Name: Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę transformacji Phytophthora palmivora za pomocą bakterii Agrobacterium. Protokół jest skuteczny, powtarzalny i ma zastosowanie również do P. capsici w badaniach fitopatologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie jest wspierane przez National Science Foundation (NSF Award nr 2418799) oraz National Institute of Food and Agriculture (NIFA Award nr 2023-67013-42262).

1. Przygotowanie roztworów zapasowych, mediów i innych materiałów niezbędnych do przekształcenia
<ol>
	<li>Roztwory antybiotykowe
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwory zapasowe kanamycyny (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) i cefotaksji (100 mg/mL): Rozpuszcz odpowiednie ilości antybiotyków w wodzie, filtruj je sterylizacją, przygotuj aliquoty 1 mL i przechowuj je w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj roztwór zapasowy ryfampicyny (15 mg/mL): Rozpuścić odpowiednią ilość ryfampicyny w DMSO, przygotować 1-mL aliquoty, owinąć je folią i przechowywać w temperaturze -20 °C. UWAGA: Upewnij się, że roztwory chemiczne przygotowane w DMSO są filtrowane i sterylizowane, używając filtrów strzykawkowych wykonanych z materiałów kompatybilnych z DMSO, takich jak nylon lub PTFE (teflon).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłoże do wzrostu Agrobacterium
	<ol>
		<li>Medium ciekłe Luria-Bertani (LB): Aby przygotować 250 mL medium, dodaj 6,25 g LB proszku do 250 mL wody, podłącz roztwór do autoklawu i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Medium agarowe LB: Aby przygotować 250 mL media, dodaj 6,25 g proszku LB i 3,75 g agaru do 250 mL wody, roztwór podkłuj w autoklawie i przechowuj w RT. Dodaj odpowiednie antybiotyki do roztopionego agaru LB przed przygotowaniem płytek. Przechowuj płytki uzupełnione antybiotykami w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłoże dla wzrostu i transformacji P. palmivora
	<ol>
		<li>Agar 10% V8: Aby przygotować 500 mL, dodaj 50 ml oryginalnego soku warzywnego V8 do 450 ml wody. Następnie dodaj 0,5 g CaCO3 do zawiesiny i wymieszaj, aby dobrze wymieszać. Roztwór wylew w autoklawie i wlej go na talerze. UWAGA: Dodawaj odpowiednie antybiotyki, gdy jest to potrzebne. Przechowuj płytki uzupełnione antybiotykami w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Płynne medium Murashige i Skoog o pół mocy Murashige i Skoog: Dodaj 2,15 g podstawowego medium Murashige i Skoog do 950 ml wody, dostosuj pH do 5,6 przy 1 N KOH i dodaj wodę do 1 L. Użyj bezpośrednio do przygotowania 1/2 MS agaru (krok 1.3.3), autoklawuj pozostałą 1/2 MS płynu i przechowuj w RT.</li>
		<li>1/2 MS agar do agaru współuprawy Agrobacterium-zoospore (AZCA): Aby przygotować 600 mL AZCA, wymieszaj 567 mL 1/2 MS płynu z etapu 1.3.2 z 9 g agaru. Roztwór w autoklawie i przechowuj w RT.</li>
		<li>50% glicerolu: Wymieszaj 50 ml glicerolu z 50 ml wody, roztwór podkłucuj i przechowuj w stanie RT.</li>
		<li>1M MES (pH 5,6): Aby przygotować 200 mL, dodaj 39,048 g hydratu MES do 160 ml wody, a następnie dostosuj pH do 5,6 za pomocą roztworu NaOH. Następnie dodaj wodę do 200 mL, przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze RT w ciemnych warunkach. UWAGA: MES rozpuszcza się stopniowo wraz ze wzrostem pH. Na początku użyj 10 N NaOH, aby pH zbliżyło się do 5,6, co niemal rozpuści proszek. Następnie dodaj 1 N NaOH, aby pH było dokładnie 5,6.</li>
		<li>20% glukozy: Rozpuścić 10 g glukozy w 40 mL wody, następnie dodać wodę do 50 mL, przefiltrować roztwór i przechowywać w stanie RT.</li>
		<li>200 mM acetosyringonu (AS): Rozpuszcz 40 mg 4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenonu w 1 mL DMSO (patrz UWAGA pod 1.1.2) i przykryj roztwór folią. Zrób świeżość w dniu przemiany.</li>
		<li>Medium indukcyjne agrobakterii (AIM): Aby przygotować 40 mL podłoża, należy dodać 400 μL 50% gliceru, 400 μL 20% glukozy, 1,6 mL 1 M MES (pH 5,6), 40 μL 200 mM AS do 37,6 mL roztworu 1/2 MS ciekłego (pH 5,6) (przygotowanego w kroku 1.3.2) w jałowej probówce o pojemności 50 mL. Dobrze wymieszaj roztwór, przykryj tubkę folią i użyj świeżej w ciągu kilku godzin.</li>
		<li>Agrobakteriowo-zoosporowy agar współhodowlaczy (AZCA): Aby przygotować 600 mL agaru, dodaj 6 mL 50% gliceru, 3 mL 20% glukozy, 24 mL 1 M MES (pH 5,6), 600 μL 200 mM AS do autoklawowanego i stopionego 567 mL 1/2 MS agaru (pH 5,6) (przygotowanego w kroku 1.3.3). Wlej roztwór do talerzy i przykryj je czarną szmatką, aby chronić je przed światłem. UWAGA: Dodaj roztwory chemiczne do stopionego agaru o pojemności 1/2 MS (krok 1.3.9) w temperaturze 55-60 °C. Wyłącz światła w okapie podczas kroków 1.3.7-1.3.9, ponieważ AS jest światłoczuły. Wykonaj te trzy kroki w dniu przemiany.</li>
