Name: Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny morfologii mitochondriów in situ w mięśniach szkieletowych i komórkach Schwanna końcowych myszy. Technika wykorzystuje barwnik wrażliwy na potencjał błonowy i mikroskopię konfokalną do analizy sieci mitochondrialnych w nienaruszonych tkankach neuromięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Mariappanowi Muthuchamy'emu, Mendellowi Rimerowi i Peterowi Nghiemowi za hojne udostępnienie myszy D2.mdx użytych do oceny mitochondriów tSC. Praca ta była wspierana przez stypendium badawcze dla studentów z Sydney and J.L. Huffines Institute for Sports Medicine and Human Performance oraz funduszami College of Education and Human Development na Texas A&M University. A.B.M. był również wspierany przez NIH LRP (NIAMS, 2L40AR077899-02A3).

Sześciomiesięczne (n=3) dorosłe samce DBA/2J [Wild-type (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) i D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), a także trzy- do pięciomiesięczni (n=8) dorosłe samce i samice B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [także połączone z WT, ponieważ nie stwierdzono różnic w porównaniu z DBA], pochodzące z kolonii utrzymywanej przez badacza, zostały wykorzystane. Ogólny przebieg eksperymentu dotyczącego zastrzyków do TA i GM, przetwarzania tkanek i obrazowania podsumowano na Rysunku 1. Dodatkowo jedna mysz D2.mdx została przekazana przez badacza do obrazowania tSC w mdx (n=1). Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Texas A&M University (AUP 2022-0215) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Rady Badań Narodowych (8. wydanie)30. Eutanazję wykonano poprzez dyslokację szyjną podczas przedawkowania izofluranu.
1. Przygotowanie pracowczego roztworu barwnika mitochondrialnego fluoryzującego o stężeniu 2 µM
<ol>
	<li>Zawieś barwnik mitochondrialny (50 µg) w 322 µL dimetylosulfonu (DMSO) zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować 200 µM stężony roztwór początkowy.</li>
	<li>Aby przygotować 30 mL 2 µM pracowczego roztworu, przenieś 300 µL 200 µM stężonego roztworu do 29,7 mL sterylnego roztworu chlorku sodu. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Przenieś 250 µL 2 µM pracowczego roztworu do mikrocentryfugowych probówek i przechowuj w temperaturze -80 °C aż do użycia. 
	UWAGA: Nie stwierdzono wykrywalnej degradacji sygnału po 3 latach przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Barwnik i przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Rozmrażaj jedną zamrożoną alikwotę 15 min przed eksperymentem. Wyciągnij roztwór do 30 G, 1 cc strzykawki do insuliny.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę izofluranem. Zastosuj maść okulistyczną, ogolić miejsce wstrzyknięcia i utrzymać temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej z sondą temperatury umieszczoną między zwierzęciem a źródłem ciepła.</li>
	<li>Wyczyść ogolone miejsce wstrzyknięcia 70% izopropylowym alkoholem.</li>
</ol>
3. Podawanie barwnika mitochondrialnego do mięśnia przednio-bocznego goleni (TA) i jego funkcja
<ol>
	<li>Podawanie barwnika do TA
	<ol>
		<li>Pod znieczuleniem, wstrzyknij 50 µL 2 µM barwnika mitochondrialnego do lewego lub prawego mięśnia TA u znieczulonych myszy WT i D2.mdx.</li>
		<li>Wstrzyknij igłę w ścięgnie dalszym w kierunku kolana i uciśnij tłok podczas wyciągania igły wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia.</li>
		<li>Inkubuj barwnik in vivo przez 1 godzinę przed sekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar funkcji mięśnia TA
	<ol>
		<li>Po 45 minucie inkubacji barwnika, znieczulić mysz za pomocą izofluranu (2%–3% indukcja, 1,5%–2% utrzymanie w tlenie).</li>
		<li>Chirurgicznie odsłoń lewy mięsień TA, zachowując otaczające tkanki. Przywiązać dalsze ścięgno do belki obciążeniowej systemu testującego mięśnie.</li>
		<li>Owinąć odsłonięty mięsień ręcznikiem laboratoryjnym i nawadniać z szybkością 3 mL min⁻1 0,9% sterylnym roztworem chlorku sodu podgrzanym do 40 °C. Utrzymaj temperaturę mięśnia na poziomie 32 °C za pomocą lampy grzewczej.</li>
		<li>Umieść elektrody z platyny/irydiu na brzusznej stronie mięśnia dla bezpośredniego stymulowania.</li>
		<li>Przymocuj belkę obciążeniową do mikrometru i dostosuj optymalną długość (L0) przy użyciu skurczu szybkiego (Tw) z częstotliwością 1 Hz. Zmierz L0 za pomocą kalibru cyfrowego.</li>
		<li>Wywołaj maksymalne skurczenia tetaniczne (P0) trzykrotnie z częstotliwością 140 Hz z 60-sekundowymi przerwami między skurczeniami. Zmierz najwyższą wartość siły (g). Zbierz dane za pomocą systemu funkcji mięśni z oprogramowaniem analitycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie tkanki TA
	<ol>
		<li>Po inkubacji, izolację i sekcje mięśnia TA przeprowadzić przed eutanazją.</li>
		<li>Umieść izolowane wiązki włókien mięśniowych w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie rozdzielając włókna pod stereomikroskopem.

<ol><li>Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+turnover+during+chronic+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse.</a> Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).</li>
<li>Iqbal, S., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+fusion+and+fission+in+skeletal+muscle+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction.</a> Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).</li>
