Name: Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ludzkiej tkanki maziowej ex vivo o zachowanej architekturze. System JSAS umożliwia badanie odpowiedzi zapalnych na różne bodźce w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy protokół nie byłby możliwy bez hojności pacjentów, którzy przekazali swój tkankę oraz umiejętności naszych kolegów z dziedziny chirurgii ortopedycznej, którzy są skłonni bezpiecznie pozyskiwać tkanki w imieniu prowadzonych badań. K.I.C. jest wspierany przez NIAMS K08 AR084605, a C.P.P. jest wspierany przez Program Rozwoju Kariery Departamentu Weteranów [IK2BX004532]. Grupa ta z okazji wykorzystania University of Iowa Central Microscopy Research Facility, zasobu wspólnego wspartego przez Wiceprezesa ds. Badań Uniwersytetu w Iowa oraz Carver College of Medicine. Dane cytometrii przepływowej zostały uzyskane w Zakładzie Cytometrii Przepływowej, który jest zasobem wspólnym Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Iowa. Zakład jest finansowany przez opłaty użytkowników oraz hojne wsparcie finansowe Carver College of Medicine, Holden Comprehensive Cancer Center oraz Iowa City Veteran’s Administration Medical Center. Badania przedstawione w niniejszej publikacji były wspierane przez: Narodowe Centrum Zasobów Badawczych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Nagrody Numer 1 S10 OD034193-01; oraz Narodowy Instytut Raka Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Nagrody Numer P30CA086862.

