Name: Zlokalizowana ekspresja RNAi i genów ektopowych w pijawce lekarskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Poznaj metodę biolistycznego dostarczania RNAi do embrionów pijawki lekarskiej przy użyciu pneumatycznej strzelby kapilarnej. Technika umożliwia precyzyjne badanie ekspresji genu Netrin w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Michaelowi Bakerowi za pomoc w tworzeniu konstruktów do insercji genów (knock-in) oraz za udostępnienie filmów time-lapse z procesu wzrostu projekcji sensorycznych. Dziękujemy również Virginii Vandelinder za wsparcie techniczne przy eksperymentach z wykorzystaniem pistoletu pneumatycznego.

Cząstki mogą być powlekane różnymi odczynnikami, takimi jak cząsteczki dsRNA, plazmidy DNA lub barwniki. Rodzaj i średnica cząstek są dobierane w zależności od odczynnika oraz głębokości położenia docelowych komórek w tkance: większe cząstki wnikają głębiej, lecz mogą spowodować uszkodzenia tkanki.
1. Przygotowanie cząstek powlekanych dsRNA
<ol>
<li>Umieścić 100% izopropanol na lodzie.</li>
<li>Resuspendować 5 mg cząsteczek złota (S1600ri, Seashell Technology, LLC; średnica średnia 1,6 µm) w 100 ml buforu wiążącego. Po przygotowaniu roztworu przejść do następnego kroku.</li>
<li>Rozcieńczyć roztwór cząsteczek, dodając 100 µl buforu wiążącego, krótko wymieszać na wortexie i sonikować przez 1-2 min, aby zapobiec zlepianiu się cząsteczek.</li>
<li>Dodać 5-10 µg dsRNA/siRNA (dsRNA/siRNA powinny być rozpuszczone w wodzie do stężenia ~1 µg/µl).</li>
<li>Wymieszać na wortexie i pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 min. Takie stężenie i przedział czasowy pozwalają na uzyskanie cząsteczek złota nasyconych siRNA.</li>
<li>Odwirować kompleksy siRNA/cząsteczki złota w wirówce stołowej przy prędkości ~2 500 rpm przez ~15 s.</li>
<li>Usunąć nadsącz i ostrożnie dodać 750 ml zimnego izopropanolu, unikając naruszenia osadu. Krótko odwirować i usunąć nadsącz.</li>
<li>Resuspendować cząsteczki złota w 100 µl zimnego 100% izopropanolu, a następnie krótko sonikować w myjce ultradźwiękowej (2-3 impulsy), aby rozbić aglomeraty cząsteczek. Na koniec wylać zawiesinę cząsteczek na szkiełko przedmiotowe i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie układu eksperymentalnego dla konkretnego testu
<ol>
<li>Każda pistolet posiada dyszę o innej średnicy otworu, w zakresie od minimum ~50µm do ~3mm. Dyszę do konkretnego pistoletu dobiera się zatem w zależności od obszaru tkanki, który ma zostać objęty działaniem.</li>
<li>Ciśnienie He dostosowuje się do głębokości zalegania komórek docelowych w tkance, zazwyczaj do ~100µm (wyższe ciśnienia umożliwiają głębsze wprowadzenie cząsteczek). Na głębokość penetracji wpływa również odległość między embrionem a końcówką dyszy, ponieważ cząsteczki złota tracą pęd w powietrzu.</li>
</ol>
3. Załadowanie pistoletu cząstkami z naniesioną powłoką
Cząsteczki należy wprowadzić w formie suchego proszku do linii wtryskiwania cząsteczek z rurek Tygon, które są podłączone do rozdzielacza. Rurki te, które w przypadku nieużywania powinny być przechowywane w suchej atmosferze w temperaturze 4°C, mogą być ponownie wykorzystane w kolejnych eksperymentach z użyciem tych samych odczynników. Nasza konfiguracja eksperymentalna pozwala na podawanie do dwóch różnych odczynników na jeden test poprzez oddzielne porty w rozdzielaczu.
<ol>