<li>Hyatt, H. W., Powers, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+is+a+common+denominator+linking+skeletal+muscle+wasting+due+to+disease%2C+aging%2C+and+prolonged+inactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity.</a> Antioxidants. 10 (4), 588(2021).</li>
<li>Katti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+network+configuration+influences+sarcomere+and+myosin+filament+structure+in+striated+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles.</a> Nat Commun. 13, 6058(2022).</li>
<li>Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+mitochondrial+form+and+function+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualizing mitochondrial form and function within the cell.</a> Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).</li>
<li>Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+exercise-induced+fiber+type+transformation%2C+mitochondrial+biogenesis%2C+and+angiogenesis+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).</li>
<li>Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+oxidative+stress+in+humans%3A+Cause+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences.</a> Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).</li>
<li>Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+muscle+atrophy+during+prolonged+inactivity%3A+A+review+of+the+causes+and+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects.</a> Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).</li>
<li>Drake, J. C., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+maintaining+skeletal+muscle+mitochondrial+proteostasis+and+metabolic+health+with+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing.</a> J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%3A+Roles+in+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy.</a> J Transl Med. 21 (1), 503(2023).</li>
<li>Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis1+deficiencies+differentially+affect+mitochondrial+quality+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle.</a> Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).</li>
<li>Silva, K. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+suppresses+autophagy+and+disrupts+ultrastructural+morphology+and+function+of+mitochondria+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).</li>
<li>Cattin, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-induced+blood+vessels+guide+Schwann+cell-mediated+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves.</a> Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).</li>
<li>Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+and+intraneural+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization.</a> Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).</li>
<li>Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+interplay+between+axon+degeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular interplay between axon degeneration and regeneration.</a> Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).</li>
<li>Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+strategies+in+tissue+engineering+for+guided+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration.</a> Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog%2C+and+observations+of+the+alterations+produced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers.</a> Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).</li>
<li>Napoli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+the+ERK-signaling+pathway+in+controlling+Schwann+cell+plasticity+and+peripheral+nerve+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo.</a> Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repair+Schwann+cell+and+its+function+in+regenerating+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves.</a> J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).</li>
<li>Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+remodeling+during+recovery+of+the+neuromuscular+junction+from+terminal+Schwann+cell+ablation+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice.</a> Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).</li>
<li>Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+mitochondrial+structure+across+subcellular+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales.</a> Front Physiol. 11, 541040(2020).</li>
<li>Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+axonal+and+mitochondrial+ultrastructure+and+function+in+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter.</a> J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).</li>
<li>Suh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fragmentation+and+donut+formation+enhance+mitochondrial+secretion+to+promote+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis.</a> Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).</li>
<li>Laker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MitoTimer+reporter+gene+for+mitochondrial+content%2C+structure%2C+stress%2C+and+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo.</a> J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).</li>
