Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Naszym celem było opracowanie tańszego, inspirowanego Hobermanem kompatybilnego urządzenia do rozciągania komórek pod mikroskopem, aby zbadać, jak mechaniczne rozciąganie wpływa na funkcjonowanie komórek. To urządzenie pozwala badaczom badać odpowiedzi komórek życia na bodźce mechaniczne, naśladując układy fizjologiczne, takie jak bijące serce czy płuca oddychające. Na początek, jeśli to stosowne, od środków ochrony osobistej.

Wymieszaj bazę Silgard 184 i środek utwardzający w proporcji 10 do 1 w plastikowej misce. Za pomocą gumki do języka wymieszaj składniki energicznie przez dwie do trzech minut. Następnie umieszczam naczynie w komorze odgazowującej na godzinę.

Następnie weź przygotowane formy wydrukowane 3D i dodaj 1,3 grama mieszanki PDMS do formy izotropowej. Następnie dodaj 0,5 grama mieszanki PDMS do formy osiowej uni. Rozprowadz żel równomiernie po formie i odgazuj wypełnioną formę przez godzinę.

Pozwól żelowi w formie osiąść na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie utwardz pleśń w piekarniku w 60 stopniach Celsjusza przez noc. Następnie wymieszaj części A i B żelu NuSil 8100 w równych proporcjach.

Zmieszaj połączony żel z siecierem Silgard 184 przy 0,36% całkowitej objętości, aby uzyskać sztywność podłoża 13 kilopascal. Aby uzyskać miękkie podłoże o sztywności 0,3 kilopaskala, pomiń dodawanie nawiązującego sieciacza, a następnie mieszaj roztwór w bębku przez 15 minut. Umieść mieszankę NuSil w komorze odgazowującej i odgazuj na 30 minut.

Teraz ostrożnie wyjmij żel PDMS z niestandardowej formy i przyłóż go na pokrywę 40 mm, nie rozrywając go. Następnie umieść żel PDMS w kodzie spinowym. Pipeta 100 mikrolitrów mieszaniny NuSil na negatywną powierzchnię izotropowego żelu PDMS.

Następnie pipetować 50 mikrolitrów mieszaniny NuSil na negatywną powierzchnię żelu uni axial PDMS. Potem ten kod, 7 G przez 50 sekund. Aby osiągnąć grubość 100 mikrometrów.

Pozostawić żel powlekany osiadać na płaskiej, płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Włóż żel do piekarnika i utwardzaj w 60 stopniach Celsjusza przez noc. Teraz zasiewaj ludzkie drogi oddechowe, komórki mięśni gładkich w elastycznych dołkach komórkowych i inkubuj w standardowych warunkach.

Następnie wymieszaj komórki z roztworem FLIPR Calcium 6 do obrazowania. Do pomiaru siły trakcyjnej pokryj żelowe podłoża PDMS NuSil warstwą fluorescencjowych kulek, które służą jako markery fiducialne. Przygotuj roztwór 0,025% mikrometra czerwonych fluorescencyjnych mikrosfer zmodyfikowanych z karboksylatem o średnicy jednego mikrometra w HBSS.

Używając wirującego mieszacza wirowego, roztwór kulki przez 10 sekund. Następnie pipetować 880 mikrolitrów roztworu kulki do żelu izotropowego. Dodaj 420 mikrolitrów roztworu kulki do żelu osiowego uni.

Po godzinnej inkubacji żelu w temperaturze pokojowej ostrożnie usuń roztwór koralików, aby zachować rozmieszczenie koralików. Następnie użyj wacika lub chusteczki laboratoryjnej, aby delikatnie wytrzeć resztki roztworu z powierzchni żelu. Następnie użyj mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę, lekki silnik i obiektyw suchy 10 razy.

Ustaw wzbudzenie na 475 na 40 nanometrów, a emisję na 555 na 50 nanometrów. Pobieranie obrazów 16-bitowych z częstotliwością dwóch herców podczas eksperymentów stretch. Następnie umieść żel izotropowy na rozciągaczu i zrób zdjęcia fluorescencyjne kulki za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w 10-krotny obiektyw suchy. Zrób obrazy w stanie przed rozciąganiem.

Nieprzerwanie rejestruj obrazy przez cały protokół rozciągania w centrum podłoża. Jeśli to konieczne, przed wykonaniem zdjęć ponownie ustawij ostrość mikroskopu w pozycji rozciągniętej w miejscu. Analizuj obrazy za pomocą niestandardowego kodu MATLAB opartego na mikroskopii sił trakcyjnych furier, aby obliczyć wektory przemieszczeń i odpowiadające im pola odkształcenia planarne.

Przedstawij dane jako średnią końcowych prób. Zastosowanie przemieszczenia o 240 mikrometrów powodowało, że fluorescencyjne kulki przesuwały się promieniście na zewnątrz od środka. Mikroskopia siły trakcyjnej wykazała izotropowe pole przemieszczenia z wektorami promieniującymi od środka i rosnącymi wraz z odległością.

Izotropowe pole przemieszczenia generowało jednorodne pole odkształcenia płaskiego. Zwiększenie przemieszczenia do 1000 mikrometrów skutkowało wzrostem wektorów przemieszczeń o jasności, zachowując orientację promienistą. Odpowiadające pole odkształcenia na 1000 mikrometrów zwiększało się na wielkości, pozostając jednocześnie symetriczne promienisto.

W żelach osiowych uniwersytetu poddanych przemieszczeniu 250 mikrometrów, wektory przemieszczeń były głównie wyrównane wzdłuż jednej osi, co odpowiada odkształceniu osiowemu uni. Przebiegi odkształcenia ściśle odzwierciedlały zaprogramowane przemieszczenia silników i pozostawały zsynchronizowane przez trzy powtarzające się cykle. Wartości odkształcenia przy maksymalnym przesunięciu pozostały stałe w trzech niezależnych próbkach.

Zastosowanie przejściowego przesunięcia do 5 555 mikrometrów powodowało odkształcenia od ponad 0,1% do 12%. Przejściowe odkształcenie 0,5% indukowało wzrost wapnia wewnątrzkomórkowego, co objawiało się wyższą intensywnością fluorescencji po rozciągnięciu. Dzięki naszym noszom naukowcy mogą przeprowadzić obrazowanie wapnia z żywych komórek, mikroskopię siły trakcyjnej oraz ilościowo określać odpowiedzi mechaniczne komórek na rozciągnięcie izotropowe lub uniwersyteczne. Kluczowym krokiem jest zapewnienie, że żele utwardzają się na płaskiej powierzchni, ponieważ nierównomierna grubość może przesunąć podłoże z ostrości i zmniejszyć przejrzystość optyczną podczas obrazowania na żywo.

Przyszłe badania mogą badać reorientację cytoszkieletu wywołaną rozciągnięciem, patologiczne stany przeciężenia związane z astmą lub uszkodzeniami płuc oraz różne typy komórek.