		<li>Plich agar: Aby przygotować 1 L agaru w 950 mL wody, dodaj 0,5 g KH2PO4, 0,25 g MgSO4·7H2O, 1 g L-asparaginy, 5 g glukozy, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 10 μL tiaminy (100 mg/mL w wodzie, przechowywane w 4 °C), 10 mg β-sitosterolu (rozpuszcza się w 3 mL etanolu przed dodaniem). Wymieszaj roztwór, aby rozpuścić wszystkie składniki, a następnie dodaj wodę, aby objętość wzrosła do 1 L. Podziel roztwór na porcje po 500 mL i dodaj 7,5 g agaru do każdej 500 mL. Roztwór należy zautoklawić i dodać odpowiednie antybiotyki, gdy temperatura spadnie do 55 °C, a następnie wlej go do talerzy.</li>
		<li>Membrana Hybond N+: Przetnij membranę z ochronnymi arkuszami na kawałki o wymiarach 5 cm x 6 cm, owiń je folią aluminiową i podłącz do autoklawu. Podczas umieszczania membrany autoklawowanej na nośniku AZCA, obsługuj ją sterylnymi kleszczemi i wyrzuć ochronne arkusze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla P. palmivora
<ol>
	<li>Siedem do ośmiu dni przed przemianą uprawiaj izolat papai P116 P. palmivora na świeżo przygotowanych płytkach agarowych z 10% V8, umieszczając jeden korek agarowy z wcześniej uprawianej kultury Phytophthora (lub z wywaru) na środku szalki Petriego. UWAGA: Aby uzyskać wyższe stężenie zoospor, ważne jest użycie świeżo przygotowanego, nieklarowanego agaru V8 o stężeniu 10%.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C w cyklu 12-godzinnym światłem i 12 godzin ciemności przez 7-8 dni, aż do przemiany.</li>
</ol>
3. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens
<ol>
	<li>Trzy dni przed transformacją pasmo A. tumefaciens wywołuje szczep EHA105 niosący pCB301TOR-GFP16 na płytce agarowej LB uzupełnionej ryfampicyną (15 μg/mL) i kanamycyną (50 μg/mL). Inkubuj płytkę w temperaturze 28 °C przez 2 dni. UWAGA: Początkowe przygotowanie Agrobacterium (krok 3.1) można wykonać tydzień przed przemianą, a płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C po upływie 2-dniowego okresu inkubacji.</li>
	<li>Dzień przed transformacją weź niewielką ilość komórek Agrobacterium i rozłóż je na nowej płycie agarowej LB z antybiotykami (jak opisano w kroku 3.1), używając dna i płaskiej podstawy sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dla łatwiejszego rozprowadzania dodaj 20 μL płynnego medium LB do środka płytki agarowej LB, wymieszaj komórki bakteryjne z medium LB, a następnie rozłóż je równomiernie na płytce. Inkubuj płytkę w 28 °C przez noc przez około 16-18 godzin.</li>
	<li>Komórki wyhodowane przez noc nabieraj końcówką pipety o pojemności 1 mL i ponownie zawiesijuj je w 1 mL pożywce indukcyjnej Agrobacterium (AIM) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Rozcieńcz komórki do OD600 = 0,4 za pomocą AIM w sterylnej probówce 50 mL przykrytej folią. Przygotować minimum 5 ml do współinkubacji z zoosporami P. palmivora (krok 5.1). UWAGA: OD600 w zakresie od 0,1 do 0,8 pozwoli na pomyślną transformację. OD600 = 0,4 jest rutynowo stosowany, ponieważ to stężenie zapewniało najwyższą wydajność transformacji przy użyciu minimalnego medium (MM) na bazie soli (MM) do indukcji i współuprawy Agrobacterium do przemiany16.</li>
	<li>Inkubuj bakterie w RT w ciemnych warunkach przez 1,5-2 godziny na platformie z delikatnym mieszaniem (około 70 obr./min). UWAGA: Zaleca się wyłączenie świateł na okapie podczas kroku 3.3 oraz poluzowanie koreka rurki 50 mL podczas inkubacji (krok 3.4).</li>
</ol>
4. Uwolnienie zoospor
<ol>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji Agrobacterium tumefaciens (krok 3.4) zalać 7-8-dniową płytkę P. palmivora 10 ml wody wstępnie schłodzonej w 4°C, usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni substratu delikatnie stukając końcówką pipety i inkubować płytkę w 4 °C przez 15 minut, a następnie przez 15 minut w RT pod światłem.</li>
	<li>Delikatnie przenieś uwolnione zoospory (około 7-8 mL) do 15 mL sterylnej rurki wirówki z pipetą, nie naruszając grzybni i sporangów.</li>
	<li>Aby zmierzyć stężenie zoospor, przelej część zawiesiny zoospory (np. 20 μL) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i rozcieńcz ją 10 razy wodą (180 μL H2O dla 20 μL zoospor). Wykonaj vortex w rurce przez 1 minutę, aby zakryć zoospory i ułatwić liczenie, a następnie liczyć liczbę zoospor pod mikroskopem za pomocą hemacytometru. Pomnóż liczoną liczbę przez 10, aby określić stężenie zawiesiny zoospor przygotowanej w kroku 4.2. UWAGA: Stężenie zoospor jest mierzone do obliczania efektywności transformacji. Zazwyczaj stosujemy stężenia w zakresie od 1,5 × 106 do 5 × 106 zoospor na mL, z sukcesem transformacji.</li>
</ol>
5. Współinkubacja Agrobacterium i zoospor
<ol>
	<li>Dodaj 5 ml Agrobacterium (przygotowanego w kroku 3.4) do 5 ml zawiesiny zoospor (przygotowanej w kroku 4.2) do sterylnej probówki 50 mL pokrytej folią. Delikatnie wymieszaj i inkubuj tubkę na RT przez 2 godziny w ciemności. Trzymaj pokrywkę luźną i nie potrząsaj tubką podczas współinkubacji.</li>
	<li>W okresie współinkubacji (krok 5.1) przygotuj płytki AZCA (krok 1.3.9). Gdy medium zastygnie, na każdej płytki AZCA umieść jeden kawałek sterylnej membrany Hybond N+ (przygotowanej w kroku 1.3.11) i trzymaj płytki w ciemności.</li>
	<li>Po 2 godzinach współinkubacji Agrobakterii i zoospory (krok 5.1) rozprowadz 300 μL mieszaniny na każdą membranę Hybond N+ umieszczoną na płytkach AZCA (krok 5.2) końcówką pipety, pozostawiając marginesy wolne od cieczy.</li>
