Name: Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-28T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Poznaj metodę oceny fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C przy użyciu cyfrytoniny. Technika selektywnej permeabilizacji błony komórkowej umożliwia badanie oddychania mitochondrialnego w kontekście komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyróżniają Szpital St. Boniface Research, University of Manitoba, Winnipeg, Kanada; oraz Nova Southeastern University (NSU) w Fort Lauderdale, Floryda, USA, za zapewnienie finansowania i wsparcia infrastrukturalnego. Autorzy dziękują również firmom Alzo Biosciences z San Diego w Kalifornii oraz Capillus z Miami na Florydzie, USA za wsparcie finansowe.

1. Rozmrażanie i początkowe pokrycie
UWAGA: Podstawowym medium dla komórek BE(2)-C jest mieszanina 1:1 Minimalnego Essential Medium Eagle opracowanego przez ATCC oraz Medium F12, uzupełniona 10% surowicą bydła płodu (FBS).
<ol>
	<li>Rozmroz zamrożone komórki BE(2)-C z kriovialu w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu wiruj ogniwa 200 × g przez 5 minut, aby usunąć krioprotektant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić pellet komórkowy w pełnym ośrodku wzrostu i umieścić komórki w naczyniu do hodowli komórek o średnicy 10 cm. Inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ w powietrzu, aż komórki osiągną subkonfluencję.</li>
</ol>
2. Subkulturowanie
<ol>
	<li>Podhoduj komórki przez 2–3 przejścia, aby zapewnić im stabilną, wykładniczą fazę wzrostu.</li>
</ol>
3. Trypsynizacja i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Gdy hodowla osiągnie 60–80% konfluentności, trypsynizuj komórki. Przepuszczenie zawiesiny komórki kilkakrotnie przez pipety transferowe z drobnymi końcówkami i polerowanymi końcówkami, aby rozdzielić grudki i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Dodaj świeże medium zawierające FBS, aby zneutralizować trypsynę. Wiruj ogniwa w 200 × g przez 5 minut, aby je rozpuścić.</li>
</ol>
4. Protokół siewu komórek dla mikropłyt hodowli komórek 24-dołkowych stosowanych w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego
<ol>
	<li>Ponownie zawiesij granulek w pełnym medium przy końcowym stężeniu 10 000 komórek na 100 μL na dołek.</li>
	<li>Nasiaj komórki z zoptymalizowaną gęstością, aby zapewnić ich pełne złączenie w ciągu 1–2 dni. Zostaw albo cztery narożne studnie, albo jedną narożną studnię pustą, w zależności od eksperymentalnego projektu. Te studnie będą służyć jako kontrolne tło. UWAGA: Może to wymagać prób i błędów, w tym regulacji głośności mediów i tempa.</li>
	<li>Monitoruj hodowlę pod kątem zmian koloru podłoża — żółknięcie wskazuje na spadek pH i wymaga natychmiastowej wymiany świeżym podłożem, aby utrzymać zdrowie komórek.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do testu opartego na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego
UWAGA: Formaty testów sprzężenia i przepływu elektronów użyte tutaj zgodnie z ustalonymi mikropłytkami opartymi na procesach oddychania mitochondrialnego7, z modyfikacjami takimi jak permeabilizacja komórek BE(2)-C przy użyciu titracji digitoniny oraz warunków leczenia ligandami muskariny.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory stockowe oraz 2x roztwór do testów mitochondrialnych (MAS). Przygotuj 2x mieszanki MAS oraz roztwory zapasowe (substraty i inhibitory) (patrz Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3).</li>
	<li>Przechowuj wszystkie roztwory i MAS w temperaturze -20 °C na przyszłość, co pozwala na efektywne przygotowanie testu. BEZPIECZEŃSTWO: Rotenon, antymycyna A, oligomycyna, FCCP, digitonina i TMPD są niebezpieczne i należy je traktować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego. Wszystkie roztwory inhibitorów powinny być przygotowywane i stosowane w certyfikowanym chemicznym okapie do parów, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i ochrona oczu). Roztwory zawierające te odczynniki, a także odpady zawierające DMSO, powinny być zbierane i utylizowane jako niebezpieczne odpady chemiczne zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi. Powierzchnie robocze powinny być odczyszczone po użyciu.</li>
	<li>Nawilżanie wkładu sensorowego<ol>
		<li>Noc przed eksperymentem nawilż wkład sensora analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, dodając 1 ml buforu kalibracyjnego lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) do każdego otworu. Pozostawić wkład sensora na noc (12–18 h) w temperaturze pokojowej (20–25 °C). UWAGA: Inkubacja w inkubatorze niezawierającym CO₂ w temperaturze 37 °C nie jest konieczna, ponieważ wkład wyrównuje się do temperatury pokojowej podczas procesu ładowania. Po umieszczeniu w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego w celu kalibracji, wkład osiągnie temperaturę 37 °C w ciągu około 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Dzień eksperymentu
UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory na świeżo, dostosuj pH w razie potrzeby i trzymaj na lodzie aż do użycia.
