Lokalne RNAi i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

Pijawka medyczna stanowi użyteczny system modelowy w badaniach neurobiologicznych ze względu na swoją prostotę, dostępność oraz możliwość statycznej identyfikacji neuronów przy użyciu wielu różnych narzędzi eksperymentalnych, od wczesnego embrionogenezy aż po wiek starczy. Szczególnie interesującym zastosowaniem embrionu pijawki są badania obrazowania time-lapse w celu obserwacji wypustek neuronalnych w żywym, nienaruszonym zwierzęciu, po bardzo precyzyjnych modyfikacjach ekspresji genów w badanym neuronie lub jego celach. W tym filmie prezentujemy nową technologię szybkiego, dokładnego i wysoce zlokalizowanego dostarczania reagentów do wewnętrznych warstw żywych embrionów pijawki, z wykorzystaniem pneumatycznego pistoletu kapilarnego, który został opracowany we współpracy pomiędzy laboratorium Alexa Grossmana a naszym laboratorium.

Choć technikę tę można zastosować do dostarczania dwuniciowego RNA DNA lub każdej innej cząsteczki, którą można załadować na mikroskopijne cząsteczki złota, wykorzystamy ją zarówno do wyciszenia (knockdown), jak i nadekspresji (knockin) cząsteczki prowadzącej aksony Rin. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium Eduardo Ano w Division of Biological Sciences na University of California San Diego. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wyciszania lub nadekspresji cząsteczki prowadzącej aksony networking, która naturalnie występuje w brzusznej ścianie ciała, ale nie w domenie grzbietowej wszystkich segmentów ciała larwy.

Wprowadzimy cząsteczki dwuniciowego RNA lub plazmidowego DNA do ściany ciała i zwojów wybranych segmentów na wczesnych etapach rozwoju. Holistyczne dostarczenie za pomocą pneumatycznej pistoletowej kapilary jest szczególnie istotne, ponieważ umożliwia perturbację wzorców ekspresji genów w wybranych obszarach podsegmentu, pozostawiając niepoddane działaniu segmenty jako kontrolę wewnętrzną. Ponadto metoda ta pozwala na dotarcie do wewnętrznych warstw komórek na wczesnych etapach rozwoju bez uszkadzania tkanki i bez konieczności otwierania preparatu.

Na koniec, dostarczanie holistyczne ma tę zaletę, że pozwala na ukierunkowanie na ograniczoną liczbę komórek w wybranej lokalizacji, co stanowi rozwiązanie pośrednie między wyciszaniem pojedynczych komórek za pomocą mikroiniekcji a wyciszaniem systemowym poprzez podejścia genetyczne. Zatem zacznijmy. Medycynalny LE jest od dawna wykorzystywany do badania właściwości komórek nerwowych i powiązanych z zachowaniem obwodów neuronowych ze względu na prostotę układu nerwowego, który składa się z około 200 bilateralnych par neuronów oraz niewielkiego zestawu olbrzymich glejów.

Każdy zwoj ganglionowy w 21 segmentach ciała oraz każdy neuron pijawki mogą być wielokrotnie identyfikowane i badane w poszczególnych osobnikach, od wczesnego embrionu po dorosłego osobnika. Od czasów faraonów pijawki były wykorzystywane do upuszczania krwi, a ich stałe zastosowanie w medycynie sprawia, że są one łatwo dostępne u komercyjnych dostawców zwierząt laboratoryjnych. Ponieważ jednak zajmujemy się badaniem rozwoju układu nerwowego, utrzymujemy w naszym laboratorium żywą kolonię obejmującą kilkaset pijawek, co zapewnia nam stały dopływ embrionów do przeprowadzanych eksperymentów.

Pijawki są hermafrodytami. Posiadają zarówno żeńskie, jak i męskie struktury i zapylają się wzajemnie. W związku z tym wszystkie osobniki mogą składać jaja.

Tworzą one strukturę zwaną kokonem, którą same wytwarzają za pomocą zestawu specjalnych gruczołów wydzielających interesujące polimery w obszarze ciała znanym jako klatellum. Pijawka, gdy jest gotowa do złożenia jaj, zakopuje się w mchu, który zapewniamy w zbiornikach, i zaczyna formować ten jajowaty kokon wokół swojego ciała. Po wydzieleniu wystarczającej ilości materiału i rozpoczęciu polimeryzacji cząsteczek, pijawka składa jaja oraz odżywcze żółtko wewnątrz kokonu, a następnie wysuwa się z niego. Używając żyletki, możemy usunąć embriony, wycinając otwór na końcu kokonu.

Zazwyczaj w każdym kokonie znajduje się od 10 do 20 embrionów, począwszy od około szóstego dnia po rozpoczęciu ich różnicowania. Embriony można usunąć z kokonu i hodować w wodzie stawowej. To na tych etapach zazwyczaj rozpoczynamy nasze badania eksperymentalne nad rozwojem neuronalnym.