<li>Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+blood+flow+regulation+in+microvascular+resistance+networks+during+regeneration+of+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).</li>
<li>Hammers, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+D2.mdx+mouse+as+a+preclinical+model+of+the+skeletal+muscle+pathology+associated+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy.</a> Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).</li>
<li>Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetic+dysfunction+in+the+D2.mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy+is+associated+with+microtubule+disorganization+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle.</a> PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).</li>
<li>Rosen, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+fission+protein+Drp1+ameliorates+myopathy+in+the+D2-mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Ino, D., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+mitochondria+as+key+regulators+in+the+development+and+maintenance+of+peripheral+nerve+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).</li>
<li>Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+neuropathy+in+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders.</a> Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).</li>
<li>Schröder, J. M., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+abnormalities+in+human+sural+nerves%3A+Fine+structural+evaluation+of+cases+with+mitochondrial+myopathy%2C+hereditary+and+non-hereditary+neuropathies%2C+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature.</a> Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).</li>
<li>Schröder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathy+associated+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neuropathy associated with mitochondrial disorders.</a> Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+terminal+Schwann+cells%3A+An+overlooked+component+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction.</a> J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).</li>
<li>Morton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+deletion+of+endothelial+cell+Efnb2+delays+capillary+regeneration+and+attenuates+myofibre+reinnervation+following+myotoxin+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice.</a> J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).</li>
<li>Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+chloride+injures+myofibers+through+calcium-induced+proteolysis+with+fragmentation+of+motor+nerves+and+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels.</a> Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).</li>
<li>Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+the+mitochondrial+reticulum+from+fission+and+fusion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics.</a> PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).</li>
<li>Ferramosca, A., Zara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+carriers+and+substrate+transport+network%3A+A+lesson+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych spornych interesów.

Lokalizacja mitochondriów w strukturach komórkowych, a także ich morfologia, koreluje ze zdrowiem mitochondrialnym i zapotrzebowaniem metabolicznym21. Biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie zdrowia mitochondrialnego, w połączeniu z różnymi kinetykami oddychania i morfologią różnych typów komórek, opracowano łatwo stosowany, oparty na mikroskopii konfokalnej, metodę oceny morfologii mitochondriów w tSC przy pierwszym ocenianiu metody w mięśniach szkieletowych, dostarczając informacji o zdrowiu mitoch...

Mitochondria są niezwykłymi, plastycznymi organellami, które działają jak płuca komórki, zużywając tlen podczas oddychania komórkowego w celu wsparcia produkcji adenozynotrifosforanowej (ATP) w odpowiedzi na zapotrzebowanie metaboliczne1. Chociaż kiedyś uważano je za oddzielne organelle, obecnie wiadomo, że mitochondria są silnie zintegrowane2,3,4, dzieląc substrat energetyczny w całym ich sieci zgodnie z lokalnymi potrzebami. Integracja zapewnia wyraźną przewagę nad izolacją: połączone mitochondria wspierają niedobory energii, utrzymując gradienty elektrochemiczne dla fosforylacji oksydacyjnej podczas zwiększonego zapotrzebowania metabolicznego. Rzeczywiście, rozmieszczenie, objętość i morfologia mitochondriów odpowiadają potrzebom energetycznym w ich pobliżu5. W zdrowiu, regularne odnawianie sieci mitochondriów utrzymywane jest przez biogenezę mitochondriów, zdarzenia fuzji i fiksji oraz mitofagię2,3. Biogeneza mitochondriów jest wymagana do utrzymania i rozszerzenia zdrowych mitochondriów. Zapotrzebowanie metaboliczne, takie jak ćwiczenia fizyczne, zwiększa ekspresję receptora peroksysomowego proliferatora koaktywator 1α (PGC-1α)5. Proces ten zachodzi poprzez pierwotne sygnały wytrzymałości, szczególnie indukowaną wysiłkiem podwyższenie kinazy aktywowanej AMP (AMPK), wapnia i reaktywnych form tlenu6,7. Fuzja rozszerza sieci, promując przetrwanie i uzupełniając niedobory, podczas gdy fiksja łagodzi dalsze uszkodzenia mitochondriów poprzez preferencyjne wykluczenie dysfunkcyjnego regionu2,3,8. Po usunięciu, wyłączone regiony muszą przejść mitofagie, zapobiegając akumulacji dysfunkcyjnych organelli i białek6,9.