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone podłoże i 2x MAS w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 15–30 minut lub w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 5–10 minut.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie podłoża i roztwory do wstrzykiwania (patrz Tabela 4, Tabela 5, Tabela 6 i Tabela 7) oraz sprawdź, że pH wynosi 7,4. Dostosuj w razie potrzeby i trzymaj roztwory na lodzie do czasu użycia. Do testu skojarzenia użyj Tabeli 4 i Tabeli 5 . Do testu przepływu elektronów użyj Tabeli 6 i Tabeli 7.</li>
	<li>Załaduj inhibitory i substraty do odpowiednich portów na wkłady sensorowe i przygotuj się do przeprowadzenia testu. W zależności od rodzaju testu — testu sprzężenia lub testu przepływu elektronów 7 — można odnieść się do Tabeli 4 i Tabeli 5 lub Tabeli 6 i 7, odpowiednio.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie roztwory robocze podłoża i inhibitora do określonych objętości końcowych (mieszanki objęte: 15 mL; mieszanki do wtrysku wkładów: 2 mL na port). Oblicz stężenia, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenia w otworze po wtrysku (objętość studni końcowa: 700 μL po porcie D).</li>
	<li>Dodaj 450 μL przygotowanego roztworu testowego do każdego dołku 24-dołkowej płyty analizatora strumienia zewnętrznego zawierającego ligandy muscarinowe (końcowe stężenie ligandów: 1 μM; całkowita objętość studni: 500 μL). Upewnij się, że każda studnia zawiera już 50 μL buforu MAS i zanurzonych komórek. UWAGA: Wykonaj ten krok bezpośrednio przed załadowaniem płyty do analizatora.</li>
	<li>Załaduj 50 μL każdego przygotowanego odczynnika do odpowiedniego portu wtryskowego wkładu sensora.</li>
</ol>
7. Programowanie instrumentów i wykonywanie testów
<ol>
	<li>Włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego co najmniej 1–2 godziny przed eksperymentem, aby inkubator wewnętrzny ustabilizował się na 37 °C. Utrzymuj komorę na 37 °C przez cały czas kalibracji i testu.</li>
	<li>Zaprogramuj analizator tak, aby wykonywał odpowiednie cykle mieszania, oczekiwania i pomiaru zgodnie z Tabelą 8.</li>
	<li>Oznaczaj studnie i grupy eksperymentalne w oprogramowaniu zgodnie z projektem eksperymentalnym.</li>
	<li>Rozpocznij przebieg testu. Pozwól instrumentowi skalibrować wkład sensora (~15 min).</li>
	<li>Przygotuj płytkę testową do ładowania podczas kalibracji wkładu. Opóźnić ładowanie, jeśli to konieczne; wkład czujnika pozostanie stabilny w temperaturze 37 °C wewnątrz instrumentu.</li>
	<li>Zakończ badanie po zakończeniu ostatniego cyklu pomiarowego po wstrzyknięciu do portu D. Natychmiast przejdź do normalizacji po analizie i analizie danych.</li>
</ol>
8. Przygotowanie płytek komórkowych do analizatora strumienia zewnętrznego
<ol>
	<li>Rozpocznij przygotowanie płytki komórkowej natychmiast po umieszczeniu wkładu czujnika do analizatora w celu kalibracji. Do każdej dołki zawierającej komórki adherentne dodaj 700 μL buforu 1x MAS. Inkubuj w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 1 minutę.</li>
	<li>Ostrożnie zasysaj bufor, nie naruszając przyłączonych komórek. Powtarzaj proces mycia przez co najmniej 3 x 1 minutę, aby usunąć pozostałe medium hodowlane i zakończ wszystkie płukania w ciągu 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 50 μL bufora MAS 1x do wyznaczonej studni tła (bez komórek), aby ustanowić wizualną referencję objętościową.</li>
	<li>Aspiruj bufor z odwiertów eksperymentalnych, pozostawiając około 50 μL buforu resztkowego w każdym odwiercie.</li>
	<li>Inkubuj płytkę w 37 °C w kąpieli wodnej, utrzymując ją nad powierzchnią wody, aby zapobiec parowaniu. Utrzymuj temperaturę 37 °C przez 10 minut (maksymalnie 20 minut) przed załadunkiem.</li>
	<li>Bezpośrednio przed załadowaniem płyty należy dodać 450 μL buforu 1x MAS zawierającego odpowiednie podłoża do każdego otworu, aby uzyskać końcową objętość 500 μL.</li>
	<li>Włóż płytkę do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.</li>
</ol>
9. Koniec analizy analizy i testowania danych
<ol>
	<li>Po zakończeniu pracy wyjmij płytkę komórkową i wkład czujnika z analizatora.</li>
	<li>Normalizuj wartości OCR na odwiert, używając ilościowej ilościowej ilościowości białka lub całkowitej liczby komórek. Komórki lizy z buforem RIPA i ilościowo określają całkowite białko za pomocą testu Bradforda lub innego spektrofotometrycznego testu białkowego.</li>
	<li>Normalizuj wartości OCR za pomocą oprogramowania analitycznego i eksportuj dane w razie potrzeby.</li>
	<li>Stosuj następujące kryteria akceptacji: potwierdzenie stabilności OCR na poziomie wyjściowym (dryf ≤15% w dwóch kolejnych cyklach pomiarowych) oraz potwierdzenie redukcji OCR o ≥60% po zastrzyku z rotenonu, oligomycyny lub antymycyny A.</li>
	<li>Wyklucz przebiegi, które nie spełniają tych kryteriów, i w razie potrzeby ponownie optymalizuj stężenie przepuszczalnika lub gęstość zasiewów komórek.</li>
</ol>
10. Eksport wyników
<ol>
	<li>Włóż pendrive do instrumentu.</li>
	<li>Wyeksportuj dane z testu.</li>
</ol>
11. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania instrumentów.</li>
	<li>Eksportuj przetworzone dane w formatach zgodnych z wybranym oprogramowaniem analitycznym do dalszej analizy i wizualizacji.</li>
</ol>

<ol><li>Yin, Y., Shen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+methods+in+mitochondrial+research+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Common methods in mitochondrial research (review).</a> Int J Mol Med. 50 (4), 148(2022).</li>
<li>Walsh, M. A., Musci, R. V., Jacobs, R. A., Hamilton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+perspective+on+how+to+develop%2C+implement%2C+execute%2C+and+reproduce+high-resolution+respirometry+experiments%3A+the+physiologist%27s+guide+to+an+Oroboros+O2k%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A practical perspective on how to develop, implement, execute, and reproduce high-resolution respirometry experiments: the physiologist's guide to an Oroboros O2k.</a> FASEB J. 37 (12), e23280(2023).</li>