	<li>Pozostawij mieszankę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut w okapu, zostawiając szalki Petriego odkryte. Zakrywaj płytki, gdy tylko roztwór na membranie przestanie się rozprzestrzeniać. UWAGA: Podczas kroków 5.1-5.4 trzymaj światła na masce wyłączone. W razie potrzeby używaj świateł podczas dodawania i rozprowadzania mieszanki na membranach (krok 5.3).</li>
	<li>Po wyschnięciu na powietrzu inkubuj płytki w temperaturze 25 °C w ciemności przez 2 dni.</li>
</ol>
6. Wybór transformantów odpornych na G418
<ol>
	<li>Po 48 godzinach współinkubacji (krok 5.5) przenieś błony Hybond N+ do góry nogami za pomocą sterylnych kleszczy na płytki agaru Plich uzupełnione G418 (30 μg/mL) oraz cefotaksim (100 μg/mL). Podczas umieszczania membran na płytach nie przeciągaj ich po powierzchni medium. UWAGA: Stężenie G418 do wyboru transformantów dla każdego izolatu P. palmivora musi być określone, ponieważ dla różnych izolatów obserwuje się różne poziomy czułości. Aby to osiągnąć, umieść korek grzybni o średnicy 0,5 cm w centrum płyt agarowych plich uzupełniony serią stężeń G418 w przyrostach 5 μg/mL, zaczynając od zera. Przygotuj trzy płytki replikacyjne dla każdego stężenia. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 7 dni. Zidentyfikuj najniższe stężenie G418, które całkowicie hamuje wzrost izolatu Phytophthora i wykorzystaj je do selekcji przekształcaczy.</li>
	<li>Użyj płaskiej podstawy rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, aby delikatnie naciskać i przesuwać po powierzchni membrany, aby upewnić się, że jest ona blisko kontaktu z podłożem. Obserwuj spód płytek, aby sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza między błoną a ośrodkiem. Delikatnie wyciśnij pęcherzyk powietrza, jeśli występuje, używając płaskiej podstawy tej samej rurki mikrowirówki.</li>
	<li>Inkubuj płytki w cyklu 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym ciemnym w temperaturze 25 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Po 3 dniach inkubacji usuń błony za pomocą sterylnych kleszczy i kontynuuj inkubację płytek w tych samych warunkach. Błony można usunąć po 2 dniach, jeśli na płytkach pojawią się widoczne kolonie. UWAGA: Transformanty zazwyczaj pojawiają się w ciągu 1-3 dni po usunięciu błony, ale niektóre kolonie mogą pojawić się później. Aby uzyskać więcej transformantów, monitoruj płytki przez około tydzień po usunięciu błon.</li>
	<li>Przenieś transformanty na płytki agarowe o stężeniu V8 o 10% stężeniu G418 lub stężenie zmniejszone o 30%.</li>
</ol>

<ol><li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+oomycete+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology.</a> Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).</li>
<li>Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%3A+From+discovery+to+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The plant immune system: From discovery to deployment.</a> Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).</li>
<li>Tocafundo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+cross-pathogenicity+of+Phytophthora+palmivora+against+cacao%2C+papaya%2C+and+peach+palm%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm.</a> Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).</li>
<li>Morales-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+whole-genome+duplications+define+the+architecture+of+the+genomes+of+the+devastating+West+African+cacao+black+pod+pathogen+Phytophthora+megakarya+and+its+close+relative+Phytophthora+palmivora%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora.</a> G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).</li>
<li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+identification+of+cacao+black+pod+causal+agents+and+identification+of+biological+factors+possibly+contributing+to+Phytophthora+megakarya%27s+field+dominance+in+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa.</a> Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).</li>
<li>Marelli, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chocolate+under+threat+from+old+and+new+cacao+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Chocolate under threat from old and new cacao diseases.</a> Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).</li>
<li>Cvitanich, C., Judelson, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+oomycete%2C+Phytophthora+infestans%2C+using+microprojectile+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment.</a> Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).</li>
<li>Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+oomycete+pathogen%2C+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans.</a> Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+oxathiapiprolin-resistance+gene%2C+functions+as+a+novel+selection+marker+for+Phytophthora+transformation+and+CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing.</a> Front Microbiol. 10, 2402(2019).</li>