Mięśnie szkieletowe stanowią około 40% masy ciała i polegają na mitochondriach dla metabolizmu tlenowego i sygnalizacji komórkowej w celu utrzymania homeostazy10. W warunkach dysfunkcji mięśni szkieletowych, mechanizmy kontroli jakości mitochondriów są upośledzone10. Badania nad dysfunkcją mięśni zwykle mierzą oddychanie mitochondriów, objętość, morfologię i produkcję reaktywnych form tlenu (ROS), aby ocenić jakość mitochondriów3,10. Pod tym względem, podczas przewlekłej dysfunkcji mięśni, oddychanie mitochondriów jest zmniejszone, podczas gdy ROS są zwiększone, a sieci są fragmentalne3,10. Zakłócenia w morfologii mitochondriów powstają głównie z aktywacji białek fiksji mitochondriów, białka związanego z dynaminą 1 (DRP1) i fiksji mitochondriów 1 (FIS1)2,8,11. W odpowiedzi na atrofię mięśni, FIS1, znajdujący się na powierzchni zewnętrznej błony mitochondrialnej, rekrutuje DRP1 do oligomeryzacji z wieloma dimerami DRP1, aby stworzyć filament wokół mitochondriów, zmniejszając jego rozmiar aż do momentu, gdy dany odcinek mitochondriów jest “odrywany”, promując fragmentację3,11. Razem, nadmierna aktywność fiksji mitochondriów, zmniejszenie fuzji nowo powstałych mitochondriów i dysfunkcyjna mitofagia są odpowiedzialne za fragmentalny wygląd dysfunkcyjnych sieci mitochondriów, takich jak te opisane w nieaktywnym lub chorym mięśniu2,12.
Zwojowisko nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest miejscem pobudzenia mięśniowego. Potencjały czynnościowe inicjowane w somie propagują się wzdłuż aksonów, okrytych komórkami Schwanna mielinizującymi (SC), i kończą się na zwojowiskach nerwowo-mięśniowych, które są otoczony przez końcowe komórki Schwanna (tSC). Zwojowiska nerwowo-mięśniowe mogą odnowić się po uszkodzeniu. Jednak prawdopodobieństwo i szybkość regeneracji zmniejszają się w miarę wzrostu odległości między miejscem uszkodzenia a zwojowiskiem nerwowo-mięśniowym13,14. Po uszkodzeniu nerwu przez przecięcie, zgniecenie lub rozciągnięcie, SC dedyferencjuje się w stan progenitoropodobny bez mieliny15,16. Zdemolinizowane SC proliferują i pracują wspólnie z makrofagami, aby przekształcić środowisko lokalne dla regeneracji poprzez usuwanie gruzu między miejscem uszkodzenia a proksymalnym kończykiem aksonu przez zwyrodnienie Wallera17,18. Migrujące SC sygnalizują reakcję zapalną, która przekształca środowisko dla udanej regeneracji nerwu18. Regeneracja nerwu zachodzi wewnątrz osłonki nerwowej uformowanej przez progenitoropodobne SC, które tworzą pasma Bunger, przez które aksony odrastają1

<table><tbody><tr><td>3-in-1 Whole Animal System</td><td>Aurora Scientific, Ontario, Canada</td><td>1300A</td><td>System do badania funkcji mięśni z oprogramowaniem do analizy</td></tr><tr><td>AIVIA&nbsp;</td><td>Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA</td><td>15</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazów sterowanych AI</td></tr><tr><td>anti-laminin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>L9393-.2mL</td><td>Etykieta granicy miofibrili</td></tr><tr><td>B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J odmiana myszy</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, ME</td><td>JAX:005621</td><td>S100&beta;</td></tr><tr><td>Cryostar NX50 Cryostat</td><td>Epredia, Kalamazoo, MI, USA</td><td>https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50</td><td>Cryostat</td></tr><tr><td>D2.B10-DMDD2.mdx/J odmiana myszy</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, ME</td><td>JAX:13141</td><td>D2.mdx</td></tr><tr><td>DBA/2J odmiana myszy</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, ME</td><td>JAX:00671</td><td>WT</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA</td><td>BP231-100</td><td>Środek do odtworzenia barwnika mitochondrialnego</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Barwnik kwasów nukleinowych przenikający do