Zgoda pacjenta i protokół przetwarzania tkanek zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyczną (IRB). Stosowanie reagentów i sprzętu wymieniono w Tabeli Materiałów.
1. Zdobywanie tkanek i biopsja
<ol>
	<li>Identyfikuj pacjentów przedoperacyjnie na podstawie harmonogramu chirurga. Rekrutuj pacjentów w wieku 18-65 lat, którzy poddają się otwartej operacji stawu, takiej jak całkowita endoproteza stawu kolanowego (TKA) lub Osteotomia Guzka Piszczelowego (TTO, znana również jako Fulkerson), i którzy nie przyjmują systemowych leków immunomodulujących. 
	UWAGA: Najlepiej wykluczyć pacjentów, którzy przeszli więcej niż jedną artroskopię lub więcej niż jedno wstrzyknięcie glikokortykoidów, ponieważ u tych pacjentów wystąpiło wyższe ryzyko niepowodzenia pozyskania tkanek w trakcie operacji niż w innych populacjach z powodu zwłóknienia. Ze względu na ryzyko przeniesienia infekcji, odroczono rekrutacje pacjentów z historią wirusowego zapalenia wątroby typu C lub ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chyba że jest to istotne dla wyników. Zawsze przestrzegać bezpiecznych praktyk obsługi świeżej tkanki ludzkiej, niezależnie od statusu choroby zakaźnej.</li>
	<li>Chirurgowie ortopedyczni wykonują artrotomię i dysekcję jako część standardowej procedury operacyjnej. Zidentyfikuj przednie błonę maziową bezpośrednio powyżej rowka rzepkowego i użyj elektrokauteri do ekscyzji błony maziowej en bloc, unikając dysekcji mięśnia articularis genu lub w pobliżu przyśrodkowego i bocznego epikondyli. Synowektomia jest stosunkowo neutralna dla wyników TKA i w przypadku stanów zapalnych może być korzystna9,10. Przekaż sterylnie błonę maziową członkowi zespołu badawczego i umieść ją w sterylnym pojemniku z zimnym buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) na lodzie. 
	UWAGA: Zakończ pozyskiwanie tkanek, jeśli zespół chirurgiczny zauważy anomalie lub jeśli synowektomia uniemożliwiłaby zamknięcie lub wynik chirurgiczny. Te ostatnie szczególnie byłyby niezwykle rzadkie w przypadku TKA, ponieważ ekscyzja błony maziowej może być wykorzystana jako ekstensywna procedura do rozluźnienia ciasnych stawów. Ilość ekscyzji zależy od wielkości eksperymentu. Możliwe jest uzyskanie około czterech 3 mm rdzeni biopsji na 1 cm2 tkanki. W wielu przypadkach możliwe jest uzyskanie 24 cm2 lub więcej tkanki. Masa tkanki jest zależna od chirurgicznej dysekcji, dlatego nie jest tak wiarygodna jak powierzchnia do określenia adekwatności dla eksperymentu. Rysunek 1 przedstawia kroki 1.2-1.7.</li>
	<li>Przenieś błonę maziową do laboratorium i przemyj dwa razy w zimnym DPBS przez 10 min na ruszcie płytowym.</li>
	<li>Przeniesiono błonę maziową do 10 cm lub większej sterylnej kasetki Petriego pod sterylnymi warunkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego certyfikowanej na poziomie 2 (BSL2). Dodaj zimny, sterylny, niskoglukozowy środek DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z pirowainianem sodu i L-glutaminą, wystarczającą ilość, aby wypełnić połowę kasetki. Zidentyfikuj podstawę synowialną przez perłowy warstwę IntL (Rysunek 2A), w przeciwieństwie do strony kauteryzowanej (Rysunek 2B). 
	UWAGA: IntL jest krucha. Uważaj, aby jej nie ściągać, ponieważ wtedy oderwie się od podstaw (Rysunek 2A, uchwycona przez kleszcze). Perłowość może być zmieniona przez wcześniejsze krwotoki do stawu (wyglądające żółto-pomarańczowo z powodu hemosyderozy), wysokie BMI (pokryte tkanką tłuszczową) lub stany zapalne (czerwone, kruchość i kosmkowate). Absolutnie konieczne jest poprawne zidentyfikowanie IntL przed dalszym postępowaniem. Ostrożnie sprawdź oznaki ekscyzji chirurgicznej, kauteryzacji, krwawienia i krzepnięcia, aby ustalić, czy kolejne kroki nie następują na IntL.</li>
	<li>Zdysekują dodatkowe tkanki tłuszczowej i stromalnej na kauteryzowanej stronie, aby odizolować błonę maziową, zachowując głębokość tkanki około 4-5 mm we wszystkich obszarach. Do dysekcji można używać nożyczek Iris lub skalpeli według osobistych preferencji. Zmieniaj środek w kasetce Petriego w miarę potrzeby, aby zachować pole widzenia. 
	UWAGA: Tkanka stromalna lub tłuszczowa tylnej strony łatwo się wycina. Jednak trudności z dysekcją lub duże opory wskazują na zachowanie więzadła, metaplazję tkanki, taką jak niewłaściwe odkładanie się chrząstki, lub przecięcie IntL.</li>
	<li>Po dysekcji na odpowiednią głębokość, uzyskuj 3 mm rdzenie biopsji według potrzeby, aby uzyskać co najmniej 2 replikaty techniczne na każdą przebadana warunków. Wykonuj z warstwa synowialna skierowana w stronę narzędzia do wycinania rdzeni, a nie przeciwko powierzchni kasetki Petriego. Jakościowy rdzeń można używać około 10-15 razy przed wymianą z powodu stępienia, ponieważ stępiony rdzeń może uszkodzić strukturę warstwy intymalnej. 
	<ol>
		<

Nie ma żadnych konfliktów interesów.

To prace wykazały możliwości JSAS, szczególnie utrzymanie żyjącej tkanki maziowej z zachowaną, funkcjonalnie odpowiedzialną architekturą maziową. Minimalna śmierć komórek występowała do 72 h kultury w większości warunków inkubacji. Aby ocenić mikroskopowe zmiany struktury maziowej, opisano unikalny system pomiaru histologicznego, który ilościowo określał zmiany strukturalne IntL i SubL. Takie zmiany są wskaźnikami ostrej lub ostrej przewlekłej maziowica. Ta ilościowa ocena może być szczególnie przydatna, jeśli jest sparo...