<li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+transformation+system+for+Phytophthora+cinnamomi+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein.</a> Front Microbiol. 12, 682754(2021).</li>
<li>Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+the+oomycete+Phytophthora+sojae+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.</a> Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).</li>
<li>Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyltransferase+AAC+%283%29-i+confers+gentamicin+resistance+to+Phytophthora+palmivora+and+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans.</a> BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+straightforward+electro-transformation+system+for+Phytophthora+infestans+and+its+comparison+with+the+improved+PEG%2FCaCl2+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation.</a> J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).</li>
<li>Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+protocol+for+electro-transformation+of+Phytophthora+capsici+zoospores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores.</a> Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).</li>
<li>Vijn, I., Govers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mediated+transformation+of+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans.</a> Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).</li>
<li>Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simple+and+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+system+for+Phytophthora+palmivora%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora.</a> BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).</li>
<li>Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phytophthora+palmivora+extracellular+cystatin-like+protease+inhibitor+targets+papain+to+contribute+to+virulence+on+papaya%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).</li>
<li>Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+protein+of+15+kDa+plays+an+important+role+in+Phytophthora+palmivora+development+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity.</a> Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).</li>
<li>Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMinz%2C+A+%22Molecular+and+Cell+Biology+Methods+for+Fungi%22">Molecular and Cell Biology Methods for Fungi</a>. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).</li>
<li>Bellemain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITS+as+an+environmental+DNA+barcode+for+fungi%3A+An+in+silico+approach+reveals+potential+PCR+biases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases.</a> BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Agrobacterium-mediated+transformation+for+two+oomycete+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens.</a> PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).</li>
<li>Wu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Agrobacterium-mediated+sorghum+transformation+protocol+and+molecular+data+of+transgenic+sorghum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Plant%22%5BJournal%5D)">Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants.</a> In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDNAscan%3A+A+software+to+identify+complete+and+truncated+T-DNA+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions.</a> Front Genet. 10, 685(2019).</li>
<li>Navet, N., Tian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+sweet+basil+%28Ocimum+basilicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum).</a> Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).</li>
<li>Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+papaya+using+both+Cas9+and+Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten wykorzystuje podstawowe podłoże Murashige i Skoog o połowie mocy (1/2 MS) do zastąpienia składników soli minimalnego medium (MM), które są powszechnie stosowane w indukcji i współkultywacji Agrobacterium do transformacji oomycetów i grzybów. Przygotowanie mediów na bazie soli MM wymaga przygotowania wielu roztworów z różnych pojedynczych chemikaliów, a następnie łączenia tych roztworów19. 1/2 MS zawiera także wiele składników chemicznych; jednakże, ponieważ MS jest powszechnie dostępny komercyjnie jako gotowy proszek, przygotowanie medium jest uproszczone do rozpuszczania proszku w wodzie. Ta modyfikacja znacznie skraca czas przygotowania mediów i minimalizuje ryzyko błędów ludzkich. Ponadto protokół poprawia efektywność transformacji, dając większą liczbę transformantów w porównaniu do wcześniej opisanej metodyAMT 16. Jest również skuteczny w transformacji P. capsici i prawdopodobnie nadaje się do innych gatunków Phytophthora . Dodatkowo wspierając jego potencjalne szersze zastosowanie, podłoże oparte na SM było wcześniej wykorzystywane do współhodowli szczepów Agrobacterium tumefaciens wyrażających Zarody AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interagujące białko 1) oraz P. infestans , umożliwiając skuteczną transformację P. infestans21.