Pierwszym głównym krokiem w tej procedurie jest przygotowanie powlekanych cząsteczek. W tej demonstracji pokażemy, jak wprowadzić do embrionów lech cząsteczki złota powlekane dwuniciowymi cząsteczkami RNA homologu lech cząsteczki prowadzenia aksonów rin. Komórkami docelowymi są brzuszne komórki mięśni podłużnych w ścianie ciała, o których wiadomo, że wykazują ekspresję i uwalniają Rin począwszy od wczesnych etapów rozwoju.

Naszym celem jest wyciszenie naturalnej ekspresji w pojedynczym segmencie ciała tak wcześnie, jak to możliwe w trakcie rozwoju, oraz zaobserwowanie, jak wpływa to na kategoryzację neuronów wrażliwych na ten istotny czynnik rozwojowy. Do tego etapu niezbędne są: myjka ultradźwiękowa, wortex, wirówka laboratoryjna oraz wiadro z lodem. Niezbędny jest również 100% izopropanol, który przed użyciem należy schłodzić na lodzie.

Zacznij od 100 µL buforu wiążącego zawierającego 50 mg cząsteczek vault na mililitr. Cząsteczki te są przeznaczone do RNAi i produkowane przez firmę chell. Następnie rozcieńcz roztwór cząsteczek, dodając 100 µL buforu wiążącego, krótko wymieszaj w wirówce typu vortex i poddaj sonikacji przez jedną do dwóch minut, aby rozdzielić cząsteczki, które mogły uległy agregacji.

Po dwóch minutach inkubacji dodać od 5 do 10 µg dwuniciowego RNA do cząsteczek, wymieszać na wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po upływie dwóch minut odwirować kompleksy cząsteczek z dwuniciowym RNA z prędkością minimum 2 500 RPM w mikrowirówce przez około 15 sekund.

Aby uzyskać osad, należy usunąć nadpłyn i dodać 750 µL izopropanolu, unikając w miarę możliwości naruszenia pelletu. Krótko wirować w mikrowirowce, a następnie usunąć nadpłyn po wirowaniu; następnie zawiesić cząstki złota w 100% zimnym izopropanolu, stosując sonikację. Wykonać krótko dwa do trzech impulsów w bady sonikatorze, aby rozdzielić cząstki.

Wlej na szkiełko przedmiotowe i poczekaj do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy cząsteczki są powlekane bezpośrednio przed ich wprowadzeniem do tkanki, co pokażemy w następnym kroku. Przed przeprowadzeniem transfekcji istic, zapoznajmy się z układem eksperymentalnym i sposobem jego przygotowania.

Pneumatyczna pistoletowa kapilara jest zamocowana na mikromanipulatorze w celu precyzyjnego wprowadzania cząsteczek do embrionów. Powierzchnia embrionu jest obrazowana za pomocą mikroskopu wideo. Laser półprzewodnikowy generuje wiązkę światła skierowaną przez wewnętrzną kapilarę pistoletu, która służy do celowania w docelową tkankę.

Oddzielne linie rurek Titan podłączone do trzech wlotów głowicy pistoletu dostarczają sprężony gaz helowy z jednego źródła. Jedna linia pozostaje stale otwarta, co zapewnia ciągły przepływ gazu helowego przez pistolet. Dwie pozostałe linie są zazwyczaj zamknięte za pomocą elektrozaworów i zawierają cząsteczki złota z dwiema różnymi powłokami, które zostały wprowadzone do rurek.

W formie suchego proszku. Zewnętrzna kapilara pistoletu jest podłączona do systemu próżniowego z ciśnieniem manometrycznym wynoszącym minus 12.5 PSI. Ciśnienie w głowicy hi jest regulowane w zakresie od 10 do 15 PSI w celu dostosowania do pożądanej głębokości penetracji cząsteczek.

Ciśnienie helu w głowicy może w znacznym stopniu wpływać na głębokość penetracji cząstek, podobnie jak odległość od embrionu do pistoletu. Średnica dyszy, która różni się w zależności od modelu pistoletu genowego, powinna być dobrana odpowiednio do obszaru docelowego. Po zaprezentowaniu układu eksperymentalnego, załadujmy teraz pistolet Jing i wykonajmy strzały w embriony ryb z rodzaju lech.

Przed załadowaniem rurki Titan krytyczne jest, aby powlekane cząstki złota były całkowicie suche. Powlekane cząstki złota należy najpierw zdrapać z szkiełek przedmiotowych za pomocą szkiełka nakrywkowego lub żyletki, a następnie przygotować do załadowania do złożonego kawałka papieru serwatkowego. Rurkę należy zgiąć w kształt litery U w pobliżu konektora, aby cząstki podczas ładowania nie rozprzestrzeniły się wzdłuż całej rurki, lecz skoncentrowały się blisko konektora.