<li>Zeskrob wysuszone cząstki z powłoką z szkiełek przedmiotowych, używając krawędzi szkiełka nakrywki lub żyletki, przed wprowadzeniem ich do przewodu z rurki Tygon. Ta rurka Tygon będzie przeznaczona wyłącznie dla tego odczynnika, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych.</li>
<li>Podczas wprowadzania cząstek zgnij rurkę w kształt litery U blisko złącza, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się cząstek wzdłuż całej rurki i zapewnić ich koncentrację w pobliżu złącza. Zbierz cząstki małą szpatułką lub kawałkiem złożonego papieru wagowego i wprowadź około połowę z nich do rurki dla każdej serii embrionów. Opukiwanie rurki podczas wprowadzania pozwoli na równomierne rozłożenie cząstek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zwierząt
Przed i po wprowadzeniu cząsteczek złota zarodki są przechowywane w sterylnej sztucznej wodzie stawowej w temperaturze pokojowej.
<ol>
<li>Umieść embriony stroną brzuszną do góry w rowku wyciętym w płaskim, 5mm grubym kawałku gumy silikonowej (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) i znieczul je w roztworze 8% etanolu w sterylnej sztucznej wodzie stawowej (młodsze embriony w stadiach E6-E8 mogą pozostać w sztucznej wodzie stawowej bez etanolu przez cały czas trwania eksperymentu).</li>
<li>Bezpośrednio przed wystrzeleniem cząstek obniż poziom kąpieli, usuwając część roztworu, aby odsłonić powierzchnię brzuszną embrionów. Na wierzchu umieść kawałek ręcznika papierowego z wyciętym w środku małym otworem, aby ustabilizować próbkę i zapobiec wysychaniu jej powierzchni.</li>
</ol>
5. Dostarczenie powlekanych cząsteczek do tkanki docelowej
Jedna porcja cząsteczek może być zazwyczaj wykorzystana do dziesięciu strzałów, przy czym pojedynczy strzał dostarcza zazwyczaj rzędu kilkuset cząsteczek.
<ol>
<li>Wygeneruj impuls, otwierając jeden z zaworów na 0,3 s, co spowoduje wstrzyknięcie bolusa cząsteczek z odpowiadającej linii rurek do pistoletu.</li>
<li>Między impulsami delikatnie opukuj rurki, aby odczepić cząsteczki od ich ścianek i w ten sposób ułatwić ich wstrzyknięcie do strumienia He w pistolecie.</li>
<li>Aby pokryć interesowany obszar tkanki, może być konieczne wykonanie wielu impulsów.</li>
<li>Po dostarczeniu cząsteczek umieść embriony z powrotem w sztucznej wodzie stawowej, najlepiej po jednym embrionie na dołek w płytce wielodołkowej.</li>
</ol>
6. Immunobarwienie i znakowanie neuronów
Przechowywać zarodki w temperaturze pokojowej i w ciemności od 1 do 3 dni po dostarczeniu cząsteczek, aż do uzyskania efektu RNAi (lub ekspresji ektopowej). Następnie w próbkach doświadczalnych i kontrolnych przeprowadza się jedną z poniższych procedur:
<ol>
<li>Hybrydyzacja in situ w celu oceny obecności lub braku mRNA Netryny. Znakowane digoksigeniną ryboproby netryny pijawki są hybrydyzowane z całymi zarodkami pijawki.</li>
<li>Immunocytochemia w celu oceny białka Netryny oraz innych białek charakterystycznych dla tkanki neuronalnej (takich jak przeciwciała przeciwko acetylowanej tubulinie). Procedurę tę wykonuje się również na całych zarodkach (whole-mount).</li>
<li>Mikroiniekcje barwników lipofilowych (DiI i DiO) do pojedynczych neuronów, w celu wypełnienia barwnikiem i oznakowania pełnych drzewek neuronów będących przedmiotem badania (w naszym przypadku mechanosensorycznych neuronów nacisku) w segmentach traktowanych i kontrolnych. Analizę tę przeprowadza się na żywych zarodkach (nienaruszonych lub wypreparowanych).</li>
</ol>

