynowe</td><td>Mapa źródeł</td><td>a24120200ux2109</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka pokarmowa Drosophila</td><td>Zaawansowane hodowlowanie</td><td>DM900</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Darwin Biological</td><td>LZ-210</td><td></td></tr><tr><td>Rura wtryskowa</td><td>Aitoserlea</td><td>B09M8G5BQ8</td><td></td></tr><tr><td>Stolik LED</td><td>Lairi</td><td>M1-3878368</td><td></td></tr><tr><td>Manometr</td><td>Dwyeromega</td><td>477AV-8</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy trójstopniowy zaworek zaciskowy do zaciskania i zawor;</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>Z182184</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka poliwęglanowa (20 mL)</td><td>DMC Medical</td><td>FD-1031NS</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka polipropylenowa (20 mL)</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaz ksenonowy</td><td>Gazy przemysłowe Chengdu Taiyu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

walidacja systemu ciśnienia hiperbarycznego za pomocą znieczulenia ksenonowego dla drosophila melanogaster

Validation of Hyperbaric Pressure System with Xenon Anesthesia for Drosophila melanogaster

W warunkach hiperbarycznych podwyższone stężenia gazów otoczących mogą wywoływać szereg reakcji behawioralnych u różnych zwierząt. Znaczna część tych zachowań odzwierciedla zmiany w stanach poznawczych, które są jeszcze słabo rozumiane. Jednym z godnych uwagi przykładów jest znieczulenie ogólne. Wpływ behawioralny kilku gazów w warunkach hiperbarycznych w znieczuleniu ogólnym, czyli narkozie, jest długoletnim badaniem naukowym, mimo niezwykle częstego stosowania tych leków w medycynie. Ksenon, klasyfikowany jako gaz szlachetny i środek znieczulający, uważany jest za jedną z najbezpieczniejszych opcji znieczulenia ogólnego u ludzi. Jednak nie znieczula much w warunkach normobarycznych. Tutaj ustanowiliśmy prosty eksperymentalny system, który zwiększa ciśnienie otoczenia do ~3 atm i umożliwia badanie znieczulenia ksenonowego u jednego z najpopularniejszych organizmów modelowych, Drosophila melanogaster. Taki eksperymentalny układ dodatkowo ułatwia badania innych gazów i ich wpływu w warunkach hiperbarycznych.

Metoda opisana w tym artykule pozwala monitorować zarówno czas, jak i zakres aktywności lokomotorycznej u much w warunkach hiperbarycznych. Ta konfiguracja pozwala gazom takim jak ksenon i podtlenek azotu, które w normalnych warunkach nie mają właściwości znieczulających, wywołać znieczulenie u Drosophila melanogaster. Aby to udowodnić, eksperymentowaliśmy z różnymi stężeniami ksenonu i powietrza. Zaczęliśmy proces od 90% ksenonu i 10% powietrza. Następnie wykazaliśmy wrażliwość metodologii, porównując różnice m...

Gazy, które wydają się nieszkodliwe przy ciśnieniu atmosferycznym, mogą wywoływać zachowania takie jak narkoza w warunkach hiperbarycznych. Konwencjonalne komory ciśnieniowe hiperbaryczne są kosztowne i wymagają dużo pracy. Niniejsze badanie przedstawia prostą, niskokosztową metodę badania wpływu ksenona na Drosophila melanogaster przy umiarkowanych ciśnieniach poniżej 4 atm.

Walidacja systemu ciśnienia hiperbarycznego za pomocą znieczulenia ksenonowego dla Drosophila melanogaster

Under hyperbaric conditions, the elevated concentrations of the ambient gases may elicit a range of behavioral responses in various animals. A substantial ...