Artretyzm dotyczy ponad 20% wszystkich dorosłych w USA i 50% osób w wieku powyżej 65 lat z przewlekłymi chorobami1. Jest również jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na całym świecie2. Artretyzm obejmuje nie tylko uszkodzenia chrząstki, ale także stan zapalny torebki stawowej lub błony maziowej (np. zapalenie błony maziowej). Przewlekłe zapalenie błony maziowej jest prawdopodobnie głównym źródłem prozapalnych cytokin, które nasilają uszkodzenia kości i chrząstki w artretyzmie zwyrodnieniowym i reumatoidalnym3,4. Dlatego zrozumienie zmian immunologicznych w obrębie błony maziowej jest prawdopodobnie kluczowe dla opracowania nowych opcji terapeutycznych, a być może również prewencyjnych, dla pacjentów z artretyzmem.
Błona maziowa to zorganizowana struktura składająca się z dwóch głównych warstw: warstwy śródbłonka komórkowego (IntL) i podstawowej warstwy podśluzówkowej (SubL). IntL współpracuje z płynem stawowym (SF), a SubL produkuje komponenty SF i zawiera struktury naczyniowe5. Wewnątrz IntL znajdują się makrofagi i komórki przypominające fibroblasty (FLS). Makrofagi IntL to komórki rezydujące, odnawiane lokalnie przez makrofagi interstycjalne w SubL6. Te rezydujące makrofagi błony maziowej (RSM) są nakłonione do M2 poprzez ekspresję CD206 i TREM2, epitelizowane i wyrażają markery szczelnych złączy. Ta podstruktura IntL może być kluczową dla funkcjonalnego i fizycznego utrzymania homeostazy przestrzeni stawowej5,6. Zjawisko to zostało zaobserwowane w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA). Na przykład, gdy IntL ulega zniszczeniu, pacjenci z reumatoidalnym zapaleniem stawów doświadczają objawów zaostrzenia, które ustępują, gdy wyściółka odbudowuje się6,7. Spontaniczne remisje RA są ściśle związane z synowialnymi makrofagami MerTK +CD206+7. RSM zostały również zidentyfikowane w płynie stawowym pacjentów z ostrym bólem stawów, stwierdzając, że ciężkość choroby zakaźnej lub zapalnej koreluje z ilością RSM i cytokin zapalnych8. Niestety, związek między strukturami IntL i SubL, funkcjonalnymi zmianami RSM i FLS oraz produkcją czynników zapalnych, które mogą prowadzić do uszkodzenia chrząstki i/lub kości, jest trudny do zbadania, szczególnie u ludzi.
Aby zbadać podstawowe mechanizmy zapalenia błony maziowej w wielu klinicznie istotnych sytuacjach, stworzono ludzki model ex vivo zwany Systemem Analizy Przestrzeni Stawowej (JSAS). System ten daje wyniki możliwe do odtworzenia z modułowymi elementami, aby umożliwić szeroką ocenę zapalnego i zakaźnego artretyzmu. W tym artykule opisano procesy pozyskiwania tkanek z typowych otwartych zabiegów stawów, takich jak całkowita wymiana stawu, projekt JSAS, histomorphometrię niezbędną do ilościowej oceny ostrych zmian strukturalnych w błonie maziowej oraz funkcjonalne reakcje tkanki, w tym przez immunofluorescencję (IF), RNAscope oraz enzymatyczne testy immunosorbentowe (ELISA). JSAS różni się od typowych ludzkich modeli in vitro poprzez utrzymanie struktur IntL i SubL, co pozwala na wgląd w stanie in vivo w ostrym lub ostrym na przewlekłym zapaleniu błony maziowej, które prowadzą do uszkodzenia chrząstki. Dzięki utrzymaniu natywnej struktury błony maziowej, możliwe jest rozdzielenie właściwości RSM i FLS do gaszenia lub utrzymywania stanu zapalnego. Jako model ex vivo, nie wymaga on różnicowania komórek odpornościowych obwodowych w makrofagi błony maziowej ani upraszczania błony maziowej tylko do 1-2 dyskretnych typów komórek. Różni się od modeli zwierzęcych, takich jak indukowany kolagenem artretyzm (CIA), ponieważ używa naturalnie chorych tkanek ludzkich, co pozwala na ocenę specyficzną dla patogenu, istotną dla ludzi. Wreszcie, można symulować wiele infekcji, co pozwala na model sepsy stawowej oprócz artretyzmu zwyrodnieniowego i zapalnego. Główną ograniczeniem jest 3-dniowa kultura w standardowych warunkach przed wystąpieniem apoptozy.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope probe</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicals</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol (for sterilization)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borrelia burgdorferi</td><td>ATCC</td><td>35210&nbsp;</td><td>must be utilized in the late exponential phase for maximum pathogenicity</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO2 tank (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>Heat inactivated Lot: F22100</td></tr><tr><td>forceps (non-toothed)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified cell incubator (standard conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia incubator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9 antibody</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Monocyte chemoattractant protein 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Must be made fresh for each experiment and buffered in equimolar sodium bicarbonate to a pH of 7-7.4</td></tr><tr><td>OPG ELISA</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Oxygen tank with liter per minute flow regulator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN antibody</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope multiplex fluorescent V2 assay</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 dilution</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA 300 MRSA</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10,000X stock</td></tr><tr><td>TNF antibody</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>transwell inserts - 0.4 um size</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>transwell inserts - 5 um size</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