komórek</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji&nbsp;</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>SCR_002285</td><td>Oprogramowanie do analizy 2D</td></tr><tr><td>Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA</td><td>P36941</td><td>Środek do mocowania</td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimberly-Clark, Irving, TX, USA</td><td>06-666A</td><td>Ręczniki laboratoryjne</td></tr><tr><td>Leica LAS_X software&nbsp;</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>SCR_013673</td><td>Oprogramowanie konfokalne</td></tr><tr><td>MitoView Fix 640</td><td>Biotium</td><td>70075-50ug</td><td>Barwnik mitochondrialny o długości fali dalekiej</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research software&nbsp;</td><td>Nikon, Melville, NY, USA</td><td>SCR_014329</td><td>Oprogramowanie do analizy przekroju poprzecznego</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA</td><td>#SP15-100</td><td>Ogólne środki montażowe</td></tr><tr><td>Prism 9 software&nbsp;</td><td>GraphPad Software, La Jolla, CA, USA</td><td>RRID: SCR_002798</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Rhodamine (TRITC)</td><td>Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA</td><td>AP132RMI</td><td>Przeciwciało wtórnego</td></tr><tr><td>Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C</td><td>Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>SZ61</td><td>Olympus, Breinigsville, PA, USA</td><td>sz61</td><td>Mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound&nbsp;</td><td>Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA</td><td>23-730-571</td><td>Środek do optymalnej temperatury cięcia</td></tr><tr><td>Visikol I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>H1-30</td><td>Roztwór do klarowania tkanek 1</td></tr><tr><td>Visikol II</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>H2-30</td><td>Roztwór do klarowania tkanek 2</td></tr><tr><td>&alpha;-bungarotoxin 552</td><td>Biotrend, Koln, Germany</td><td>00014</td><td>Barwnik receptora acetylocholinowy</td></tr></tbody></table>

metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach schwanna końcowych myszy

Methods for In situ Quantification of Mitochondrial Morphology in Muscle and Terminal Schwann Cells of Mice

Morfologia sieci mitochondria bywa szeroko stosowana jako wskaźnik zdrowia komórkowego; jednak ilościowa ocena struktury mitochondrialnej w całych tkankach pozostaje technicznie trudnym zadaniem. Komórki Schwanna końcowe (tSCs), które są niezbędne dla utrzymania i regeneracji złączy nerwowo-mięśniowych, są szczególnie trudne do analizy in situ ze względu na swoją anatomiczną lokalizację i wrażliwość na zakłócenia tkankowe. Protokół ten opisuje powtarzalne podejście do znakowaniu i ilościowej oceny trójwymiarowej morfologii sieci mitochondria w całym mięśniu szkieletowym i w tSCs u myszy za pomocą standardowej mikroskopii konfokalnej. Metoda wykorzystuje in vivo dostarczanie barwnika mitochondrialnego wrażliwego na potencjał błonowy, po którym następuje szybkie przetwarzanie tkanki i wysokiej rozdzielczości konfokalne obrazowanie. Zestawy obrazów są analizowane w celu ilościowej oceny łączności sieci mitochondria, powierzchni i fragmentacji. Protokół jest najpierw zweryfikowany w dystroficznym i zdrowym mięśniu szkieletowym, aby potwierdzić oczekiwane różnice w morfologii mitochondria i następnie jest dostosowany do wizualizacji i ilościowej oceny sieci mitochondria w tSCs zidentyfikowanych za pomocą reportera S100β u myszy. Takie podejście umożliwia analizę morfologii mitochondria w całych tkankach nerwowo-mięśniowych bez konieczności stosowania transgennych reporterów mitochondria czy wyspecjalizowanych platform obrazowania. Protokół wymaga tylko sprzętu powszechnie dostępnego w uczelnianych ośrodkach badawczych i może być dostosowany do innych cienkich lub powierzchownie dostępnych tkanek.

