Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze
20 marca 2026
Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.
Głównymi pytaniami, które chcemy odpowiedzieć, są: jaka jest natywna odpowiedź immunologiczna błony maziowej na czynniki zakaźne i zapalne oraz jak to znajduje odzwierciedlenie w zmianach struktury błony maziowej? Moje główne kliniczne i badawcze zainteresowania koncentrują się na leczeniu pacjentów z ciężką otyłością z zaawansowaną chorobą reumatoidalną. Często w tej populacji pacjentów leczenie medyczne jest zaniedbywane ze względu na trudności w znalezieniu chirurgicznych opcji leczenia ich choroby.
Aby rozpocząć, wykonaj artrotomię i dysekcję w sali operacyjnej. Stosuj standardowe przybliżenie parapatellarne i wykonaj bardziej rozległą ekspozycję podczas operacji na pacjencie z ciężką otyłością i zaawansowaną chorobą zwyrodnieniową stawów. Zidentyfikuj przednią błonę maziową i użyj elektrokauteryzacji do przecięcia tkanki.
Obserwuj kolano pod kątem objawów zapalenia, ponieważ pacjenci z otyłością mogą wykazywać lokalną reakcję zapalną, która koreluje z szerszymi efektami zapalnymi otyłości. Przekaż błonę maziową członkowi zespołu badawczego w sterylny sposób. Umieść pojemnik na próbki wypełniony zimnym buforem Dulbecco's PBS lub DPBS na lodzie i przenieś ludzką przednią tkankę maziową uzyskany podczas endoprotezy kolanowej do pojemnika.
Przepłucz tkankę dwa razy w zimnym DPBS przez 10 minut na płytce rockerowej. Następnie przenieś błonę maziową do 10-centymetrowej lub większej sterylnej miski Petriego pod szafką bezpieczeństwa Biosafety Level 2. Dodaj zimny sterylny DMEM z niskim glukozą i zawartością sodu pirognanowego oraz L-glutaminy, aby wypełnić miskę w połowie.
Zidentyfikuj wyściółkę maziową przez perłową warstwę śródbłonka bez jej ściągania. Ułóż wymagane narzędzia, aby uzyskać trzymilimetrowe rdzenie biopsji dla co najmniej dwóch powtórzeń technicznych. Używając szczypiec irisowych lub skalpela, przeciąć nadmierną tkankę tłuszczową i stromę od strony kauteryzowanej, aby odizolować błonę maziową, utrzymując głębokość tkanki na poziomie około czterech do pięciu milimetrów przez cały czas.
Zmień medium w misce Petriego w razie potrzeby, aby zachować pole widzenia. Umieść tkankę tak, aby wyściółka maziowa była skierowana w stronę narzędzia do wycinania. Ustabilizuj tkankę niedominującą ręką za pomocą szczypiec lub kleszczyków i wyciągnij rdzeń tkanki, stosując mocne prostopadłe ciśnienie z delikatnym skręcaniem.
Wymień sztylecik po około 10 do 15 zastosowaniach lub gdy tkanina skręca się podczas wycinania, aby uniknąć uszkodzenia struktury wyściółki śródbłonkowej. Otwórz drugą miskę Petriego i napełnij ją pięcioma do dziesięciu mililitrów medium zawierającego 10%FBS osłaniającego w 37 stopniach Celsjusza. Za pomocą płaskich lub bezzębnych szczypiec przenieś rdzenie do miski i delikatnie mieszaj przez jedną do dwóch sekund, aby zmyć gruz bez mocnego ściskania.
Aby przygotować dolne gniazdo systemu analizy przestrzeni stawowej, dodaj 600 mikrolitrów DMEM z niskim glukozą i zawartością 10%FBS osłaniającego w 37 stopniach Celsjusza. Dodaj kontrolę pojazdu lub lek leczniczy według wyboru, takie jak LPS lub MCP-1, do dolnego gniazda. Wybierz rozmiar porów transwell na podstawie pożądanego wyniku eksperymentu i dodaj 300 mikrolitrów DMEM z niskim glukozą i zawartością 10%FBS do transwellu.