Artretyzm to stan zapalny w stawach powodujący uszkodzenie chrząstki, ból i utratę ruchomości. Ostatnie osiągnięcia w badaniach nad artretyzmem pokazują szczególnie, że torebka stawowa (np. błona maziowa) jest ważnym źródłem tego zapalenia, ale nie ma ludzkich modeli, które replikują istotną architekturę błony maziowej. Aby temu zaradzić, stworzono System Analizy Przestrzeni Stawowej, czyli JSAS. Przednia błona maziowa była pobierana w czasie operacji od pacjentów poddawanych całkowitej zamianie stawu kolanowego (TKA). Błonę maziową rozcięto i przecięto na 3 mm rdzenie biopsji. Rdzenie umieszczono w górnym dołku 5 µm lub 0,4 µm przepuszczalnej przegrody z 300 µl DMEM z 10% FBS. W dolnym dołku dodano 600 µl medium i wymieniano je co 2-3 dni. Wyżywalność oceniano przez 7 dni w warunkach inkubacji hiperoksycznej (50%), atmosferycznej/standardowej (~21%) i fizjologicznej (5%). Stymulatory w dolnym dołku obejmowały czynnik chemotaktyczny dla monocytów 1 (MCP-1/CCL2), lipopolisacharyd (LPS), N-acetylocysteinę, S. aureus oraz B. burgdorferi. Medium przechowywano do analizy ELISA, a tkankę przechowywano do analizy w preparacie parafinowym po fiksacji w formalinie (FFPE). W warunkach standardowych błona maziowa pozostawała w pełni żywotna przez 3 dni. Stymulatory modyfikowały strukturę i funkcję komórek błony maziowej, obejmując granicę makrofagów rezydentów, ekspansję podstawną, nadregulację patogennych fibroblastów oraz produkcję cytokin IL-1β i TNFα. Komórki odpornościowe i fibroblasty migrowały do dolnej komory (pory 5 µm) zgodnie z analizą cytometrii przepływowej. Mobilne B. burgdorferi migrowały do tkanki na rozmiarze porów 0,4 µm, podczas gdy nieruchome S. aureus nie migrowały. Odpowiednie cytokiny były wyrażane w wystarczającej ilości do analizy ELISA. JSAS to modułowy system umożliwiający badanie ostrych zmian w ludzkiej błonie maziowej, pozwalający na złożoność struktur 3D w modelu przedklinicznym, przy zachowaniu biologicznie istotnej struktury i funkcji.

Optymalizacja warunków kultury tlenu
Fizjologiczna perfuzja tkanki wynosi około 6%-8% tlenu, podczas gdy standardowe warunki inkubacji dla kultury komórek są na poziomie tlenowym atmosferycznym (około 21%)16. Porównując, hiperoksygenacja może poprawić żywotność kultury komórek lub być toksyczna17. Odpowiednie wykorzystanie JSAS wymagało wczesnego określenia żywotności tkanki maziowej; dlatego apoptozę oceniono za pomocą immunohis...