Sieciowe mitochondrium wykazywało oczekiwane zmniejszenie łączności 
Przedstawiono reprezentatywne 3D zdjęcia fluorescencyjne skanów konfokalnych mięśni TA w dwóch grupach, WT i mdx (Rycina 2). W porównaniu z grupą WT, łączność mitochondrialna wydaje się zmniejszona u myszy mdx w porównaniu z WT (Rycina 2A–D). U myszy mdx obserwowano większą liczbę małych fragmentów mitochondrialnych [<100 µm2] (WT, 17,3 ± 3,5%; ...

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Mitochondrial network morphology is widely used as an indicator of cellular health; however, quantifying mitochondrial architecture within intact tissues ...

Nasze badania po raz pierwszy badają morfologię mitochondriów komórek Schwanna końcowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym. Nasze podejście umożliwia ilościową analizę morfologii mitochondriów w trudno dostępnych tkankach, takich jak łożyska włosowatych i limfatyczne. Na początek uzyskaj mysz typu dzikiego i mysz D2-mdx.Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą odruchu z szczyptania palca, włóż igłę w kierunku prawego kolana w kierunku końcowego ścięgna. Wstrzyknij 50 mikrolitrów dwumikromolowego czerwonego fluorescującego barwnika mitochondrialnego na wewnętrzną ścięgno tylne, lub mięsień TA, podczas cofania igły wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia i inkubować barwnik in vivo przez jedną godzinę. Podczas utrzymywania zwierzęcia w znieczuleniu, użyj nożyczek i kleszczy, aby wydzielić i odizolować mięsień TA przed eutanazją.Umieść odizolowany mięsień TA w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oddzielaj włókna za pomocą techniki ciągnięcia. Dodaj barwnik kwasu nukleinowego przenikającego do komórek do 4% paraformaldehydu, aby uzyskać końcową koncentrację pięciu do 10 mikrogramów na mililitr do oznaczania jądra komórkowego.Następnie przemyj mięsień TA trzykrotnie w PBS przez pięć minut każdy, aby usunąć nadmiar barwnika. Odrywaj mięsień sekwencyjnie w 50% 75% i 100% etanolu przez pięć minut każdy. Następnie inkubować próbkę sekwencyjnie w roztworach wyjaśniających tkanki jeden i dwa przez 30 minut każdy, upewniając się, że są one w pełni zanurzone.Umieść mięsień na szkiełku okrywnym. Użyj 2,5 x 2 x 1 centymetrowego szklanego bloku o wadze 7,8 grama, aby delikatnie go spłaszczyć. Uzyskaj mysz S100 beta.Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą odruchu z szczyptania palca, wykonaj małe nacięcie skóry nad mięśniem pośladkowym większym, lub GM. Wstrzyknij 75 mikrolitrów dwumikromolowego czerwonego fluorescującego barwnika mitochondrialnego pod mięsień GM. Zamknij ranę i pozwól barwnikowi inkubować przez 45 minut, aby selektywnie oznaczać komórki Schwanna końcowe.Podczas utrzymywania zwierzęcia w znieczuleniu, wydziel mięsień GM w ciągu 10 minut i natychmiast umieść go w schłodzonej 0,9% sterylnej soli fizjologicznej. Tylko jeśli używane są myszy D2-mdx, dodaj fluorescencyjny barwnik receptora acetylocholiny w rozcieńczeniu 1:500 do kąpieli mikrodyssekcyjnej i inkubować tkankę przez 