<li>Severinghaus, J. W., Astrup, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+blood+gas+analysis.+IV.+Leland+Clark%27s+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Monit%22%5BJournal%5D)">History of blood gas analysis. IV. Leland Clark's oxygen electrode.</a> J Clin Monit. 2 (2), 125-139 (1986).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Drug-induced+mitochondrial+dysfunction%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Drug-induced mitochondrial dysfunction. , 325-352 (2008).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+assay+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+cell+mito+stress+test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 cell mito stress test.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Subczynski, W. K., Pasenkiewicz-Gierula, M., Widomska, J., Mainali, L., Raguz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cholesterol%2Flow+cholesterol%3A+effects+in+biological+membranes%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">High cholesterol/low cholesterol: effects in biological membranes: a review.</a> Cell Biochem Biophys. 75 (3-4), 369-385 (2017).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Fan, H. Y., Heerklotz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+does+not+flip+across+cholesterol-poor+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Digitonin does not flip across cholesterol-poor membranes.</a> J Colloid Interface Sci. 504, 283-293 (2017).</li>
<li>Sabbir, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+receptor+muscarinic+1+co-localized+with+mitochondria+in+cultured+dorsal+root+ganglion+neurons%2C+and+its+deletion+disrupted+mitochondrial+ultrastructure+in+peripheral+neurons%3A+implications+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Cholinergic receptor muscarinic 1 co-localized with mitochondria in cultured dorsal root ganglion neurons, and its deletion disrupted mitochondrial ultrastructure in peripheral neurons: implications in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 98 (1), 247-264 (2024).</li>
<li>Sabbir, M. G., Swanson, M., Speth, R. C., Albensi, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+versus+cortical+deletion+of+cholinergic+receptor+muscarinic+1+in+mice+differentially+affects+post-translational+modifications+and+supramolecular+assembly+of+respiratory+chain-associated+proteins%2C+mitochondrial+ultrastructure%2C+and+respiration%3A+implications+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal versus cortical deletion of cholinergic receptor muscarinic 1 in mice differentially affects post-translational modifications and supramolecular assembly of respiratory chain-associated proteins, mitochondrial ultrastructure, and respiration: implications in Alzheimer's disease.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1100854(2023).</li>
<li>Sabbir, M. G., Swanson, M., Albensi, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cholinergic+receptor+muscarinic+1+impairs+cortical+mitochondrial+structure+and+function%3A+implications+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cholinergic receptor muscarinic 1 impairs cortical mitochondrial structure and function: implications in Alzheimer's disease.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1158604(2023).</li>
<li>Sabbir, M. G., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+antagonists+activate+ERK-CREB+signaling+to+augment+neurite+outgrowth+of+adult+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor antagonists activate ERK-CREB signaling to augment neurite outgrowth of adult sensory neurons.</a> Neuropharmacology. 143, 268-281 (2018).</li>
<li>Sabbir, M. G., Taylor, C. G., Zahradka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAMKK2+regulates+mitochondrial+function+by+controlling+succinate+dehydrogenase+expression%2C+post-translational+modification%2C+megacomplex+assembly%2C+and+activity+in+a+cell-type-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">CAMKK2 regulates mitochondrial function by controlling succinate dehydrogenase expression, post-translational modification, megacomplex assembly, and activity in a cell-type-specific manner.</a> Cell Commun Signal. 19 (1), 98(2021).</li>
<li>Sabbir, M. G., Calcutt, N. A., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+type+1+receptor+activity+constrains+neurite+outgrowth+by+inhibiting+microtubule+polymerization+and+mitochondrial+trafficking+in+adult+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine type 1 receptor activity constrains neurite outgrowth by inhibiting microtubule polymerization and mitochondrial trafficking in adult sensory neurons.</a> Front Neurosci. 12, 402(2018).</li>
<li>Facino, R. M., Carini, M., Stefani, R., Aldini, G., Saibene, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-elastase+and+anti-hyaluronidase+activities+of+saponins+and+sapogenins+from+Hedera+helix%2C+Aesculus+hippocastanum%2C+and+Ruscus+aculeatus%3A+factors+contributing+to+their+efficacy+in+the+treatment+of+venous+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+%28Weinheim%29%22%5BJournal%5D)">Anti-elastase and anti-hyaluronidase activities of saponins and sapogenins from Hedera helix, Aesculus hippocastanum, and Ruscus aculeatus: factors contributing to their efficacy in the treatment of venous insufficiency.</a> Arch Pharm (Weinheim). 328 (10), 720-724 (1995).</li>
<li>Dervishi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterols+govern+membrane+susceptibility+to+saponin-induced+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sterols govern membrane susceptibility to saponin-induced lysis.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Mhada, M., Metougui, M. L., El Hazzam, K., El Kacimi, K., Yasri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+of+saponins%2C+minerals+and+total+phenolic+compounds+due+to+processing+and+cooking+of+quinoa+%28Chenopodium+quinoa+Willd.%29+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Variations of saponins, minerals and total phenolic compounds due to processing and cooking of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds.</a> Foods. 9 (5), 660(2020).</li>
<li>Fasciani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+the+prototypical+M2+muscarinic+receptor+localizes+to+the+mitochondria+and+regulates+cell+respiration+under+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of the prototypical M2 muscarinic receptor localizes to the mitochondria and regulates cell respiration under stress conditions.</a> PLoS Biol. 22 (4), e3002582(2024).</li>
<li>Skok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+nicotinic+acetylcholine+receptors%3A+mechanisms+of+functioning+and+biological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial nicotinic acetylcholine receptors: mechanisms of functioning and biological significance.</a> Int J Biochem Cell Biol. 143, 106138(2022).</li>