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Arthritis is an inflammatory state within joints resulting in cartilage damage, pain, and loss of mobility. Recent advances in arthritis research ...

Głównymi pytaniami, które chcemy odpowiedzieć, są: jaka jest natywna odpowiedź immunologiczna błony maziowej na czynniki zakaźne i zapalne oraz jak to znajduje odzwierciedlenie w zmianach struktury błony maziowej? Moje główne kliniczne i badawcze zainteresowania koncentrują się na leczeniu pacjentów z ciężką otyłością z zaawansowaną chorobą reumatoidalną. Często w tej populacji pacjentów leczenie medyczne jest zaniedbywane ze względu na trudności w znalezieniu chirurgicznych opcji leczenia ich choroby.Aby rozpocząć, wykonaj artrotomię i dysekcję w sali operacyjnej. Stosuj standardowe przybliżenie parapatellarne i wykonaj bardziej rozległą ekspozycję podczas operacji na pacjencie z ciężką otyłością i zaawansowaną chorobą zwyrodnieniową stawów. Zidentyfikuj przednią błonę maziową i użyj elektrokauteryzacji do przecięcia tkanki.Obserwuj kolano pod kątem objawów zapalenia, ponieważ pacjenci z otyłością mogą wykazywać lokalną reakcję zapalną, która koreluje z szerszymi efektami zapalnymi otyłości. Przekaż błonę maziową członkowi zespołu badawczego w sterylny sposób. Umieść pojemnik na próbki wypełniony zimnym buforem Dulbecco's PBS lub DPBS na lodzie i przenieś ludzką przednią tkankę maziową uzyskany podczas endoprotezy kolanowej do pojemnika.Przepłucz tkankę dwa razy w zimnym DPBS przez 10 minut na płytce rockerowej. Następnie przenieś błonę maziową do 10-centymetrowej lub większej sterylnej miski Petriego pod szafką bezpieczeństwa Biosafety Level 2. Dodaj zimny sterylny DMEM z niskim glukozą i zawartością sodu pirognanowego oraz L-glutaminy, aby wypełnić miskę w połowie.Zidentyfikuj wyściółkę maziową przez perłową warstwę śródbłonka bez jej ściągania. Ułóż wymagane narzędzia, aby uzyskać trzymilimetrowe rdzenie biopsji dla co najmniej dwóch powtórzeń technicznych. Używając szczypiec irisowych lub skalpela, przeciąć nadmierną tkankę tłuszczową i stromę od strony kauteryzowanej, aby odizolować błonę maziową, utrzymując głębokość tkanki na poziomie około czterech do pięciu milimetrów przez cały czas.Zmień medium w misce Petriego w razie potrzeby, aby zachować pole widzenia. Umieść tkankę tak, aby wyściółka maziowa była skierowana w stronę narzędzia do wycinania. Ustabilizuj tkankę niedominującą ręką za pomocą szczypiec lub kleszczyków i wyciągnij rdzeń tkanki, stosując mocne prostopadłe ciśnienie z delikatnym skręcaniem.Wymień sztylecik po około 10 do 15 zastosowaniach lub gdy tkanina skręca się podczas wycinania, aby uniknąć uszkodzenia struktury wyściółki śródbłonkowej. Otwórz drugą miskę Petriego i napełnij ją pięcioma do dziesięciu mililitrów medium zawierającego 10%FBS osłaniającego w 37 stopniach Celsjusza. Za pomocą płaskich lub bezzębnych szczypiec przenieś rdzenie do miski i delikatnie mieszaj przez jedną do dwóch sekund, aby zmyć gruz bez mocnego ściskania.Aby przygotować dolne gniazdo systemu analizy przestrzeni stawowej, dodaj 600 mikrolitrów DMEM z niskim glukozą i zawartością 10%FBS osłaniającego w 37 stopniach Celsjusza. Dodaj kontrolę pojazdu lub lek leczniczy według wyboru, takie jak LPS lub MCP-1, do dolnego gniazda. Wybierz rozmiar porów transwell na podstawie pożądanego wyniku eksperymentu i dodaj 300 mikrolitrów DMEM z niskim glukozą i zawartością 10%FBS do transwellu.Używając sterylnych szczypiec, delikatnie przenieś pojedyncze rdzenie tkankowe do medium transwellu, unikając rdzeni postrzępianych i unoszących się. Następnie umieść zespół w inkubatorze w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenku węgla na osiem do 72 godzin w zależności od wykonywanych dalszych analiz. Zfiksuj tkankę maziową w 10% neutralnym buforowanym formalinie.Następnie osadz i przekroj ją na potrzeby analizy histologicznej. Po zabarwieniu hematoxyliną i eozyną zarejestruj sekcje tkankowe w 10X i 40X za pomocą mikroskopu jasnolądowego. Użyj Photoshopu, aby zarysować wyściółkę śródbłonkową i obszary podwyściółkowe na obrazie TIFF 40X, maskując niedocelowe obszary, erytrocyty i duże naczynia krwionośne dla późniejszej analizy ilościowej.Analizuj ostateczne maski w celu określenia grubości, integralności i komórkowości wyściółki śródbłonkowej i podwyściółkowej. Na koniec oceń migrujące komórki za pomocą cytometrii przepływowej, a czynniki rozpuszczalne w zebranym medium za pomocą enzymatycznego testu immunosorbentowego. Tkanka maziowa hodowana z rosnącymi dawkami MCP-1 lub LPS wykazywała wyraźne zmiany w morfologii wyściółki śródbłonkowej, w tym delikatną wyściółkę śródbłonkową i pogrubioną wyściółkę śródbłonkową o zmniejszonej gęstości komórkowej w porównaniu do kontroli.Leczenie MCP-1 i LPS zmieniło odpowiedź cytokinową maziówki. MCP-1 indukowało patogenny marker fibroblastów podoplaninę w podwyściółku, podczas gdy LPS zwiększyło podoplaninę zarówno w wyściółce śródbło

