Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Zakres naszych badań polega głównie na analizie molekularnej, którą możemy wykorzystać do charakteryzowania mikroorganizmów zaangażowanych w remediację, górnictwo, zapobieganie korozji, co naprawdę pomaga nam odpowiadać na pytania dotyczące zrównoważonego rozwoju. Badania te rozwiązują szereg luk naukowych i dostępnościowych poprzez wykorzystanie niezawodnych i przenośnych w terenie procesów molekularno-biologicznych, które są proste w obsłudze. Odkręć oba końce filtra i podłącz trzymililitrową strzykawkę wypełnioną powietrzem do filtra za pomocą złącza blokującego luer.

Przepchnij powietrze, aby wypchnąć resztki wody. Odłącz strzykawkę i wciągnij więcej powietrza przed powtórzeniem. Następnie ponownie zakręć czerwony korek gniazdka.

Odwróć roztwór strzykawką, żeby wymieszać. Zdejmij nakrętkę strzykawki z blokadą Luer i podłącz strzykawkę Roztworu A do zamkniętego wlotu filtra 0,2 mikrometra za pomocą końcówki blokującej Luer. Naciśnij tłok, aby powoli dodać Roztwór A. Następnie energicznie potrząsaj zamkniętym filtrem przez pięć minut.

Teraz odwróć strzykawkę z roztworem B kilka razy, aby wymieszać. Zdejmij nakrętkę Luer i podłącz strzykawkę do wlotu filtra zamkniętego przez końcówkę blokady Luer. Po ponownym zakręceniu korek filtra wlotowego, energicznie potrząsaj zamkniętym filtrem przez pięć minut.

Zdejmij korek wlotowy i odwróć filtr. Użyj trzymililitrowej strzykawki przymocowanej do kapsulowanej jednostki filtracyjnej, aby wprowadzić jeden mililitr powietrza do filtra. Następnie pociągnij tłok, żeby usunąć cały lizatan.

Przelej lizat do rurki z kulkami pięciomililitrowymi. Po uszczelnieniu parafilmem, energicznie potrząśnij rurką koralikową przez pięć minut, zanim ustawisz ją pionowo. Umieść wkład do przygotowania próbki na płaskiej powierzchni i podłącz blokowalną kolumnę Luer do strzykawki o średnicy jednego mililitra.

Użyj ostrego końca kolumny, aby zrobić dwa otwory w pierwszej części wkładu do przygotowania próbki. Pipetą podaj jeden mililitr lizatu z rurki kulki do nowo wyciśniętego otworu w pierwszej części wkładu. Włóż kolumnę strzykawki z powrotem do czerwonej części wkładu.

Następnie całkowicie wciągnij płyn do strzykawki i wypchnij go 10 razy. Teraz umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad czerwono-pomarańczową sekcją i przebij dwa otwory przez folię. Używając tłoka, wciągnij pełną objętość płynu strzykawki do środka i całkowicie wypompuj płyn z powrotem.

Podobnie, użyj kolumny strzykawki do przekłucia i pompowania pomarańczowej, żółtej, niebieskiej, suszonej na powietrzu i zielonej części, ciągnąc i naciskając tłok tyle razy, ile razy jest podane w danym przekroju. Następnie użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra i kolumny przygotowującej próbkę, aby przenieść cały roztwór z zielonej sekcji do dobrze oznakowanej mikrorurki o pojemności jednego mililitra. Umieść do trzech próbek DNA ekstrahowanych w terenie w czystych tacach narzędzi qPCR opartych na terenie, zapewniając jedną próbkę na wyznaczoną sekcję.

Umieść paski testowe dla każdej próbki w odpowiednich szczelinach A, B lub C na tacce, ustawiając pierwszą jamkę każdego paska z pierwszym otworem na tacce. Odblokowaj telefon i otwórz aplikację nazwaną na cześć zastrzeżonego instrumentu qPCR. Po otwarciu aplikacji stuknij przycisk Start Run.

Na następnym ekranie kliknij przycisk Generuj ID. Wprowadź informacje o próbce, dotykając pod Sample ID i wpisując nazwę próbki. Stuknij w jednostki próbki i wybierz odpowiednią jednostkę, następnie stuknij pod ilość próbki i wpisz objętość użytą podczas ekstrakcji.

Po wpisaniu informacji o wszystkich próbkach naciśnij przycisk Kontynuuj. Na następnym ekranie kliknij ikonę folderu, a następnie kliknij Zapisz do Aktualnego folderu. Wpisz nazwę serii i naciśnij Potwierdź.

Włącz urządzenie, naciskając i przytrzymując przycisk zasilania, aż wszystkie przednie światła się zapalą. Kliknij Potwierdź w aplikacji, aby przejść dalej. Naciśnij Connect przez zintegrowane połączenie krótkego zasięgu w aplikacji.

Naciśnij zintegrowany przycisk bezprzewodowy krótkiego zasięgu na instrumencie, aż niebieskie światło zacznie migać. Następnie kliknij Potwierdź i wybierz nazwę instrumentu, aby się połączyć. Zdejmij kapsle z probówek go strip przy pierwszej próbce.

Dodaj 18 mikrolitrów sterylnej wody do każdego dołka i delikatnie pipetuj, aby rozpuścić granulat. Do każdego dołku dodaj dwa mikrolitry próbki i uszczelnij probówki gumowymi kapslami do testowania, zapewniając prawidłowe ustawienie. Kliknij Potwierdź w aplikacji, gdy wszystkie paski są gotowe.

Usuń każdy pasek testowy. Sprawdź, czy na dnie dołków nie ma bąbelków, a potem delikatnie kołysz pasek, aż bąbelki się uniesą. Naciśnij Potwierdź, aby przejść dalej.

Otwórz pokrywkę instrumentu i umieść paski testowe w odpowiedniej kolejności i ustawieniu. Zamknij pokrywę, aż się zablokuje, i stuknij w Potwierdź. Naciśnij przycisk Start Run w aplikacji, aby rozpocząć bieg.

Po zakończeniu biegu kliknij Wyniki e-mail. Po podłączeniu do bezprzewodowego internetu naciśnij Wyślij ponownie, aby przesłać wyniki. Dokładnie czyść tacę między cyklami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

Pomyślne zakończenie izolacji DNA przy użyciu zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej zostało potwierdzone przez spójne wyniki qPCR w porównaniu z zwalidowaną metodą laboratoryjną. Standardowe rozcieńczenie hodowli Dehalococcoides analizowane za pomocą jednostki qPCR opartej na polu wykazało niskie odchylenia w ciągu 10 powtórzeń przy temperaturach 21 i 30 stopni Celsjusza. Testy precyzyjne instrumentów polowych wykazały względne odchylenie standardowe poniżej 5% we wszystkich przebiegach.

Nasze odkrycia naprawdę posuwają dziedzinę naprzód, umożliwiając monitorowanie środowiska w tych odległych lokalizacjach, co naprawdę zwiększa dostępność, zaangażowanie społeczności i tworzy bardzo znaczące badania naukowe. Nasze wyniki utorowały drogę do zrozumienia, jak próbki zmieniają się podczas transportu w porównaniu do natychmiastowego wydobycia i analizy. Przyszłe badania będą koncentrować się na określeniu granic tych metod dla ekstremalnych próbek, takich jak solanka, jak również ekstremalnych warunków pogodowych.