<ol><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li>
<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li>
<li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li>
<li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).</li>
<li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li>
</ol>

W niniejszym pokazie wykorzystano pneumatyczną działo kapilarne do wprowadzania cząstek złota do komórek w niewielkiej, zlokalizowanej objętości żywego embrionu pijawki w celu wykonania knock-in oraz knock-down genów. Region docelowy miał zazwyczaj średnicę ~150 µm, a cząstki znajdowały się w obrębie ~15 µm wokół średniej głębokości penetracji, którą można było regulować w zakresie od 0 do 50 µm. Gdy cząstki zostały pokryte cząsteczkami dsRNA czynnika prowadzenia aksonów netryny, spowodowało to wyraźny knock-down ekspres...

<table><tbody><tr><td>cząsteczki złota</td><td>Inne</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td>S1600ri</td><td></td></tr><tr><td>bufor wiążący</td><td>Odczynnik</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guma silikonowa</td><td>Odczynnik</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalne rnai i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

W niniejszym filmie prezentujemy zastosowanie pneumatycznej pistoletowej mikrosstrzykawki kapilarnej do precyzyjnego biolistycznego dostarczania odczynników do żywej tkanki. Procedurę tę wykorzystujemy do zaburzania wzorców ekspresji genów w wybranych segmentach embrionów pijawek, pozostawiając segmenty niepoddane działaniu odczynników jako wewnętrzne kontrole.
Pneumatyczna strzykawka kapilarna może być wykorzystywana do dotarcia do wewnętrznych warstw komórek we wczesnych stadiach rozwoju bez konieczności otwierania preparatu. Jako metoda lokalnego wprowadzania substancji do żywych tkanek, dostarczanie biolistyczne za pomocą tej strzykawki oferuje kilka zalet: jest szybkie, bezkontaktowe i niedestrukcyjne. Ponadto jedna strzykawka kapilarna może służyć do niezależnego dostarczania różnych substancji. Obszar dostarczenia może mieć wymiary boczne rzędu ~50-150 µm i rozciągać się na ~15 µm wokół średniej głębokości penetracji, która jest regulowana w zakresie od 0 do 50 µm. Ta metoda dostarczania ma tę zaletę, że pozwala na targetowanie ograniczonej liczby komórek w wybranym miejscu, co stanowi rozwiązanie pośrednie między wyciszaniem pojedynczych komórek za pomocą mikroiniekcji a wyciszaniem systemowym poprzez iniekcje pozakomórkowe lub za pomocą metod genetycznych.
W celu wyciszenia (knock-down) lub nadekspresji (knock-in) cząsteczki kierowania aksonami Netrin, która naturalnie występuje w niektórych neuronach centralnych i w brzusznej ścianie ciała, ale nie w domenie grzbietowej, wprowadzamy cząsteczki dsRNA lub plazmidowe DNA do ściany ciała i zwojów centralnych. Procedura ta obejmuje następujące etapy: (i) przygotowanie układu eksperymentalnego dla konkretnego testu (regulacja ciśnienia przyspieszającego), (ii) powlekanie cząsteczek cząsteczkami dsRNA lub DNA, (iii) załadowanie powlekanych cząsteczek do armatki, do dwóch odczynników w jednym teście, (iv) przygotowanie zwierząt do wprowadzenia cząsteczek, (v) wprowadzenie powlekanych cząsteczek do tkanki docelowej (ściany ciała lub zwojów) oraz (vi) przetwarzanie embrionów (immunobarwienie, immunohistochemia i znakowanie neuronów) w celu wizualizacji wyników, zazwyczaj od 2 do 3 dni po wprowadzeniu.
Kiedy cząstki zostały powleczone dsRNA netryny, spowodowały one wyraźnie widoczny knock-down ekspresji netryny, który występował wyłącznie w komórkach zawierających cząstki (zazwyczaj 1-2 cząstki na komórkę). Cząstki powleczone plazmidem kodującym EGFP indukowały fluorescencję w komórkach neuronalnych, gdy zatrzymały się w ich jądrach.