<li>Felmlee, M. A., Jones, R. S., Rodriguez-Cruz, V., Follman, K. E., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocarboxylate+transporters+%28SLC16%29%3A+function%2C+regulation%2C+and+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Monocarboxylate transporters (SLC16): function, regulation, and role in health and disease.</a> Pharmacol Rev. 72 (2), 466-485 (2020).</li>
<li>Wohlrab, C., Phillips, E., Dachs, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+transporters+in+cancer%3A+current+understanding+and+gaps+in+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Vitamin C transporters in cancer: current understanding and gaps in knowledge.</a> Front Oncol. 7, 74(2017).</li>
<li>Rovini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-VDAC+interaction%3A+molecular+basis+for+mitochondrial+dysfunction+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tubulin-VDAC interaction: molecular basis for mitochondrial dysfunction in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> Front Physiol. 10, 671(2019).</li>
<li>Heuck, A. P., Moe, P. C., Johnson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholesterol-dependent+cytolysin+family+of+gram-positive+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cholesterol-dependent cytolysin family of gram-positive bacterial toxins.</a> Subcell Biochem. 51, 551-577 (2010).</li>
<li>Murase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytolysin+A+%28ClyA%29%3A+a+bacterial+virulence+factor+with+potential+applications+in+nanopore+technology%2C+vaccine+development%2C+and+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cytolysin A (ClyA): a bacterial virulence factor with potential applications in nanopore technology, vaccine development, and tumor therapy.</a> Toxins (Basel). 14 (2), 107(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Niniejsze badanie wprowadza szybki i efektywny kosztowo protokół oceny modulacji OXPHOS za pośrednictwem ligandów muskarynowych w hodowlowanych komórkach neuroblastoma. Dzięki zastosowaniu selektywnej przepuszczalności membrany plazmatycznej digitoniny w połączeniu z określonymi parami substrat-inhibitor umożliwiliśmy ukierunkowane dostarczanie substratów metabolicznych, takich jak sukcynian, bezpośrednio do mitochondriów in situ. To podejście przezwycięża ograniczenia nienaruszonych błon komórkowych, które zazw...

Nieprawidłowości lub przeprogramowanie metabolizmu energii mitochondrialnej są kluczowe dla szerokiego spektrum zaburzeń, w tym neurodegeneracji, nowotworów, chorób zapalnych, schorzeń kardiometabolicznych oraz różnych zaburzeń genetycznych. Aby lepiej zrozumieć rolę metabolizmu mitochondrialnego w patogenezie chorób, opracowano kilka strategii analitycznych. Obejmują one pomiary tempa zużyciaO2 (OCR), tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), ilościowości ATP, wykorzystania substratów, profilowanie lub analizę metabolitów cyklu Krebsa oraz śledzenie izotopów1. Wśród tych technik OCR pełni rolę kluczowego wskaźnika oddychania mitochondrialnego i można go oceniać za pomocą instrumentów takich jak wysokorozdzielcza respirometria (HRR; np. Oroboros O2k)2, elektroda typu Clark czy analizator strumienia zewnętrznego
System Oroboros O2k mierzy stężenieO2 w szczelnej komorze za pomocą polarograficznego czujnika Clark O2 (POS)3,4,5 i jest odpowiedni dla próbek takich jak izolowane mitochondria, komórki przepuszczalne oraz homogenity tkankowe. Składa się z katody ze złota/platyny, anody srebrnej oraz zbiornika elektrolitowego KCl, oddzielonych od próbkiprzepuszczalną i chemicznie odporną na fluorację etylen-propylenową o pojemności 25 μm, odporną chemicznie membraną z fluorowanego etylenpropylenu (FEP). Elektroda typu Clark3 pracuje również w zamkniętej komorze, wykrywając zmiany stężeniaO2 za pomocą elektrody czułej naO2, i jest powszechnie stosowana do izolowanych mitochondriów lub zawiesin komórkowych. Dla porównania, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego ilościowo ilościowo określa OCR i ECAR w żywych komórkach przylegających lub izolowanych mitochondriach za pomocą czujników fluorescencjowych wbudowanych w mikropłytki, co umożliwia wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne. Praktyczną zaletą platformy analizatora strumienia zewnętrznego jest zautomatyzowana, wieloparametryczna ocena równolegle dla wielu warunków, podczas gdy systemy zamkniętokomorowe (np. elektrody typu HRR lub Clark) zazwyczaj zapewniają niższą przepustowość i wymagają większej obsługi ręcznej.
Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest szczególnie przydatny do oceny funkcji mitochondriów w nienaruszonych komórek przylegających lub komórkach zawiesin, które osadzają się na dole mikropłytki. W testach z wykorzystaniem nienaruszonych komórek adherentnych metamorfozę mitochondrialną można profilować za pomocą substratów takich jak glukoza lub pirokrowinian6. Alternatywnie, testy wykorzystujące niewielkie ilości wzbogaconych frakcji mitochondrialnych pozwalają na sekwencyjne pomiary oddechu bazalnego, oddychania stymulowanego ADP (stan 3), oddechu spoczynkowego (stan 4) oraz oddychania stymulowanego przez niespojliwe z wykorzystaniem kombinacji substratów i inhibitorów7. Jednak w nienaruszonych układach komórkowych metabolity cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA), które nie są przepuszczalne dla komórek, nie mogą być użyte do bezpośredniej oceny ich metabolizmu. Natomiast izolowane mitochondria pozwalają na wykorzystanie takich metabolitów ze względu na brak barier z błony plazmatycznej. Analiza izolowanego wzbogaconego podejścia mitochondrialnego ma ograniczenia: struktura mitochondriów może ulegać zmianom podczas izolacji, a czynniki cytosolowe wpływające na metabolizm mitochondrialny i transport metabolitów są ograniczone lub nieobecne. W związku z tym selektywne metody permeabilizacji są często stosowane jako kompromis, który pozwala zachować elementy architektury komórkowej, jednocześnie umożliwiając kontrolowany dostęp do mitochondriów. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z wykorzystaniem nienaruszonych komórek lub izolowanych mitochondriów do testów metabolicznych, protokół ten opisuje metodę permeabilizacji komórek adherentnego neuroblastoma (BE(2)-C) za pomocą digitoniny. Takie podejście ułatwia import metabolitów, które nie były przenikliwe do komórek, przez błonę plazmatyczną, jednocześnie utrzymując funkcjonalne odpowiedzi mitochondrialne na określone substraty i inhibitory.