Ważne jest, aby zauważyć, że ten protokół może generować niski procent fałszywie pozytywnych wyników. Spośród 39 transformantów odpornych na G418, które zostały przetestowane za pomocą obserwacji fluorescencji GFP (PCR), cztery nie wykazały ani fluorescencji, ani amplifikacji EGFP (Tabela 1, Rysunek 1C). Ponieważ częściowa integracja T-DNA podczas transformacji wywołanej przez Agrobacterium nie jest rzadkością22,23, możliwe jest, że tylko część T-DNA zawierająca gen NPTII z plazmidu pCB301TOR-GFP16 została zintegrowana z genomem P. palmivora. Alternatywnie, fałszywie pozytywne wyniki mogą wynikać z niewystarczającego kontaktu membrany z ośrodkiem selektywnym, co pozwala uniknąć selekcji G418. Dlatego zapewnienie, że błona pozostaje w pełnym kontakcie z podłożem (krok 6.2), jest zatem niezbędne.
Protokół ten może zostać dodatkowo uproszczony. Na przykład MES w ośrodku indukcyjnym Agrobacterium (AIM) oraz agar współhodowlaczy Agrobacterium-zoospore (AZCA) mogą zostać potencjalnie pominięte. MES jest powszechnie stosowany jako środek buforujący w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej w celu utrzymania stabilnego pH; jednak przygotowanie roztworu bulwarowego MES o pojemności 1 M przy pH 5,6 zajmuje wystarczająco dużo czasu i zwiększa koszty. W AMT roślin, takich jak słodka bazylia24 i papaja25, zastosowano podobne podłoże indukcyjne i współhodowlane oparte na MS Agobacterium bez MES, co sugeruje, że MES może nie być niezbędny do transformacji P. palmivora . Potrzebne są dalsze eksperymenty, aby potwierdzić, że pominięcie MES nie narusza efektywności transformacji.
Ogólnie rzecz biorąc, ten uproszczony protokół stanowi praktyczną i dostępną platformę do rutynowej manipulacji genetycznej P. palmivora, P. capsici oraz potencjalnie innych oomycetów. Wspiera szeroki zakres badań fundamentalnych, z których niektóre mają potencjał translacyjny, w tym znakowanie patogenów fluorescencyjne w celu śledzenia dynamiki infekcji, oznaczanie białek do badania lokalizacji subkomórkowej oraz analizy funkcjonalne poprzez ukierunkowane zmiany ekspresji genów lub sekwencji kodujących białka. W połączeniu z edycją genomu opartą na CRISPR, protokół ten ma przyspieszyć analizę mechanizmów patogenności i identyfikację kluczowych czynników zjadliwości w tych destrukcyjnych patogenach. Uzyskane wnioski z kolei umożliwią opracowanie nowych, mechanizmowych strategii kontroli chorób.

Phytophthora, rodzaj oomycetów, obejmuje wiele z najbardziej niszczycielskich patogenów roślinnych na świecie, odpowiedzialnych za poważne straty ekonomiczne 1,2. Wśród nich Phytophthora palmivora jest patogenem o szerokim zasięgu żywiciela, który infekuje wiele upraw o znaczeniu gospodarczym, w tym kakao i papaję3. Jest to najbardziej rozpowszechniony czynnik przyczynowy zgnilizny czarnych strąków w kakao, tropikalnym drzewie wieloletnim, które jest głównym składnikiem wielomiliardowego przemysłu czekoladowego 4,5,6. Zrozumienie mechanizmów patogenności molekularnej tego destrukcyjnego patogenu jest kluczowe dla projektowania nowych, skutecznych strategii kontroli chorób, a transformacja genetyczna jest kluczowym narzędziem umożliwiającym takie badania.
Opracowano kilka metod transformacji Phytophthora spp., w tym bombardowanie mikropociskami7, transformację protoplastów pośredniczoną przez glikol polietylenowy i dichlorek wapnia (PEG/CaCl2) 8,9,10,11, elektroporację zoospor 12,13,14 oraz transformację pośredniczoną przez Agrobacterium (AMT)15,16. Wśród tych podejść AMT oferuje kluczowe zalety, ponieważ zazwyczaj generuje integrację genów z pojedynczą kopią15,16 i jest stosunkowo łatwy do wykonania bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.