30 minut. Przytnij nadmiar tkanki tłuszczowej i łącznej i przenieś mięsień GM na szkiełko okrywne, układając go stroną brzuszną w dół dla mikroskopu odwróconego.Dodaj dwa mikrolitrów ogólnego medium montażowego na grzbietową powierzchnię GM i spłaszcz tkankę za pomocą bloku szklanego przed obrazowaniem. W oprogramowaniu ustaw długość fali wzbudzenia na 646 nanometrów. Po dodaniu dwóch kropli roztworu wyjaśniającego, wybierz obiektyw 63X, aby obrazować mięsień TA i ustaw głębokość stosu Z blisko 100 mikrometrów.Następnie wybierz tryb dekonwolucji i zastosuj zoptymalizowane parametry systemowe. Ustaw wielkość kroku na jeden mikrometr i zdobądź obrazy. Aby uzyskać obrazy komórek Schwanna końcowych, wybierz obiektyw 20-krotnego powiększenia, ustaw głębokość stosu Z na około 17 mikrometrów i zdobądź obrazy.Następnie wybierz obiektyw 63-krotnego powiększenia i zdobądź obrazy pojedynczych komórek Schwanna końcowych. Importuj pojedyncze warstwy Z, aby wytrenować oprogramowanie do rozpoznawania sygnału mitochondrialnego. Przeprowadź analizę ilościową za pomocą oprogramowania sterowanego przez sztuczną inteligencję.Opracuj maski obrazów do przeglądu przez badaczy. Oddziel 3D stoki obrazów na pojedyncze sekcje optyczne po optymalizacji algorytmu. Wybierz co piątą warstwę Z z każdego 3D obrazu i oblicz średnią na próbkę.Sstandardyzuj parametry obrazowania na wszystkich próbkach i ilościowo określ morfologię mitochondrialną. Przeprowadź immunohistochemiczną analizę i analizę statystyczną, aby ocenić różnice między grupami i korelacje. Łączność mitochondrialna była zmniejszona w mięśniach mdx w porównaniu z myszami typu dzikiego.Większa liczba małych fragmentów mitochondrialnych i zmniejszona liczba dużych połączonych sieci mitochondrialnych została zaobserwowana u myszy mdx. U myszy typu dzikiego mitochondria w komórkach Schwanna końcowych wykazywały połączone struktury pętli w pobliżu rozgałęzień. W przeciwieństwie do myszy mdx, mitochondria wyglądały fragmentowane i brakowało im formacji pętli w pobliżu rozgałęzień.Konfokalna i elektronowa mikroskopowa analizy potwierdziły podobne struktury mitochondrialne w kształcie pączka w komórkach Schwanna końcowych. Analiza postsynaptyczna wykazała mitochondrialne klastry zgromadzające się wokół receptorów acetylocholiny, pozbawione charakterystycznej struktury podobnej do słodkiego pączka. Analiza obrazów wykazała, że mitochondrialne komórki Schwanna końcowe w mięśniach mdx wykazywały zwiększoną powierzchnię i fragmentację w porównaniu z mięśniami typu dzikiego, bez ró

methods-for-situ-quantification-mitochondrial-morphology-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Poznaj metodę ilościowej oceny morfologii mitochondriów in situ w mięśniach szkieletowych i komórkach Schwanna końcowych myszy. Technika wykorzystuje barwnik wrażliwy na potencjał błonowy i mikroskopię konfokalną do analizy sieci mitochondrialnych w nienaruszonych tkankach neuromięśniowych.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Przeglądaj więcej filmów