Selektywność digitoniny opiera się na różnicach w składzie lipidów błonowych: błona plazmatyczna jest bogata w cholesterol, podczas gdy błony mitochondrialne — szczególnie błona mitochondrialna wewnętrzna — zawierają bardzo mało cholesterolu. W niskich stężeniach digitonina (lub saponina) selektywnie i całkowicie przepuszcza błonę plazmatową ze względu na wysoką zawartość cholesterolu, podczas gdy błony mitochondrialne są dotknięte tylko przy wyższych stężeniach 9,10. Cyfrytonina wiąże się z cholesterolem i tworzy pory w błonie plazmatycznej, umożliwiając małym cząsteczkom, takim jak pośrednie składniki cyklu TCA, dostanie się do cytosolu bez zakłócania struktury lub funkcji mitochondriów, jeśli jest odpowiednio optymalizowana. To podejście najlepiej sprawdza się w komórkach hodowanych, które można powtórnie pokrywać jako przylegające monowarstwy w mikropłytce analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i wymaga empirycznej miareczki stężenia digitoniny dla każdego typu komórki i gęstości zasiew. Wskaźniki operacyjne zachowanej integralności mitochondrialnej obejmują silne, na inhibitory wrażliwe odpowiedzi OCR (np. oczekiwane spadki przy rotenonie/antymycynie A oraz nienaruszone oddychanie sterowane kompleksem IV przy ascorbate/TMPD), a także brak zapadania się OCR, które sygnalizowałoby nadprzepuszczalność. Dlatego optymalizacja digitoniny powinna być przeprowadzona przed porównaniami eksperymentalnymi i powtarzana za każdym razem, gdy zmieniają się warunki hodowli lub gęstość komórek. Ponadto optymalne stężenie digitoniny różni się w zależności od typu komórki i musi być empirycznie określone, aby ustanowić okno permeabilizacji umożliwiające wejście substratów nieprzepustnych (np. sukcynanu), przy jednoczesnym zachowaniu funkcji mitochondriów wrażliwych na inhibitory. W niniejszym badaniu ilustrujemy tę zasadę, optymalizując digitoninę nie tylko w komórkach BE(2)-C, ale także w komórkach HEK293 oraz pierwotnych neuronach grzbietowych korzenia szczura (DRG).
Protokół ten został zademonstrowany przy użyciu komórek neuroblastoma BE(2)-C, które pierwotnie zostały wyizolowane z mózgu męskiego pacjenta z neuroblastomą. Komórki BE(2)-C wyrażają różne receptory muscarinowe, szczególnie receptor cholinergiczny muskarynowy typu 1 (CHRM1). W naszych wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że CHRM1 jest związany z mitochondriami zarówno w ciałach komórkowych, jak i neuritach hodowanych neuronów zwojowych grzbietowych szczurów, a takżew komórkach HEK293 transfekowanych przez CHRM1. Ponadto genetyczne usuwanie Chrm1 u myszy zmienia wiele aspektów struktury i funkcji mitochondriów12,13. Dlatego zakładamy, że komórki BE(2)-C mogą być wykorzystane do badania modulacyjnych wpływów ligandów muskarynowych na funkcjonowanie OXPHOS. W tej demonstracji badaliśmy wpływ środków muskarynowych — w tym agonistycznej acetylocholiny, stronniczego antagonisty pirenzepiny14 oraz antagonisty atropiny — na oddychanie mitochondrialne w obecności sukcynianu lub pirosiernianu/malata jako substratów oraz porównaliśmy ich wpływ.

<table><tbody><tr><td>Chlorek acetylocholiny</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6625</td><td>Agonista muskarinowy</td></tr><tr><td>ADP</td><td>MP Biomedicals, Inc</td><td>ICN19014901</td><td>Akceptor elektronów, podłoże do syntezy ATP.</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>AAJ63522MA</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hamuje kompleks mitochondrialny III</td></tr><tr><td>Atropina</td><td>MilliporeSigma</td><td>1044990</td><td>Muskaryński antagonista</td></tr><tr><td>Komórki Be2C</td><td>Kolekcja Amerykańskiej Kultury Typowej</td><td>CRL-2268</td><td>Komórka neuroblastu wyizolowana z mózgu męskiego pacjenta z neuroblastomią, wyraża receptor mięśniowy</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>MilliporeSigma</td><td>D141</td><td>Łagodny detergent, przepuszczalnik błony.</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>AA3334236</td><td>Niemetabolizowalny alkohol cukrowy, stosowany do stabilizacji osmotycznej i ochrony błony</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E0396</td><td>Chelacja wapnia zapobiega aktywacji proteaz zależnych od wapnia oraz innych enzymów, które mogłyby degradować białka mitochondrialne.