Wcześniej opracowano protokół efektywnej transformacji P. palmivora z użyciem AMT.16. Tą metodą skutecznie przekształciliśmy P. palmivora za pomocą wielu konstrukcji17,18. Metoda ta wykorzystuje podłoża indukcyjne i współuprawne na bazie soli minimalnej (MM), które są powszechnie stosowane do przemiany grzybów i oomycetów 15,16,19. Chociaż protokół transformacji oparty na MM okazał się skuteczny w generowaniu transformantów, przygotowanie wielu roztworów stockowych i łączenie ich w celu stworzenia mediów może być zadaniem zarówno czasochłonnym, jak i podatnym na błędy.
Przedstawiamy tutaj znacznie uproszczoną metodę AMT P. palmivora , wykorzystując komercyjne podłoże bazalne Murashige i Skoog (MS) do zastąpienia składników na bazie soli MM w podłożu indukcyjnym i współuprawowym Agrobacterium 16. Ta metoda eliminuje konieczność przygotowywania wielu roztworów chemicznych, dzięki czemu proces jest mniej czasochłonny i bardzo powtarzalny. Co więcej, to podejście wydaje się dawać wyższą efektywność transformacji w porównaniu do wcześniej opisanej metody16 i jest również stosowane do P. capsici.

<table><tbody><tr><td>Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1126</td><td></td></tr><tr><td>4'-Hydroksy-3',5' dimetoksiacetofenon</td><td>TCI</td><td>D2666</td><td>Acetosyringon (AS)</td></tr><tr><td>Rurka 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>BioReagenty Fishera</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioReagenty Fishera</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błona Hybond-N+ (30 cm i razy; 3 m)</td><td>Cytiva</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239216-500G</td><td>CaCO3</td></tr><tr><td>Sól sodowa cefotaksymu</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>AAJ6269006</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrobiologiczny DNeasy PowerLyzer</td><td>Qiagen</td><td>12255-50</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop fluorescencyjny ZEISS Axioscope 5 z filtrem 38 HE</td></tr><tr><td>Siarczan G418</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>AC329400010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911046-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr (Jasna linia)</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamicyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-257635</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine bezwodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN10079425</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>BioReagenty Fishera</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Heptahydrat siarczanu magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td>MgSO4&middot; 7H2O</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933-100G</td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog Bazal Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519-50L</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan diwodoru potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1370391000</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Ryfampycyna</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-200910</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek tiaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr widzialny UV</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-385-355</td><td></td></tr><tr><td>V8 Oryginalny 100% sok warzywny</td><td>Campbell Soup Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-163</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td>Klasa biologii molekularnej, oczyszczona za pomocą systemu oczyszczania wody Mill-Q</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>ACROS</td><td>611805000</td><td>Obecnie dostępne przez Thermo Scientific Chemicals</td></tr><tr><td>&beta;-Sitosterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85451-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona metoda transformacji phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

A Simplified Method for Agrobacterium-mediated Transformation of Phytophthora palmivora

Phytophthora to rodzaj oomycetów, który zawiera liczne niszczycielskie patogeny roślinne, wśród których jest gatunek o szerokim zasięgu żywiciela P. palmivora. Genomika funkcjonalna Phytophthora była ograniczona przez ograniczoną dostępność solidnych, łatwych do wdrożenia metod transformacji. Spośród dostępnych podejść szczególnie atrakcyjna jest transformacja mediowana przez Agrobakterie (AMT), ponieważ wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu i często generuje stabilne transformanty przy wszczepieniu genu z pojedynczą kopią. Większość protokołów AMT do transformacji grzybów i oomycetów wykorzystuje minimalną ilość soli medium (MM) w indukcji i współhodowli Agrobacterium . Przygotowanie tych mediów zazwyczaj polega na przygotowywaniu i mieszaniu wielu roztworów bulionowych, z których niektóre zawierają wiele składników w różnym stężeniu. Proces ten jest czasochłonny i podatny na błędy, co prowadzi do niespójnych sukcesów transformacji. Przedstawiamy tutaj uprostroniony, prosty i powtarzalny protokół AMT dla P. palmivora , który wykorzystuje komercyjnie dostępne podłoże bazalne Murashige i Skoog (MS) do przygotowania podłoża indukcyjnego i współhodowlanego Agrobacterium . Protokół ten został również skutecznie stosowany do transformacji P. capsici i może być stosowany także wobec innych gatunków Phytophthora .