Moje badania mają na celu zrozumienie, jak działa znieczulenie ogólne, a istnieje kilka gazów, które są znieczulającymi w warunkach hiperbarycznych. Ten protokół pozwala nam znieczulić muszki owocowe ksenonem w celu badania podstawowego mechanizmu znieczulenia ogólnego. Na początek zbierz 20 znieczulonych samic i samców much Drosophila melanogaster w wieku od jednego do trzech dni na potrzeby każdego eksperymentu i pozwól im odpocząć w fiolce z jedzeniem przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem w temperaturze około 22 stopni Celsjusza.Przenieś gazy z butli z ich pojemników do nieszczelnych worków gazowych do zastosowań eksperymentalnych. Używając rurek silikonowych, bezpośrednio podłącz wylot butli gazowej do wlotu worka gazowego, aby umożliwić przepływ gazu. Podłącz silikonową rurkę o długości 25 milimetrów do strzykawki z polipropylenu.Podłącz strzykawkę polipropylenową do worków gazowych i do trójdrożnego kranu. Aby złożyć układ hiperbaryczny, najpierw ustaw stół LED w orientacji poziomej na stole. Umieść pompę wtryskową obok jednej krótkiej strony stołu LED light, ustawioną tak, aby eksperymentalna strzykawka, po umieszczeniu, wysuwała się ponad podświetlenie.Teraz przetnij silikonową rurkę o długości 75 milimetrów. Podłącz trójdrożny odwór do manometru za pomocą silikonowej rurki z centralnej dyszy. Użyj zacisków sprężynowych na dyszi po stronie manometru oraz na trójkierunkowym kranie na górze, aby mieć pewność, że rurka jest dobrze zabezpieczona.Następnie użyj przycisku oznaczonego podwójną strzałką na jednostce sterującej pompą wtryskową, aby ustawić prędkość na 80 milimetrów na minutę oraz czas trwania na 38 sekund do automatycznej kompresji lub dekompresji tłoka. Następnie ogranicz oświetlenie otoczenia w pomieszczeniu eksperymentalnym i włącz stół LED do oświetlenia. Ustaw poziom jasności na trzy, aby zwiększyć kontrast wideo.Wyjmij tłok ze strzykawki poliwęglanowej. Włóż niewielką ilość waty do końcówki strzykawki, aby zapobiec ucieczce muchy. Aby przenieść 40 much do strzykawki poliwęglanowej, zdejmij pokrywkę fiolki, umieść lufkę strzykawki na wierzchu fiolki, odwróć zespół i stuknij, aby przenieść muchy do beczki strzykawki.Ustaw strzykawkę tak, aby oznaczenia lufy były skierowane w stronę kamery, aby optymalnie zobaczyć muchy. Zabezpiecz strzykawkę, mocując zarówno lufę, jak i głowicę tłoka do pompy wtryskowej za pomocą regulowanych śrub. Teraz wyjmij watę z końcówki strzykawki i podłącz ją do trójprzewodowego kranu.Rozpocznij nagrywanie wideo. Włącz manometr, a potem zatrzymaj, aby połączyć manometr ze strzykawką i potwierdzić ciśnienie kilopaskalne. Obróć trójstronny odpraw do pozycji bocznej, aby umożliwić wymianę powietrza ze strzykawką.Korzystając z opcji ręcznego sterowania pompą wtryskową, przesuń tłok z 20-mililitrowego na 20-mililitrowy poziom. Aspiruj 18 mililitrów gazu znieczulałego z worka gazowego do strzykawki polipropylenowej. Podłącz strzykawkę do bocznego portu zamka przynęty w trójdrożnym tapie.Następnie użyj ręcznej opcji pompy wtryskowej, aby przesunąć tłok z powrotem do poziomu 20 mililitrów. Przekręć ogranicznik, aby połączyć manometr ze strzykawką i obserwować odczyt ciśnienia. Rozpocznij automatyczny ruch tłoka z ustawionymi ustawieniami prędkości i czasu trwania.Pozwól tłokowi osiągnąć granicę pięciu mililitrów w ciągu 38 sekund, monitorując ciśnienie. Zostaw tłok w pozycji pięciu mililitrów przez 20 sekund i zanotuj ciśnienie szczytowe. Delikatnie stuknij strzykawką, aby usunąć muchy przyczepione do tłoka i pozwól im osiąść na dnie.Rozpocznij automatyczną dekompresję po 20 sekundach. Zakończ eksperyment, gdy tłok wróci do poziomu 20 milimetrów, i zapisz