</td></tr><tr><td>BSA bez kwasów tłuszczowych</td><td>MilliporeSigma</td><td>126575</td><td>Zapobiega niekontrolowanemu działaniu kwasów tłuszczowych, stabilizuje mitochondria</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Cayman Chemical</td><td>NC0904863</td><td>Protonofor i rozwiązujący utleniającą fosforylację w mitochondriach</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>391340</td><td>Buforowanie pH, zgodność z funkcją mitochondriów</td></tr><tr><td>L-Ascorbate</td><td>TCI America</td><td>A053925G</td><td>Podłoże cyklu TCA pośredniego, podłoże OXPHOS</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>MilliporeSigma</td><td>M8266</td><td>Dla równowagi jonowej wsparcie aktywności enzymatycznej</td></tr><tr><td>N1,N1,N1,N1-tetrametylo-1,4-fenylendiamina (TMPD)</td><td></td><td></td><td>Donor elektronów do cytochromu c, ocena funkcji zespolonej IV poprzez pominięcie kompleksów I i II, TMPD/askorbat umożliwia bezpośredni pomiar zużycia tlenu zależnego od kompleksu IV</td></tr><tr><td>Oligomicyna</td><td>MilliporeSigma</td><td>1404-19-9</td><td>Hamuje syntezę ATP mitochondrialnego, kompleks V</td></tr><tr><td>Pirenzepinowy dichlorek</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7412</td><td>Agonista muskaryniczny o tendencji</td></tr><tr><td>Kwas piruwinowy</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td>AC132155000</td><td>Podłoże cyklu TCA</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MilliporeSigma</td><td>557368</td><td>Hamuje kompleks mitochondrialny I</td></tr><tr><td>Seahorse XF24 V7 Mikropłyty do kultury komórek PS</td><td>Agilent</td><td>102340-100</td><td>Mikropłyty hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFe24</td><td>Agilent</td><td>S7801BR</td><td>Analizatory Agilent Seahorse XFe24 mierzą tempo zużycia tlenu (OCR) oraz szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) komórek żywych w formacie płytki 24-dołkowej.</td></tr><tr><td>Kwas succynowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>AC158742500</td><td>Podłoże cyklu TCA pośredniego, podłoże OXPHOS</td></tr><tr><td>Bufor kalibracyjny kartridży sensora XFe24</td><td>Agilent</td><td>102340100</td><td>pH buforowe PBS 7,2</td></tr><tr><td>Wkłady sensorowe XFe24</td><td>Agilent</td><td>102340-100</td><td>czujnik do pomiarów OCR i ECAR</td></tr></tbody></table>

modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma be(2)-c z cyfrytoninami

Cholinergic Ligand&#8211;dependent Modulation of Oxidative Phosphorylation Coupling in Digitonin-permeabilized BE(2)-C Neuroblastoma Cells

Celem tego badania było ocenenie funkcji fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w komórkach hodowanych przy użyciu określonych kombinacji substrat–inhibitor, przy jednoczesnym zachowaniu struktury komórkowej i kontekstu cytosolowego utraconego w izolowanych przygotowaniach mitochondrialnych. Ponieważ nienaruszone komórki są słabo przepuszczalne dla kilku pośrednich cyklów Krebsa, bezpośrednia ocena oddychania wspieranego przez podłoże przez specyficzne punkty wejścia łańcucha transportu elektronów (ETC) jest ograniczona. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy selektywną permeabilizację błony plazmatycznej za pośrednictwem digitoniny oraz przeprowadziliśmy sprzężenie i przepływ elektronów na podstawie analizatora strumienia zewnętrznego w komórkach neuroblastoma BE(2)-C. Aby określić zależność od typu komórki, digitoninę empirycznie zmierzono w komórkach HEK293 oraz w neuronach podstawowych szczurów grzbietowych korzeni (DRG), wykorzystując sukcynianu + rotenon do izolacji oddychania wywołanego kompleksem II–IV.
Oddychanie wspierane suktynacjami z inhibicją kompleksu I wykazało zwiększone zużycie tlenu napędzanego kompleksem II–IV (O₂) w komórkach przepustnych w porównaniu z komórkami nieprzepuszczalnymi, co odpowiadało lepszemu dostępowi substratu nieprzepuszczalnego do mitochondriów. Natomiast oddychanie wspierane przez substraty wchodzące przez endogenne szlaki transportowe (np. pirosurowat/malat) wykazało mniejsze różnice między warunkami. Korzystając z tej platformy do testowania ligandów muskarynicznych, zaobserwowaliśmy różnice w zużyciu O₂ powiązanych z agonistami w teście sprzężenia, podczas gdy test przepływu elektronów wykazał minimalne efekty związane z ligandami w testowanych warunkach. Wyniki te wskazują, że wykrywalne efekty ligandów były bardziej widoczne na poziomie stanów oddechowych zdefiniowanych przez sprzężenie niż maksymalna zdolność transferu elektronów. Ogólnie rzecz biorąc, selektywna permeabilizacja zwiększa dostępność substratów w bioenergetycznych testach komórek hodowlanych i umożliwia analizę farmakologicznej modulacji oddychania mitochondrialnego.

Optymalizacja stężenia digitoniny dla permeabilizacji komórek BE(2) C w teście sprzężenia Na początku tego protokołu ustandaryzowaliśmy optymalne stężenie cyfrytoniny wymagane do skutecznej permeabilizacji komórek bez naruszania oddychania mitochondrialnego. W tym protokole badaliśmy stężenia początkowe 5 μM i 10 μM digitoniny oraz przeprowadziliśmy test sprzężenia. Test ten ocenia stopień sprzężenia między ETC a mechanizmem OXPHOS, pozwalając rozróżnić oddychanie napędzane przez ETC- i OXPHOS. Rote...

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

The objective of this study was to assess oxidative phosphorylation (OXPHOS) function in cultured cells using defined substrate&#8211;inhibitor ...