Przenieś cząstki za pomocą małej szpatułki lub kawałka papieru ważkiego zwiniętego w kształt litery V i załaduj je do probówki. Podczas etapu ładowania delikatnie stukaj palcem w probówkę, aby równomiernie rozprowadzić cząstki. Po załadowaniu probówki możemy przystąpić do wprowadzania dwuniciowego RNA za pomocą pistoletu do biolistyki Jing, ale najpierw musimy przygotować pijawki.

Tutaj widoczne są embriony pijawek w wieku około 10 dni. Znajdują się one obecnie w sterylnym medium, w którym będą utrzymywane zarówno przed, jak i po dostarczeniu dwuniciowego RNA. Pierwszym krokiem w przygotowaniu embrionów eksperymentalnych do dostarczenia dwuniciowego RNA jest naniesienie roztworu 8% etanolu w sterylnym medium na płaski kawałek elastycznego silikonu z rowkiem w kształcie litery V.

Dodaje się jeden embrion i umieszcza go stroną brzuszna do góry bezpośrednio przed wystrzeliwaniem cząsteczek. Poziom medium w komorze obniża się tak, aby znajdował się tuż poniżej górnej powierzchni embrionu, a następnie na wierzchu kładzie się kawałek papieru tkankowego z wyciętym w środku małym otworem, aby go ustabilizować i zapobiec wysychaniu powierzchni, jednocześnie odsłaniając jedynie obszar, który będzie celem w stosowanym dzisiaj stadium embrionalnym. W stadium E 10 komórki mięśni podłużnych znajdują się w odległości około 10 do 20 µm od powierzchni zewnętrznej, wewnętrznie względem naskórka, skóry właściwej i mięśni okrężnych.

W przeciwieństwie do komórek mięśniowych, zwoje ośrodkowe na stronie brzusznej embrionów w stadiach embrionalnych, z którymi pracujemy (od E7 do E12), znajdują się około 50 µm poniżej brzusznej powierzchni ciała. Dostosujemy ciśnienie helu tak, aby celować w mięśnie podłużne, które znajdują się na płytszej głębokości niż zwoje. Teraz jesteśmy gotowi do wprowadzenia cząsteczek złota do mięśni podłużnych.

Porcja cząsteczek złota o masie około 0,5 mg zazwyczaj pozwala na wykonanie do 10 strzałów, przy czym pojedynczy strzał dostarcza zwykle kilkuset cząsteczek. Strzał generuje się poprzez krótkie otwarcie jednego z zaworów na 0,3 s, co powoduje wstrzyknięcie bolusa cząsteczek z odpowiadającej linii rurek do lufy pistoletu. Aby pokryć interesowany obszar tkanki, często wymagane jest wykonanie wielu strzałów.

Przewód jest delikatnie opukiwany pomiędzy strzałami, aby poluzować cząstki i ułatwić ich wstrzyknięcie do ciągłego strumienia helu wewnątrz lufy pistoletu. Jeśli istnieje potrzeba podania drugiego odczynnika w tym samym badaniu, można załadować alternatywne cząstki do drugiego przewodu bezpośrednio po podaniu cząstek złota. Zarodki umieszcza się z powrotem w sztucznej wodzie stawowej, najlepiej po jednym zarodku na szalkę, na okres od jednego do trzech dni, aż do momentu, gdy RNAi lub ekspresja ektopowa zostaną uznane za wystarczające.

W tym czasie embriony są przechowywane w zaciemnionej komorze w temperaturze pokojowej. Oto analiza hybrydyzacji in situ dla narine, po wyciszeniu genu Mr.NA. Można zauważyć, że w potraktowanym embrionie niewielu komórek mięśniowych nie wykazuje ekspresji terrin.

Mięśnie te zawierają cząsteczki. Można zauważyć, że gdy cząsteczki zostały pokryte dwuniciowym RNA terrin, spowodowały one wyraźnie widoczny knockdown ekspresji narin, który wystąpił wyłącznie w komórkach zawierających cząsteczki, zazwyczaj od jednej do dwóch cząsteczek na komórkę. Kiedy pokryjemy cząsteczki plazmidem kodującym GFP, uzyskujemy fluorescencję w komórkach neuronalnych, gdy zostaną one wprowadzone do ich jąder za pomocą używanej przez nas pneumatycznej kapilary do wstrzykiwania.

W niniejszym pokazie udało nam się wprowadzić obie cząsteczki do komórek w niewielkiej, zlokalizowanej objętości żywego embrionu, nie powodując wykrywalnych uszkodzeń komórek w obszarze docelowym. Pokazaliśmy również, w jaki sposób nomadyczny pistolet kapilarny umożliwia zastosowanie techniki dostarczania holistycznego oraz daje nową możliwość wprowadzania (knock-in) i wyciszania (knock-down) genów w mikroskopijnym obszarze tkanki ograniczonej w trzech wymiarach i celowanej z wysoką precyzją, bez wykrywalnego uszkodzenia tkanki. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.