W tym filmie przedstawiamy procedurę dokładnego dostarczania reagentów do żywej tkanki metodą biolistyczną przy użyciu nowoczesnej miniaturowej wyrzutni genów. Przeprowadzamy wyciszenie ekspresji cząsteczki Netrin, odpowiedzialnej za prowadzenie aksonów, w embrionach pijawek poprzez dostarczenie cząsteczek dsRNA do brzusznej ściany ciała i zwojów pojedynczych segmentów.

Lokalne RNAi i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

W tym filmie prezentujemy zastosowanie pneumatycznej pistoletowej pipety kapilarnej do precyzyjnego dostarczania odczynników do żywej tkanki metodą biolistyki. Procedurę tę wykorzystujemy do ...

Pijawka medyczna stanowi użyteczny system modelowy w badaniach neurobiologicznych ze względu na swoją prostotę, dostępność oraz możliwość statycznej identyfikacji neuronów przy użyciu wielu różnych narzędzi eksperymentalnych, od wczesnego embrionogenezy aż po wiek starczy. Szczególnie interesującym zastosowaniem embrionu pijawki są badania obrazowania time-lapse w celu obserwacji wypustek neuronalnych w żywym, nienaruszonym zwierzęciu, po bardzo precyzyjnych modyfikacjach ekspresji genów w badanym neuronie lub jego celach. W tym filmie prezentujemy nową technologię szybkiego, dokładnego i wysoce zlokalizowanego dostarczania reagentów do wewnętrznych warstw żywych embrionów pijawki, z wykorzystaniem pneumatycznego pistoletu kapilarnego, który został opracowany we współpracy pomiędzy laboratorium Alexa Grossmana a naszym laboratorium.Choć technikę tę można zastosować do dostarczania dwuniciowego RNA DNA lub każdej innej cząsteczki, którą można załadować na mikroskopijne cząsteczki złota, wykorzystamy ją zarówno do wyciszenia (knockdown), jak i nadekspresji (knockin) cząsteczki prowadzącej aksony Rin. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium Eduardo Ano w Division of Biological Sciences na University of California San Diego. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wyciszania lub nadekspresji cząsteczki prowadzącej aksony networking, która naturalnie występuje w brzusznej ścianie ciała, ale nie w domenie grzbietowej wszystkich segmentów ciała larwy.Wprowadzimy cząsteczki dwuniciowego RNA lub plazmidowego DNA do ściany ciała i zwojów wybranych segmentów na wczesnych etapach rozwoju. Holistyczne dostarczenie za pomocą pneumatycznej pistoletowej kapilary jest szczególnie istotne, ponieważ umożliwia perturbację wzorców ekspresji genów w wybranych obszarach podsegmentu, pozostawiając niepoddane działaniu segmenty jako kontrolę wewnętrzną. Ponadto metoda ta pozwala na dotarcie do wewnętrznych warstw komórek na wczesnych etapach rozwoju bez uszkadzania tkanki i bez konieczności otwierania preparatu.Na koniec, dostarczanie holistyczne ma tę zaletę, że pozwala na ukierunkowanie na ograniczoną liczbę komórek w wybranej lokalizacji, co stanowi rozwiązanie pośrednie między wyciszaniem pojedynczych komórek za pomocą mikroiniekcji a wyciszaniem systemowym poprzez podejścia genetyczne. Zatem zacznijmy. Medycynalny LE jest od dawna wykorzystywany do badania właściwości komórek nerwowych i powiązanych z zachowaniem obwodów neuronowych ze względu na prostotę układu nerwowego, który składa się z około 200 bilateralnych par neuronów oraz niewielkiego zestawu olbrzymich glejów.Każdy zwoj ganglionowy w 21 segmentach ciała oraz każdy neuron pijawki mogą być wielokrotnie identyfikowane i badane w poszczególnych osobnikach, od