a-pre-clinical-model-synovitis-using-ex-vivo-human-synovial-tissue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację i hodowlę eksplantatów chrząstek z kolan bydlęcych. Metoda ta stanowi łatwe i przystępne narzędzie do opisywania zmian w tkankach w odpowiedzi na bodźce biologiczne lub nowatorskie terapie ukierunkowane na staw.

Model hodowli tkankowej ex vivo przebudowy chrząstki w eksplantatach bydlęcego kolana

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Udostępniamy szczegółowe metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, które są używane do rekapitulacji chrząstki, kości, poduszeczki tłuszczowej i błony maziowej w ludzkim stawie kolanowym. Te cztery tkanki są zintegrowane z dostosowanym bioreaktorem i połączone za pomocą mikrofluidyki, tworząc w ten sposób staw kolanowy na chipie.

Stworzenie stawu kolanowego na chipie do modelowania chorób stawów i testowania leków

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.

Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Tutaj przedstawiamy protokół ustanawiający mysi model reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4+ od myszy SKG, dostarczając szybkiego i niezawodnego narzędzia eksperymentalnego do badania mechanizmów immunologicznych, patologicznego postępu i rozwoju nowych metod leczenia RZS.

Adoptywny model transferowy reumatoidalnego zapalenia stawów u myszy

W niniejszym artykule opisujemy chirurgiczną metodę transekcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jako wiarygodny model wywoływania choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u gryzoni oraz metody pobierania płynu maziowego kolana, pomiaru obrzęku kolana i oceny ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów.

Przecięcie więzadła krzyżowego przedniego i płukanie płynu maziowego w modelu gryzoni w celu zbadania zapalenia stawów i pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Poznaj model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ludzkiej tkanki maziowej ex vivo o zachowanej architekturze. System JSAS umożliwia badanie odpowiedzi zapalnych na różne bodźce w kontrolowanych warunkach.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Przeglądaj więcej filmów