Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy
10 kwietnia 2026
Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.
Nasze badania po raz pierwszy badają morfologię mitochondriów komórek Schwanna końcowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym. Nasze podejście umożliwia ilościową analizę morfologii mitochondriów w trudno dostępnych tkankach, takich jak łożyska włosowatych i limfatyczne. Na początek uzyskaj mysz typu dzikiego i mysz D2-mdx.
Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą odruchu z szczyptania palca, włóż igłę w kierunku prawego kolana w kierunku końcowego ścięgna. Wstrzyknij 50 mikrolitrów dwumikromolowego czerwonego fluorescującego barwnika mitochondrialnego na wewnętrzną ścięgno tylne, lub mięsień TA, podczas cofania igły wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia i inkubować barwnik in vivo przez jedną godzinę. Podczas utrzymywania zwierzęcia w znieczuleniu, użyj nożyczek i kleszczy, aby wydzielić i odizolować mięsień TA przed eutanazją.
Umieść odizolowany mięsień TA w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oddzielaj włókna za pomocą techniki ciągnięcia. Dodaj barwnik kwasu nukleinowego przenikającego do komórek do 4% paraformaldehydu, aby uzyskać końcową koncentrację pięciu do 10 mikrogramów na mililitr do oznaczania jądra komórkowego.
Następnie przemyj mięsień TA trzykrotnie w PBS przez pięć minut każdy, aby usunąć nadmiar barwnika. Odrywaj mięsień sekwencyjnie w 50% 75% i 100% etanolu przez pięć minut każdy. Następnie inkubować próbkę sekwencyjnie w roztworach wyjaśniających tkanki jeden i dwa przez 30 minut każdy, upewniając się, że są one w pełni zanurzone.
Umieść mięsień na szkiełku okrywnym. Użyj 2,5 x 2 x 1 centymetrowego szklanego bloku o wadze 7,8 grama, aby delikatnie go spłaszczyć. Uzyskaj mysz S100 beta.
Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą odruchu z szczyptania palca, wykonaj małe nacięcie skóry nad mięśniem pośladkowym większym, lub GM. Wstrzyknij 75 mikrolitrów dwumikromolowego czerwonego fluorescującego barwnika mitochondrialnego pod mięsień GM. Zamknij ranę i pozwól barwnikowi inkubować przez 45 minut, aby selektywnie oznaczać komórki Schwanna końcowe.
Podczas utrzymywania zwierzęcia w znieczuleniu, wydziel mięsień GM w ciągu 10 minut i natychmiast umieść go w schłodzonej 0,9% sterylnej soli fizjologicznej. Tylko jeśli używane są myszy D2-mdx, dodaj fluorescencyjny barwnik receptora acetylocholiny w rozcieńczeniu 1:500 do kąpieli mikrodyssekcyjnej i inkubować tkankę przez 30 minut. Przytnij nadmiar tkanki tłuszczowej i łącznej i przenieś mięsień GM na szkiełko okrywne, układając go stroną brzuszną w dół dla mikroskopu odwróconego.
Dodaj dwa mikrolitrów ogólnego medium montażowego na grzbietową powierzchnię GM i spłaszcz tkankę za pomocą bloku szklanego przed obrazowaniem. W oprogramowaniu ustaw długość fali wzbudzenia na 646 nanometrów. Po dodaniu dwóch kropli roztworu wyjaśniającego, wybierz obiektyw 63X, aby obrazować mięsień TA i ustaw głębokość stosu Z blisko 100 mikrometrów.
Następnie wybierz tryb dekonwolucji i zastosuj zoptymalizowane parametry systemowe. Ustaw wielkość kroku na jeden mikrometr i zdobądź obrazy. Aby uzyskać obrazy komórek Schwanna końcowych, wybierz obiektyw 20-krotnego powiększenia, ustaw głębokość stosu Z na około 17 mikrometrów i zdobądź obrazy.
Następnie wybierz obiektyw 63-krotnego powiększenia i zdobądź obrazy pojedynczych komórek Schwanna końcowych. Importuj pojedyncze warstwy Z, aby wytrenować oprogramowanie do rozpoznawania sygnału mitochondrialnego. Przeprowadź analizę ilościową za pomocą oprogramowania sterowanego przez sztuczną inteligencję.
Opracuj maski obrazów do przeglądu przez badaczy. Oddziel 3D stoki obrazów na pojedyncze sekcje optyczne po optymalizacji algorytmu. Wybierz co piątą warstwę Z z każdego 3D obrazu i oblicz średnią na próbkę.
Sstandardyzuj parametry obrazowania na wszystkich próbkach i ilościowo określ morfologię mitochondrialną. Przeprowadź immunohistochemiczną analizę i analizę statystyczną, aby ocenić różnice między grupami i korelacje. Łączność mitochondrialna była zmniejszona w mięśniach mdx w porównaniu z myszami typu dzikiego.
Większa liczba małych fragmentów mitochondrialnych i zmniejszona liczba dużych połączonych sieci mitochondrialnych została zaobserwowana u myszy mdx. U myszy typu dzikiego mitochondria w komórkach Schwanna końcowych wykazywały połączone struktury pętli w pobliżu rozgałęzień. W przeciwieństwie do myszy mdx, mitochondria wyglądały fragmentowane i brakowało im formacji pętli w pobliżu rozgałęzień.
Konfokalna i elektronowa mikroskopowa analizy potwierdziły podobne struktury mitochondrialne w kształcie pączka w komórkach Schwanna końcowych. Analiza postsynaptyczna wykazała mitochondrialne klastry zgromadzające się wokół receptorów acetylocholiny, pozbawione charakterystycznej struktury podobnej do słodkiego pączka. Analiza obrazów wykazała, że mitochondrialne komórki Schwanna końcowe w mięśniach mdx wykazywały zwiększoną powierzchnię i fragmentację w porównaniu z mięśniami typu dzikiego, bez ró
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