Stosując ten protokół, przeprowadziliśmy dwa niezależne eksperymenty transformujące P. palmivora przy użyciu A. tumefaciens EHA105 przenoszącego pCB301TOR-GFP16. Jak można się spodziewać, współinkubacja zoospor z Agrobacterium dała kolonie odporne na G418 na płytkach agarowych plich uzupełnionych 30 μg/mL G418, podczas gdy na płytach kontrolnych nie zaobserwowano kolonii bez zakażenia Agrobacterium (Rysunek 1A). Liczba transformantów odpornych na G418 na 107 zoospor wyprodukowanych w tych dwóch eksperymentach wyniosła odpowiednio 55 i 50 (Tabela 1), co jest niemal dwukrotnie wyższą liczbą (27 ± 5) wcześniej uzyskaną przy użyciu wcześniejszego protokołu16.
Prawdziwe transformanty zweryfikowano dwoma metodami: po pierwsze, obserwacją fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a po drugie, amplifikacją PCR fragmentu genu EGFP o mocy 550 bp za pomocą Taq 2X Master Mix (NEB) z parą primerów EGFP-F2 (5'- GACGTAACGGCCACAAGTTC-3') i EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). W eksperymencie (Exp) 1, 15 z 18 transformantów odpornych na G418, a w Exp 2, 17 z 21 transformantów wykazywało fluorescencję GFP (Tabela 1, Rysunek 1B). Dla siedmiu transformantów odpornych na G418, które nie wykazały fluorescencji w obu eksperymentach, trzy zostały potwierdzone jako prawdziwe transformanty za pomocą PCR (rysunek 1C). Łącznie odsetek prawdziwych transformantów oszacowano na 90%.
Ponadto udało nam się również pomyślnie przekształcić izolat dyni P. capsici , PC2024-14sz, używając A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP, zgodnie z protokołem z drobnymi modyfikacjami w przygotowaniu zawiesin zoospor (okres inkubacji w temperaturze 4 °C po zalaniu 7-dniowej płytki P. capsici wstępnie schłodzoną wodą został wydłużony do 30 minut). Liczba transformantów odpornych na G418 (30 μg/mL) na 107 z jednego eksperymentu wynosiła 13. Dziewięć transformantów zaobserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym i wszystkie wywołały fluorescencję (Plik Uzupełniający 1), co sugeruje, że są to prawdziwe transformanty.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69753/69753fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Transformacja P. palmivora przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP. (A) Pojawienie się transformantów odpornych na G418 P. palmivora na agarze Plich uzupełnionym o stężeniu 30 μg/mL G418. (B) Wykrywanie ekspresji GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym u reprezentatywnego transformanta i szczepu P . palmivora typu dzikiego (WT). Zdjęcia wykonywano zarówno pod kanałami fluorescencji jasnego pola (BF), jak i GFP. (C) Amplifikacja EGFP PCR z czterech transformantów z wykrywalną fluorescencją GFP i siedmiu bez fluorescencji GFP. Uniwersalna para zapalników ITS4/ITS520 została użyta do amplifikacji wewnętrznego obszaru transkrybowanego spacera (ITS) w celu sprawdzenia integralności DNA. Transformanty bez fluorescencji GFP są podkreślone pogrubionym, podkreślonym tekstem. Skróty: M = NEB 100 bp drabina DNA; WT = dziki typ P. palmivora P1; N = ujemna kontrola PCR z użyciem H2Ojako szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69753/69753fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eksperyment</td>
			<td>OD600 Agrobacterium</td>
			<td>Stężenie zoospor (/mL)</td>
			<td>Objętość zoospor (mL)</td>
			<td>Liczba transformantów odpornych na G418</td>
			<td>Liczba transformantów z wykrywalnym sygnałem GFP (Wykryte / Obserwowane)</td>
			<td>Liczba transformantów odpornych na G418 / 107 zoospor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.8 x 106</td>
			<td>4.3</td>
			<td>43</td>
			<td>15/18</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>0.4</td>
			<td>2.9 x 106</td>
			<td>4.6</td>
			<td>67</td>
			<td>17/21</td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Efektywność transformacji P. palmivora za pośrednictwem agrobakterii przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP. 
Plik uzupełniający 1: Ekspresja GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym u dzikiego typu (WT) P. capsici oraz reprezentatywnego transformanta generowanego przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP. Zdjęcia wykonywano zarówno pod kanałami fluorescencji jasnego pola (BF), jak i GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69753/Supplementary File 1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Phytophthora is an oomycete genus that contains numerous destructive plant pathogens, among which is the broad-host-range species P. palmivora. Functional ...