wczesnego embrionu po dorosłego osobnika. Od czasów faraonów pijawki były wykorzystywane do upuszczania krwi, a ich stałe zastosowanie w medycynie sprawia, że są one łatwo dostępne u komercyjnych dostawców zwierząt laboratoryjnych. Ponieważ jednak zajmujemy się badaniem rozwoju układu nerwowego, utrzymujemy w naszym laboratorium żywą kolonię obejmującą kilkaset pijawek, co zapewnia nam stały dopływ embrionów do przeprowadzanych eksperymentów.Pijawki są hermafrodytami. Posiadają zarówno żeńskie, jak i męskie struktury i zapylają się wzajemnie. W związku z tym wszystkie osobniki mogą składać jaja.Tworzą one strukturę zwaną kokonem, którą same wytwarzają za pomocą zestawu specjalnych gruczołów wydzielających interesujące polimery w obszarze ciała znanym jako klatellum. Pijawka, gdy jest gotowa do złożenia jaj, zakopuje się w mchu, który zapewniamy w zbiornikach, i zaczyna formować ten jajowaty kokon wokół swojego ciała. Po wydzieleniu wystarczającej ilości materiału i rozpoczęciu polimeryzacji cząsteczek, pijawka składa jaja oraz odżywcze żółtko wewnątrz kokonu, a następnie wysuwa się z niego. Używając żyletki, możemy usunąć embriony, wycinając otwór na końcu kokonu.Zazwyczaj w każdym kokonie znajduje się od 10 do 20 embrionów, począwszy od około szóstego dnia po rozpoczęciu ich różnicowania. Embriony można usunąć z kokonu i hodować w wodzie stawowej. To na tych etapach zazwyczaj rozpoczynamy nasze badania eksperymentalne nad rozwojem neuronalnym.Pierwszym głównym krokiem w tej procedurie jest przygotowanie powlekanych cząsteczek. W tej demonstracji pokażemy, jak wprowadzić do embrionów lech cząsteczki złota powlekane dwuniciowymi cząsteczkami RNA homologu lech cząsteczki prowadzenia aksonów rin. Komórkami docelowymi są brzuszne komórki mięśni podłużnych w ścianie ciała, o których wiadomo, że wykazują ekspresję i uwalniają Rin począwszy od wczesnych etapów rozwoju.Naszym celem jest wyciszenie naturalnej ekspresji w pojedynczym segmencie ciała tak wcześnie, jak to możliwe w trakcie rozwoju, oraz zaobserwowanie, jak wpływa to na kategoryzację neuronów wrażliwych na ten istotny czynnik rozwojowy. Do tego etapu niezbędne są: myjka ultradźwiękowa, wortex, wirówka laboratoryjna oraz wiadro z lodem. Niezbędny jest również 100% izopropanol, który przed użyciem należy schłodzić na lodzie.Zacznij od 100 µL buforu wiążącego zawierającego 50 mg cząsteczek vault na mililitr. Cząsteczki te są przeznaczone do RNAi i produkowane przez firmę chell. Następnie rozcieńcz roztwór cząsteczek, dodając 100 µL buforu wiążącego, krótko wymieszaj w wirówce typu vortex i poddaj sonikacji przez jedną do dwóch minut, aby rozdzielić cząsteczki, które mogły uległy agregacji.Po dwóch minutach inkubacji dodać od 5 do 10 µg dwuniciowego RNA do cząsteczek, wymieszać na wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po upływie dwóch minut odwirować kompleksy cząsteczek z dwuniciowym RNA z prędkością minimum 2 500 RPM w mikrowirówce przez około 15 sekund.Aby uzyskać osad, należy usunąć nadpłyn i dodać 750 µL izopropanolu, unikając w miarę możliwości naruszenia pelletu. Krótko wirować w mikrowirowce, a następnie usunąć nadpłyn po wirowaniu; następnie zawiesić cząstki złota w 100% zimnym izopropanolu, stosując sonikację. Wykonać krótko dwa do trzech impulsów w bady sonikatorze, aby rozdzielić cząstki.Wlej na szkiełko przedmiotowe i poczekaj do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy cząsteczki są powlekane bezpośrednio przed ich wprowadzeniem do tkanki, co pokażemy w następnym kroku. Przed przeprowadzeniem transfekcji istic, zapoznajmy się z układem eksperymentalnym i sposobem jego przygotowania.Pneumatyczna pistoletowa kapilara jest zamocowana na mikromanipulatorze w celu precyzyjnego wprowadzania cząsteczek do embrionów. Powierzchnia embrionu jest obrazowana za pomocą mikroskopu wideo. Laser półprzewodnikowy generuje wiązkę światła skierowaną przez wewnętrzną kapilarę pistoletu, która służy do celowania w docelową tkankę.Oddzielne linie rurek Titan podłączone do trzech wlotów głowicy pistoletu dostarczają sprężony gaz helowy z jednego źródła. Jedna linia pozostaje stale otwarta, co zapewnia ciągły przepływ gazu helowego przez pistolet. Dwie pozostałe linie są zazwyczaj zamknięte za pomocą elektrozaworów i zawierają cząsteczki złota z dwiema różnymi powłokami, które zostały wprowadzone do rurek.W formie suchego proszku. Zewnętrzna kapilara pistoletu jest podłączona do systemu próżniowego z ciśnieniem manometrycznym wynoszącym minus 12.5 PSI. Ciśnienie w głowicy hi jest regulowane w zakresie od 10 do 15 PSI w celu dostosowania do pożądanej głębokości penetracji cząsteczek.Ciśnienie helu w głowicy może w znacznym stopniu wpływać na głębokość penetracji cząstek, podobnie jak odległość od embrionu do pistoletu. Średnica dyszy, która różni się w zależności od modelu pistoletu genowego, powinna być dobrana odpowiednio do obszaru docelowego. Po zaprezentowaniu układu eksperymentalnego, załadujmy teraz pistolet Jing i wykonajmy strzały w embriony ryb z rodzaju lech.Przed załadowaniem rurki Titan krytyczne jest, aby powlekane cząstki złota były całkowicie suche. Powlekane cząstki złota należy najpierw zdrapać z szkiełek przedmiotowych za pomocą szkiełka nakrywkowego lub żyletki, a następnie przygotować do załadowania do złożonego kawałka papieru serwatkowego. Rurkę należy zgiąć w kształt litery U w pobliżu konektora, aby cząstki podczas ładowania nie rozprzestrzeniły się wzdłuż całej rurki, lecz skoncentrowały się blisko konektora.Przenieś cząstki za pomocą małej szpatułki lub kawałka papieru ważkiego zwiniętego w kształt litery V i załaduj je do probówki. Podczas etapu ładowania delikatnie stukaj palcem w probówkę, aby równomiernie rozprowadzić cząstki. Po załadowaniu probówki możemy przystąpić do wprowadzania dwuniciowego RNA za pomocą pistoletu do biolistyki Jing, ale najpierw musimy przygotować pijawki.Tutaj widoczne są embriony pijawek w wieku około 10 dni. Znajdują się one obecnie w sterylnym medium, w którym będą utrzymywane zarówno przed, jak i po dostarczeniu dwuniciowego RNA. Pierwszym krokiem w przygotowaniu embrionów eksperymentalnych do dostarczenia dwuniciowego RNA jest naniesienie roztworu 8% etanolu w sterylnym medium na płaski kawałek elastycznego silikonu z rowkiem w kształcie litery V.Dodaje się jeden embrion i umieszcza go stroną brzuszna do góry bezpośrednio przed wystrzeliwaniem cząsteczek. Poziom medium w komorze obniża się tak, aby znajdował się tuż poniżej górnej powierzchni embrionu, a następnie na wierzchu kładzie się kawałek papieru tkankowego z wyciętym w środku małym otworem, aby go ustabilizować i zapobiec wysychaniu powierzchni, jednocześnie odsłaniając jedynie obszar, który będzie celem w stosowanym dzisiaj stadium embrionalnym. W stadium E 10 komórki mięśni podłużnych znajdują się w odległości około 10 do 