Używając sterylnych szczypiec, delikatnie przenieś pojedyncze rdzenie tkankowe do medium transwellu, unikając rdzeni postrzępianych i unoszących się. Następnie umieść zespół w inkubatorze w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenku węgla na osiem do 72 godzin w zależności od wykonywanych dalszych analiz. Zfiksuj tkankę maziową w 10% neutralnym buforowanym formalinie.
Następnie osadz i przekroj ją na potrzeby analizy histologicznej. Po zabarwieniu hematoxyliną i eozyną zarejestruj sekcje tkankowe w 10X i 40X za pomocą mikroskopu jasnolądowego. Użyj Photoshopu, aby zarysować wyściółkę śródbłonkową i obszary podwyściółkowe na obrazie TIFF 40X, maskując niedocelowe obszary, erytrocyty i duże naczynia krwionośne dla późniejszej analizy ilościowej.
Analizuj ostateczne maski w celu określenia grubości, integralności i komórkowości wyściółki śródbłonkowej i podwyściółkowej. Na koniec oceń migrujące komórki za pomocą cytometrii przepływowej, a czynniki rozpuszczalne w zebranym medium za pomocą enzymatycznego testu immunosorbentowego. Tkanka maziowa hodowana z rosnącymi dawkami MCP-1 lub LPS wykazywała wyraźne zmiany w morfologii wyściółki śródbłonkowej, w tym delikatną wyściółkę śródbłonkową i pogrubioną wyściółkę śródbłonkową o zmniejszonej gęstości komórkowej w porównaniu do kontroli.
Leczenie MCP-1 i LPS zmieniło odpowiedź cytokinową maziówki. MCP-1 indukowało patogenny marker fibroblastów podoplaninę w podwyściółku, podczas gdy LPS zwiększyło podoplaninę zarówno w wyściółce śródbło
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia opracowanie i zastosowanie Systemu Analizy Przestrzeni Stawowej (Joint Space Analysis System, JSAS), modułowego modelu ex vivo zaprojektowanego w celu odwzorowania architektury błony maziowej człowieka na potrzeby badań nad zapaleniem stawów. JSAS umożliwia badanie ostrych zmian w błonie maziowej człowieka, zachowując złożoność i znaczenie biologiczne trójwymiarowych struktur tkankowych, przy jednoczesnym zapewnieniu możliwości kontrolowanej manipulacji eksperymentalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Reumatologia
- Biologia stanu zapalnego
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Zapalenie stawów objawia się stanem zapalnym stawów, uszkodzeniem chrząstki, bólem i ograniczoną ruchomością.
- Błona maziowa jest kluczowym źródłem stanu zapalnego w stawie.
- Istniejące modele nie odtwarzają w sposób wystarczający architektury błony maziowej człowieka.
- Konieczne jest opracowanie modeli opartych na materiale ludzkim w celu badania mechanizmów i odpowiedzi błony maziowej.
Cel badania
- Opracowanie modelu błony maziowej człowieka, który zachowuje kluczową architekturę tkanki.
- Ocena żywotności i funkcji błony maziowej w różnych warunkach.
- Ocena wpływu bodźców zapalnych i infekcyjnych na tkankę maziową.
Zastosowane metody
- Pobieranie błony maziowej przedniej od pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezie stawu kolanowego (TKA).
- Przygotowanie rdzeni biopsyjnych o średnicy 3 mm i umieszczenie ich w systemach transwell (pory 5 μm lub 0,4 μm).
- Inkubacja w warunkach hiperoksygenacji, atmosferycznych oraz fizjologicznych stężeń tlenu.
- Zastosowanie bodźców takich jak MCP-1/CCL2, LPS, N-acetylocysteina, S. aureus oraz B. burgdorferi.
- Ocena żywotności tkanek, produkcji cytokin (ELISA) oraz analiza histologiczna (FFPE).
- Cytometria przepływowa w celu analizy migracji komórek.
Główne wyniki
- Błona maziowa zachowała pełną żywotność przez 3 dni w standardowych warunkach.
- Bodźce zmieniły strukturę i funkcję komórek błony maziowej, w tym spowodowały utratę brzegu makrofagów oraz upregulację patogennych fibroblastów.
- Zaobserwowano produkcję cytokin zapalnych IL-1β oraz TNFα.
- Komórki odpornościowe i fibroblasty migrowały przez pory o średnicy 5 μm; ruchliwe B. burgdorferi migrowały do tkanki przy 0,4 μm, podczas gdy nieruchome S. aureus tego nie robiły.
- Poziomy cytokin były wystarczające do detekcji metodą ELISA.
Wnioski
- JSAS skutecznie modeluje ludzką tkankę błony stawowej w kontrolowanym, modułowym systemie.
- System ten umożliwia badanie ostrych reakcji błony stawowej na różnorodne bodźce.
- JSAS zachowuje biologicznie istotną strukturę i funkcję, co pozwala na prowadzenie przedklinicznych badań nad zapaleniem stawów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
System Analizy Przestrzeni Stawowej (Joint Space Analysis System, JSAS) dostarcza przedklinicznego modelu ex vivo tkanki maziowej człowieka, który zachowuje naturalną architekturę i funkcje, umożliwiając bezpośrednie badanie ostrych reakcji zapalnych istotnych w przebiegu zapaleń stawów. System ten wypełnia krytyczną lukę w badaniach translacyjnych, pozwalając na mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów terapeutycznych w kontekście tkanki ludzkiej przed rozpoczęciem badań in vivo lub klinicznych. JSAS zwiększa pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania leków oraz w punktach zwrotnych fazy przedklinicznej, wspierając decyzje dotyczące portfela projektów w ramach programów leczenia zapalnych chorób stawów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w ludzkim środowisku błony maziowej.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie ostrych czynników zapalnych i infekcyjnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez odczyty poziomu cytokin oraz migracji komórek.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy opracowywaniu kandydatów na leki przeciwzapalne lub przeciwzwłóknieniowe.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowaną, zachowującą nienaruszoną architekturę tkankę błony maziowej do przesiewania związków chemicznych lub leków biologicznych.
- Zapewnia powtarzalne wyniki ilościowe, takie jak poziomy cytokin i profile migracji komórek.
- Umożliwia standaryzację testów w celu zapewnienia porównywalności wyników między różnymi badaniami i zespołami.
- Wspiera skalowalność i modułową adaptację do różnych bodźców zapalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z odpowiedziami ludzkich tkanek w przebiegu choroby, co ułatwia opracowywanie biomarkerów translacyjnych.
- Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie ostrego stanu zapalnego błony maziowej ex vivo.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane z ludzkich tkanek.
- Zmniejsza zależność od mniej predykcyjnych modeli zwierzęcych w badaniach nad wczesnymi stadiami zapalenia stawów.
Integracja potoku i przepływu pracy
JSAS integruje się z continuum od odkrywania leków do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów terapeutycznych oraz badania mechanistyczne w ludzkiej tkance maziowej przed rozpoczęciem prac in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego dla celów terapeutycznych w stanach zapalnych stawów.
- Przesiew: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne systemy tkankowe do oceny związków i ilościowego oznaczenia cytokin.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki analiz ELISA i cytometrii przepływowej dla rzetelnego porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od ludzkich tkanek ex vivo do dopasowania biomarkerów w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modułowa, wielokrotnego użytku platforma do badań nad różnymi bodźcami zapalnymi i infekcyjnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obchodzenie się z tkanką, ocenę żywotności oraz ilościowe odczyty w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym triage portfolio w badaniach nad zapaleniem stawów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów przeciwzapalnych i przeciwzwłóknieniowych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami ludzkimi i technikach hodowli ex vivo.
- Wymaga dostępu do chirurgicznie pobranej tkanki błony maziowej oraz infrastruktury do hodowli w systemie transwell.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie żywotności tkanek i protokołów testowych.
- Można dostosować do różnych bodźców zapalnych i infekcyjnych istotnych w przebiegu zapalenia stawów.
- Okno żywotności jest optymalne dla badań ostrych (do 3 dni w standardowych warunkach).
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:33
Synovium Collection During Total Knee Arthroplasty in a Patient with Morbid Obesity
1:19
Biopsy Coring of Human Synovial Tissue
3:33
Setting up the Joint Space Analysis System (JSAS)
4:45
Histologic and Quantitative Analysis of Synovial Tissue
5:46
Results
7:51
Conclusion