Protokół ten oferuje prosty, skuteczny i powtarzalny system transformacji phytophthora palmivora i phytophthora capsici. Na początek weź nową płytkę LB auger z antybiotykiem. Dodaj 20 mikrolitrów płynnego medium LB do środka płyty i nabierz komórki agrobakterii z wcześniej wyhodowanej płyty sterylną rurką mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Używając dna i płaskiej podstawy rurki, rozłóż komórki równomiernie na płytce. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 16 do 18 godzin. Następnie wyczyść komórki agrobakterii hodowane przez noc za pomocą pipety o jednym mililitrze.Ponownie zawiesij komórki w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej agrobakterii, pipetując w górę i w dół. Następnie przenieś ponownie zawiesowane komórki do sterylnej rurki o pojemności 50 mililitrów pokrytej folią i dodaj pożywkę indukcyjną agrobakterii. Zmierz gęstość optyczną próbki na 600 nanometrów i rozcieńcz ją za pomocą ośrodka indukcyjnego agrobakterii, aby uzyskać gęstość optyczną 0,4.Następnie poluzuj pokrywkę rurki pokrytej folią, zawierającej zawiesinę bakteryjną. Umieść go na platformie z delikatnym poruszeniem z prędkością około 70 obrotów na minutę. Zalać siedmio- do ośmiodniową płytkę phytophthora palmivora 10 mililitrami wody wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza.Użyj końcówki pipety, aby delikatnie stukać w powierzchnię i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika. Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przelej go do temperatury pokojowej pod światłem na kolejne 15 minut.Za pomocą pipety delikatnie przelej około siedmiu do ośmiu mililitrów uwolnionych zoospor do sterylnej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów, nie naruszając grzybni i sporangów. Następnie przelej 20 mikrolitrów zawiesiny zoospory do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 180 mikrolitrów wody, aby rozcieńczyć zawiesinę dziesięciokrotnie. Wykonaj przez minutę wir w rurce, aby wykupić zoospory, i użyj hemocytometru pod mikroskopem, by je policzyć.Dodaj pięć mililitrów przygotowanej zawiesiny agrobakterii do pięciu mililitrów zawiesiny zoospory w sterylnej rurce pokrytej folią o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie wymieszaj zawartość, odkręć pokrywkę tubki i pozostaw w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Podczas inkubacji przygotuj płytki AZCA.Gdy podłoże się zastygnie, umieść na niej jeden kawałek sterylizowanej membrany Hybond-N+, a płytę trzymaj w ciemności. Po dwóch godzinach współinkubacji użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić 300 mikrolitrów mieszaniny na membranę Hybond-N+, zapewniając, że marginesy są wolne od cieczy. Zostaw odkryte szalki Petriego w kapturze na około 10 minut, aby mieszanka mogła wyschnąć na powietrzu.Gdy ciecz przestanie się poruszać po błonie, zakryj płytki. Inkubuj przykryte płyty w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni. Po 48 godzinach inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść membranę Hybond-N+ do góry nogami na płytę ślimaka Plich bez przeciągania jej po powierzchni ślimaka.Użyj płaskiej podstawy rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, aby delikatnie naciskać i przesuwać się po powierzchni membrany, zapewniając pełny kontakt z nośnikiem. Sprawdź spód płyty pod kątem pęcherzyków powietrza i delikatnie wyciśnij ją tą samą płaską podstawą. Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym świetle i 12-godzinnym cyklu ciemności przez dwa do trzech dni.Na koniec, po dwóch do trzech dniach inkubacji, usuń błonę za pomocą sterylnych kleszczy i kontynuuj inkubację płytki w tych samych warunkach światła i temperatury. Współinkubacja zoospor phytophthora palmivora z agrobakterią tumefaciens EHA 105 ekspresującą pCB301TOR-GFP dała kolonie odporne na G418 na ślimaku Plich z dodatkiem 30 mikrogramów na mililitr G418, podczas gdy na płytach kontrolnych nie pojawiły się kolonie bez infekcji agrobakterią. Liczba transformantów odpornych na G418 na 10 do zoospor o mocy siedmiu wynosiła 55 w eksperymencie pierwszym i 50 w eksperymencie drugim.Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła wyraźny sygnał białka fluorescencyjnego w transformantach phytophthora palmivora. Dodatkowo ten protokół został zastosowany do phytophthora capsici, aby skutecznie generować transformanty ekspresyjne GFP. Nasz protokół pozwala badaczom badać funkcje genów, określać lokalizację komórek białek oraz śledzić dynamikę infekcji patogenem.Protokoły te mogą generować niski procent fałszywie pozytywnych wyników, dlatego wymagają dodatkowych podejść do potwierdzenia prawdziwych transformantów. Zastosowanie tego systemu transformacji można rozszerzyć na inne oomycety i grzyby. W przyszłości będziemy również starać się jeszcze bardziej uprościć ten protokół.

a-simplified-method-for-agrobacterium-mediated-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physocmitrella oraz protoplastów mezofilu Arabidopsis1.

Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Poznaj uproszczoną metodę transformacji Phytophthora palmivora za pomocą bakterii Agrobacterium. Protokół jest skuteczny, powtarzalny i ma zastosowanie również do P. capsici w badaniach fitopatologicznych.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Przeglądaj więcej filmów