20 µm od powierzchni zewnętrznej, wewnętrznie względem naskórka, skóry właściwej i mięśni okrężnych.W przeciwieństwie do komórek mięśniowych, zwoje ośrodkowe na stronie brzusznej embrionów w stadiach embrionalnych, z którymi pracujemy (od E7 do E12), znajdują się około 50 µm poniżej brzusznej powierzchni ciała. Dostosujemy ciśnienie helu tak, aby celować w mięśnie podłużne, które znajdują się na płytszej głębokości niż zwoje. Teraz jesteśmy gotowi do wprowadzenia cząsteczek złota do mięśni podłużnych.Porcja cząsteczek złota o masie około 0,5 mg zazwyczaj pozwala na wykonanie do 10 strzałów, przy czym pojedynczy strzał dostarcza zwykle kilkuset cząsteczek. Strzał generuje się poprzez krótkie otwarcie jednego z zaworów na 0,3 s, co powoduje wstrzyknięcie bolusa cząsteczek z odpowiadającej linii rurek do lufy pistoletu. Aby pokryć interesowany obszar tkanki, często wymagane jest wykonanie wielu strzałów.Przewód jest delikatnie opukiwany pomiędzy strzałami, aby poluzować cząstki i ułatwić ich wstrzyknięcie do ciągłego strumienia helu wewnątrz lufy pistoletu. Jeśli istnieje potrzeba podania drugiego odczynnika w tym samym badaniu, można załadować alternatywne cząstki do drugiego przewodu bezpośrednio po podaniu cząstek złota. Zarodki umieszcza się z powrotem w sztucznej wodzie stawowej, najlepiej po jednym zarodku na szalkę, na okres od jednego do trzech dni, aż do momentu, gdy RNAi lub ekspresja ektopowa zostaną uznane za wystarczające.W tym czasie embriony są przechowywane w zaciemnionej komorze w temperaturze pokojowej. Oto analiza hybrydyzacji in situ dla narine, po wyciszeniu genu Mr.NA. Można zauważyć, że w potraktowanym embrionie niewielu komórek mięśniowych nie wykazuje ekspresji terrin.Mięśnie te zawierają cząsteczki. Można zauważyć, że gdy cząsteczki zostały pokryte dwuniciowym RNA terrin, spowodowały one wyraźnie widoczny knockdown ekspresji narin, który wystąpił wyłącznie w komórkach zawierających cząsteczki, zazwyczaj od jednej do dwóch cząsteczek na komórkę. Kiedy pokryjemy cząsteczki plazmidem kodującym GFP, uzyskujemy fluorescencję w komórkach neuronalnych, gdy zostaną one wprowadzone do ich jąder za pomocą używanej przez nas pneumatycznej kapilary do wstrzykiwania.W niniejszym pokazie udało nam się wprowadzić obie cząsteczki do komórek w niewielkiej, zlokalizowanej objętości żywego embrionu, nie powodując wykrywalnych uszkodzeń komórek w obszarze docelowym. Pokazaliśmy również, w jaki sposób nomadyczny pistolet kapilarny umożliwia zastosowanie techniki dostarczania holistycznego oraz daje nową możliwość wprowadzania (knock-in) i wyciszania (knock-down) genów w mikroskopijnym obszarze tkanki ograniczonej w trzech wymiarach i celowanej z wysoką precyzją, bez wykrywalnego uszkodzenia tkanki. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

localized-rnai-and-ectopic-gene-expression-in-the-medicinal-leech

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zlokalizowana ekspresja RNAi i ektopiczna ekspresja genów u pijawki leczniczej

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.<br...

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Poznaj metodę biolistycznego dostarczania RNAi do embrionów pijawki lekarskiej przy użyciu pneumatycznej strzelby kapilarnej. Technika umożliwia precyzyjne badanie ekspresji genu Netrin w neurobiologii.

Lokalne RNAi i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

Przeglądaj więcej filmów