końcowe ciśnienie do kontroli nieszczelności. Uruchom ScreenFlow, aby edytować filmy.Przyciń każde nagrane wideo do obszaru zainteresowania odpowiadającego pierwszym pięciu mililitrom lufy strzykawki. Przytnij każdy film do pierwszych 20 sekund po dekompresji strzykawką. Eksportuj filmy jako GIF-y i duplikuj je.Teraz uruchom oprogramowanie Fiji, aby usunąć pierwszą i ostatnią klatkę z różnych duplikatów. Kolejno kliknij na obraz, edycję wideo i usuń klatki. Kliknij na process, binary i ustaw binary dla każdego pliku GIF na binary, aby much pojawiły się białe na czarnym tle.Otwórz oba pliki binarne na Fidżi. Oblicz różnicę pikseli między nimi, wybierając proces i kalkulator obrazu, aby wygenerować plik różnicy pikseli. Po zapisaniu pliku różnic pikseli wybierz analizę i analizę cząstek, regulując progi rozmiaru pikseli w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.Zapisz wygenerowany plik CSV zawierający różnice pikseli na klatkę. Wykorzystaj dane do obliczenia skumulowanego ruchu między ramkami do porównania statystycznego. Eksperymentalne filmy były przetwarzane przez konwersję na obrazy binarne i różnicowe, aby przygotować je do analizy pikseli.Bez progowania różnice pikseli kumulowały się w klatkach i podnosiły sygnał bazowy do około 20 000. Zastosowanie progu rozmiaru pikseli od 100 do 1000 zmniejszało sygnał tła i podkreślało różnice spowodowane ruchem much. Różnice pikseli na klatkę pozostawały bliskie zeru przed klatką 200.Model YOLOv11 N śledził muchy z wysoką dokładnością na klatkę, ale częste zasłony prowadziły do nadmiernych przypisań identyfikacji much. Ze względu na niespójności w śledzeniu, ruch much był kwantyfikowany przez sumowanie wszystkich ruchów ID w jednym eksperymencie i normalizację o maksymalnie 200 ID. Muchy narażone na 85% ksenonu szybciej się regenerowały i poruszały się bardziej niż te narażone na 90% lub 95% ksenon.Nasz protokół oferuje prostotę i szybkość, a także wykorzystuje tańsze materiały niż tradycyjne komory ciśnieniowe. Maksymalne ciśnienie jest ograniczone do około czterech atmosfer, a niedoskonałe uszczelnienie powoduje stopniowe utraty ciśnienia. Takie rozwiązanie umożliwia powtarzalne pomiary wpływu gazu znieczulonego na zachowanie małych organizmów modelowych.

validation-hyperbaric-pressure-system-with-xenon-anesthesia-for

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Ten film pokazuje metodę testowania niedotlenienia u larw Drosophila poprzez ocenę ich zdolności do kopania i drążenia tuneli. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą odróżnić larwy doświadczające niedoboru tlenu od tych z deficytami rozwojowymi. Przykładowy protokół przedstawia konfigurację tego testu.

Drosophila Test kopania i tunelowania: metoda oceny niedotlenienia tkanek u larw much

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

Hypoxia-Induced Climbing Behavior of Drosophila melanogaster

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) jest szeroko stosowana do badań biologicznych i toksykologicznych. Aby zwiększyć użyteczność much, opracowaliśmy instrument, seryjną matrycę anestezjologiczną, która jednocześnie wystawia wiele próbek much na działanie lotnych środków znieczulających ogólnie (VGA), umożliwiając zbadanie skutków ubocznych (toksycznych i ochronnych) VGA.

Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj protokół znieczulenia ksenonowego Drosophila melanogaster w warunkach hiperbarycznych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów znieczulenia ogólnego i narkozy u modelowych organizmów.

Walidacja systemu ciśnienia hiperbarycznego za pomocą znieczulenia ksenonowego dla Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów