Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii
20 marca 2026
Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.
Protokół ten oferuje prosty, skuteczny i powtarzalny system transformacji phytophthora palmivora i phytophthora capsici. Na początek weź nową płytkę LB auger z antybiotykiem. Dodaj 20 mikrolitrów płynnego medium LB do środka płyty i nabierz komórki agrobakterii z wcześniej wyhodowanej płyty sterylną rurką mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.
Używając dna i płaskiej podstawy rurki, rozłóż komórki równomiernie na płytce. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 16 do 18 godzin. Następnie wyczyść komórki agrobakterii hodowane przez noc za pomocą pipety o jednym mililitrze.
Ponownie zawiesij komórki w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej agrobakterii, pipetując w górę i w dół. Następnie przenieś ponownie zawiesowane komórki do sterylnej rurki o pojemności 50 mililitrów pokrytej folią i dodaj pożywkę indukcyjną agrobakterii. Zmierz gęstość optyczną próbki na 600 nanometrów i rozcieńcz ją za pomocą ośrodka indukcyjnego agrobakterii, aby uzyskać gęstość optyczną 0,4.
Następnie poluzuj pokrywkę rurki pokrytej folią, zawierającej zawiesinę bakteryjną. Umieść go na platformie z delikatnym poruszeniem z prędkością około 70 obrotów na minutę. Zalać siedmio- do ośmiodniową płytkę phytophthora palmivora 10 mililitrami wody wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza.
Użyj końcówki pipety, aby delikatnie stukać w powierzchnię i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika. Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przelej go do temperatury pokojowej pod światłem na kolejne 15 minut.
Za pomocą pipety delikatnie przelej około siedmiu do ośmiu mililitrów uwolnionych zoospor do sterylnej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów, nie naruszając grzybni i sporangów. Następnie przelej 20 mikrolitrów zawiesiny zoospory do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 180 mikrolitrów wody, aby rozcieńczyć zawiesinę dziesięciokrotnie. Wykonaj przez minutę wir w rurce, aby wykupić zoospory, i użyj hemocytometru pod mikroskopem, by je policzyć.
Dodaj pięć mililitrów przygotowanej zawiesiny agrobakterii do pięciu mililitrów zawiesiny zoospory w sterylnej rurce pokrytej folią o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie wymieszaj zawartość, odkręć pokrywkę tubki i pozostaw w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Podczas inkubacji przygotuj płytki AZCA.
Gdy podłoże się zastygnie, umieść na niej jeden kawałek sterylizowanej membrany Hybond-N+, a płytę trzymaj w ciemności. Po dwóch godzinach współinkubacji użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić 300 mikrolitrów mieszaniny na membranę Hybond-N+, zapewniając, że marginesy są wolne od cieczy. Zostaw odkryte szalki Petriego w kapturze na około 10 minut, aby mieszanka mogła wyschnąć na powietrzu.
Gdy ciecz przestanie się poruszać po błonie, zakryj płytki. Inkubuj przykryte płyty w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni. Po 48 godzinach inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść membranę Hybond-N+ do góry nogami na płytę ślimaka Plich bez przeciągania jej po powierzchni ślimaka.
Użyj płaskiej podstawy rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, aby delikatnie naciskać i przesuwać się po powierzchni membrany, zapewniając pełny kontakt z nośnikiem. Sprawdź spód płyty pod kątem pęcherzyków powietrza i delikatnie wyciśnij ją tą samą płaską podstawą. Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym świetle i 12-godzinnym cyklu ciemności przez dwa do trzech dni.
Na koniec, po dwóch do trzech dniach inkubacji, usuń błonę za pomocą sterylnych kleszczy i kontynuuj inkubację płytki w tych samych warunkach światła i temperatury. Współinkubacja zoospor phytophthora palmivora z agrobakterią tumefaciens EHA 105 ekspresującą pCB301TOR-GFP dała kolonie odporne na G418 na ślimaku Plich z dodatkiem 30 mikrogramów na mililitr G418, podczas gdy na płytach kontrolnych nie pojawiły się kolonie bez infekcji agrobakterią. Liczba transformantów odpornych na G418 na 10 do zoospor o mocy siedmiu wynosiła 55 w eksperymencie pierwszym i 50 w eksperymencie drugim.
Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła wyraźny sygnał białka fluorescencyjnego w transformantach phytophthora palmivora. Dodatkowo ten protokół został zastosowany do phytophthora capsici, aby skutecznie generować transformanty ekspresyjne GFP. Nasz protokół pozwala badaczom badać funkcje genów, określać lokalizację komórek białek oraz śledzić dynamikę infekcji patogenem.
Protokoły te mogą generować niski procent fałszywie pozytywnych wyników, dlatego wymagają dodatkowych podejść do potwierdzenia prawdziwych transformantów. Zastosowanie tego systemu transformacji można rozszerzyć na inne oomycety i grzyby. W przyszłości będziemy również starać się jeszcze bardziej uprościć ten protokół.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia prosty i możliwy do powtórzenia protokół transformacji Phytophthora palmivora z wykorzystaniem Agrobacterium. Metoda ta jest również stosowana do P. capsici.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Patologia roślin
- Genetyka mikroorganizmów
- Biotechnologia
Tło
- Techniki transformacji są kluczowe dla badania patogenów roślin.
- Agrobacterium jest szeroko stosowanym narzędziem do manipulacji genetycznej.
- Rozumienie gatunków Phytophthora może pomóc w opracowaniu roślin odpornych na choroby.
- Protokoły muszą być skuteczne i możliwe do powtórzenia dla szerszego zastosowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody transformacji Phytophthora palmivora.
- Rozszerzenie zastosowania protokołu na P. capsici.
- Ułatwienie badań nad tymi ważnymi patogenami roślin.
Stosowane metody
- Wykorzystanie Agrobacterium do transformacji.
- Zastosowanie specyficznych warunków wzrostu dla optymalnych wyników.
- Ocenienie efektywności transformacji.
- Porównanie z istniejącymi protokołami.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem przekształcił Phytophthora palmivora.
- Efektywność transformacji była porównywalna ze znanymi metodami.
- Metoda była również skuteczna dla P. capsici.
- Wyniki wskazują na potencjalne szersze zastosowania w patologii roślin.
Wnioski
- Opracowany protokół jest prosty i możliwy do powtórzenia.
- Stanowi cenny narzędzie dla badaczy zajmujących się gatunkami Phytophthora.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zbadania funkcji genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust genetic manipulation of Phytophthora species is essential for functional genomics and target validation in plant pathogen research. This streamlined Agrobacterium-mediated transformation protocol reduces operational complexity and increases reproducibility, supporting predictive confidence in gene function studies. The method enables scalable, standardized workflows for early discovery and mechanistic de-risking in agricultural biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate genes in Phytophthora for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function and protein localization.
- Facilitates hypothesis-driven studies to clarify pathogenicity pathways.
- Provides a reproducible system for portfolio triage of genetic targets.
Screening & Assay Development
- Prepares stable transformants for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes transformation conditions to improve reproducibility and quantitative output consistency.
- Enables reliable evaluation of gene function and reporter expression in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse across multiple Phytophthora species.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with translational biomarker discovery in plant pathology.
- Provides continuity from gene function studies to preclinical model development.
- Reduces biological risk by confirming target engagement in relevant pathogen systems.
- Enables tracking of infection dynamics for translational research applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early gene function studies through assay development and translational research in plant pathogen R&D.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification in Phytophthora species.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for downstream phenotypic assays.
- Analytics: Provides measurable readouts such as antibiotic resistance and fluorescence for condition comparison.
- Translational Research: Enables alignment of genetic manipulation with disease-relevant infection models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, broadly applicable transformation capability for multiple oomycete pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Simplifies workflows, enhances reproducibility, and supports scalable transformation campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic targets and advancement of validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics and plant pathogen handling.
- Needs access to basic microbiology instrumentation and fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization for consistent transformation efficiency.
- Adaptable to other Phytophthora species and potentially other oomycetes with protocol optimization.
- May generate low-percentage false positives, necessitating confirmatory analyses for true transformants.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:10
Preparation of Agrobacterium tumefaciens Culture Suspension
1:39
Collecting the Zoospores from Phytophthora palmivora
2:48
Co-Incubation of Agrobacterium and Zoospores
4:00
Selection of G418-Resistant Transformants
5:01
Results
6:02
Conclusion