Głównym celem tego eksperymentu jest pokazanie metody oceny bioenergetyczności mitochondrialnej w nienaruszonych hodowanych komórkach neuroblastoma przy użyciu selektywnej permeabilizacji i kombinacji inhibitorów substratów. Tradycyjnie oddech mitochondrialny ocenia się za pomocą instrumentów takich jak wysokorozdzielczy respirometr Oroboros O2K, elektroda tlenowa typu Clark oraz analizator Seahorse XF. Tradycyjne metody opierające się na izolowanej lub wzbogaconej frakcji mitochondrialnej z tkanek lub komórek często naruszają strukturę mitochondriów.Na przykład ten obraz mitochondriów odizolowanych z kory myszy z mikroskopu elektronowego transmitującego ujawnia wyraźny kontrast w integralności strukturalnej w zależności od tego, czy mitochondria są otoczone w terminalach presynaptycznych, czy nie. Mitochondria pozostające zamknięte w zakończeniach przedsynaptycznych wyglądają na strukturalnie nienaruszone, co wskazują cyjanowe strzałki na tym zdjęciu. Natomiast mitochondria nieotoczone lub pozbawione otaczającej struktury błoniastej często wyglądają zdeformowane, co przedstawiają żółte strzałki.Analizator Seahorse Flex jest powszechnie używany do badania bioenergetyki mitochondriów zarówno w komórkach hodowanych, jak i w izolowanych mitochondriach. W analizie komórek hodowanych zachowuje się architektura komórkowa i sieci sygnalizacyjne. Jednak błona plazmatyczna nienaruszonych komórek jest nieprzepuszczalna dla wielu substratów cyklu kwasu trikarboksylowego.Ogranicza to zakres analizy metabolicznej w porównaniu z izolowanymi mitochondriami, które nie mają bariery błony plazmatycznej, ale często wykazują artefakty strukturalne. W związku z tym oba systemy mają swoje wrodzone ograniczenia. Przedstawiona tutaj technika wykorzystuje fakt, że błona plazmatyczna jest bogata w cholesterol, podczas gdy błona mitochondrialna zawiera go bardzo niewiele.Stosując detergent wiążący cholesterol, taki jak digitonina, możemy selektywnie przepuszczać błonę plazmatyczną, pozostawiając błonę mitochondrialną nienaruszoną. Takie podejście pozwala na kontrolowane wprowadzanie substratów mitochondrialnych i inhibitorów do komórki bez naruszania integralności organelli. Dzięki temu technika ta umożliwia analizę funkcjonalną mitochondriów w kontekście nienaruszonych komórek, łącząc zalety architektury całej komórki z dostępnością izolowanych testów mitochondrialnych.Rozpocznij eksperyment od subkonfluentnej miski hodowlowej komórek. Delikatnie umyj komórki sterylnym buforem fosforanowym Dodaj odpowiednią ilość roztworu tritonowego, aby równomiernie pokryć monowarstwę komórki. Po wyszywaniu wyjmij miskę i delikatnie stukaj lub potrząśnij nią poziomo, aby pomóc wypchnąć komórki.Używając pipety picetolitrowej i kontrolera pipety, kilkakrotnie podnieś i opuszczaj zawiesinę komórki, aby rozbić grudki i uzyskać zawiesinę pojedynczą. Zbadaj zawiesinę komórkową pod mikroskopem, aby potwierdzić jednolitą zawiesinę pojedynczą. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.Dostosuj stężenie komórek tak, aby 100 mikrolitrów zawiesiny zawierało około 10 000 komórek. Ostrożnie przelać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płyty testowej Seahorse XF. Zostaw jedną studnię pustą, aby służyła jako kontrola tła podczas badania.Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórek przez dwie do trzech godzin, aby komórki mogły przykleić się do dna dołka. Po przyłączeniu komórek delikatnie dodaj 300 mikrolitrów podłoża do każdego dołku. Wróć płytkę do inkubatora i inkubuj przez noc, aby komórki mogły się ustabilizować i rosnąć.Upewnij się, że komórki tworzą jednolitą monowarstwę na dnie każdego dołka. Unikaj przeludnienia. Komórki powinny być zbieżne, ale nie nadmiernie zbiegające, aby zapewnić optymalną wydajność testu.Noc przed eksperymentem nawilż wkład sensorowy XFp 24, dodając do każdego dołku po jednym ml bufora kalibracyjnego. Alternatywnie możesz użyć soli fosforanowej z buforem fizjologicznym, pH 7,4. Zostaw wkład w temperaturze pokojowej na noc na łóżku.Inkubacja w inkubatorze bez COT w temperaturze 37 stopni Celsjusza nie jest wymagana, ponieważ wkład podczas ładowania dochodzi do temperatury pokojowej. Zwołaj wszystkie mrożone roztwory i 2x bufor mikroglijowy w temperaturze pokojowej. Sprawdź pH, powinno wynosić 7,4.Dostosuj w razie potrzeby. Przygotuj wszystkie podłoża i roztwory do wstrzykiwania oraz ponownie sprawdź pH. Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie do czasu użycia.Przygotuj rurki do jedzenia oznaczone A, B, C i D do roztworów portów wtrysku wkładów sensorowych. Najlepiej jest przygotować roztwory zawierające odpowiednie inhibitory lub substraty dla każdego portu. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie załaduj 50 mikrolitrów każdego roztworu portu wtryskowego, od A do D.Uruchomić bioanalizator Seahorse na godzinę do dwóch przed eksperymentem, aby umożliwić inkubatorowi stabilizację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz każdą studnię i grupuj zgodnie z projektem eksperymentalnym oraz wytycznymi Wave Desktop 2.6. Zaprogramuj bioanalizator pod odpowiednią mieszankę, wagę i cykl pomiarowy.Zobacz tabelę 8 dla odniesienia. Ważne jest, aby wyłączyć opcję równowagi na początku cyklu pomiarowego. Trzymanie go na nim niepotrzebnie wydłuża eksperyment i może wyczerpać podłoża.Uruchomić urządzenie Maszyna najpierw skalibruje wkład sensora, co zajmuje około 15 minut. Zacznij przygotowywać płytkę komórki zaraz po umieszczeniu wkładu sensora w kalibrację. Ostrożnie aspiruj bufor, nie naruszając komórek, przy około 700 mikrolitrach 1x buforu mitochondrialnego do każdej dołki z przylegającymi komórkami, i pozwól płytce stać przez minutę, aby się wyrównała.Ostrożnie zasysaj bufor z każdej dołki, nie naruszając komórek przyczepnych. Powtórz proces pralki trzy razy, aby upewnić się, że medium jest kompletne. Równolegle dodaj 50 mikrolitrów buforu mitochondrialnego do studni tła bez komórek.Używaj łąkotki jako wizualnego punktu odniesienia dla spójności objętości. Ostrożnie zasysaj bufor z dołków zawierających komórki, pozostawiając około 50 mikrolitrów do utrzymania nawodnienia komórek. Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, albo w kąpieli wodnej, utrzymując ją nad powierzchnią wody, albo w inkubatorze niestalowym z nasyconą atmosferą, aby zapobiec parowaniu.Tuż przed załadowaniem do analizatora dodaj 450 mikrolitrów podgrzanego buforu mitochondrialnego zawierającego substraty, inhibitory lub leki, w razie potrzeby, do każdego dołku, co daje łączną objętość do 500 mikrolitrów. Płytka jest teraz gotowa do przeprowadzenia testu za pomocą skalibrowanego nakładu czujnika w bioanalizatorze Seahorse. Najpierw wykonujemy test sprzężenia, aby zbadać stopień sprzężenia między systemem transportu elektronów a fosforylacją oksydacyjną.Test sprzężenia pomaga odróżnić funkcję mitochondriów od dysfunkcji. Na tym diagramie mitochondrialnego systemu transportu elektronów pokazujemy złożone inhibitory specyficzne jeden, trzy i pięć wraz z węzłami różnych substratów, takich jak pirocian czy malat i sukcynan, przekazują elektrony do systemu. Ta wizualizacja jest przydatna do zrozumienia, jak działa test oraz roli różnych substratów i inhibitorów.Najpierw badamy dwa różne stężenia digitoniny: pięć mikromolowych i dziesięciomikromolowe, pod kątem ich skuteczności w ułatwianiu transportu elektronów przez błonę plazmatyczną oraz umożliwianiu testu sprzężenia. W tym badaniu poziom sprzężenia oddechowego oceniano poprzez sekwencyjne pomiary tempa zużycia tlenu w obecności sukcynianu jako substratu oraz rotenonu jako inhibitora złożonego jednego czynnika. ADP, oligomycyna, FCCP i antymycyna A były następnie kolejno wstrzykiwane, a pomiary OCR rejestrowano po każdym zastrzyku.Lewy panel przedstawia wykresy liniowe przedstawiające kinetyczne napięcie tlenu w mikrokomorze przejściowej. Zazwyczaj wartość ta powinna pozostawać między 100 a 200 milimetrami rtęci, aby zapewnić wykrywanie w zakresie dynamicznym czujnika. Te zbiory danych zostały wygenerowane w trybie punkt-punkt w oprogramowaniu Agilent Wave, które wyświetla OCR jako serię częstotliwości w okresie pomiarowym, umożliwiając wizualizację dynamicznych zmian, w szczególności 10-mikromolowych digitonin zwiększonego transportu sukcynatów w porównaniu do pięciu mikrotrzonowców, co skutkuje niższym napięciem tlenu w mikrokomorze i odpowiednio wyższym pobieraniem tlenu.Wykres danych uzyskanych z tych eksperymentów wykazał, że oddech podstawowy pośredniczony przez kompleksy dwa do czterech był istotnie wyższy przy 10 mikromolowych digitoninach w porównaniu do pięciu mikromolowych, co wskazuje na bardziej efektywny transport sukcynianów przez przepuszczalną błonę plazmatyczną przy wyższym stężeniu. Na podstawie tej obserwacji, biorąc pod uwagę, że 10 mikromolowych digitonin zapewniało optymalną permeabilizację, następnie zmniejszyliśmy liczbę komórek do 20 000 komórek na jamkę, aby obniżyć oddech bazalny. Ta korekta zapewniła, że każde wzmocnienie oddechowe wywołane lekami lub substratami pozostawało w zakresie dynamicznej detekcji systemu.Po optymalizacji stężenia i liczby komórek digitoniny przeprowadzono kolejny test sprzężenia, aby ocenić wpływ agonistów i antagonistów muskarynowych na oddychanie mitochondrialne. Jednym z ważnych odkryć z tego zestawu eksperymentów było to, że w komórkach nieleczonej digitoniną oddech podstawowy, pośredniczony przez kompleksy zwiększone sukcynianami od dwóch do czterech, a także oddech stan-3 i stan-3u, był istotnie zmniejszony. Wskazuje to, że sukcynian nie został przetransportowany do komórki w warunkach nieprzepuszczalnych.Wykres danych z wielu niezależnych eksperymentów wykazał, że antagonista muscarinowy atropina znacząco zmniejszał oddychanie podstawne pośredniczone przez kompleksy dwa do czterech w komórkach neuroblastoma w porównaniu do agonisty muskarynowego acetylocholiny, który utrzymywał wysoki poziom oddychania. Ponadto zarówno oddech stanu-3, jak i stanu-3u był istotnie niższy w komórkach nieprzepuszczalnych niż w komórkach przepuszczalnych, co podkreśla skuteczność digitoniny w selektywnym przepuszczaniu błony plazmatycznej bez upośledzenia funkcji mitochondriów. Test przepływu elektronów ocenia sekwencyjny transfer elektronów do mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, pomagając zidentyfikować mechanizmy dysfunkcji mitochondrialnej lub modulacji.W początkowej fazie badania komórki były traktowane pirosurowianem, malianem i FCCP, co wywołało wysoki poziom niesprzężonego oddychania napędzanego kompleksami od pierwszego do czterech. Późniejsze dodanie rotenonu hamowało aktywność kompleksu jeden, zmniejszając oddech bazalny i izolując aktywność kompleksu od drugiego do cztery. Chociaż nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic między warunkami leczonymi lekami a kontrolą, jedną z istotnych obserwacji było to, że oddychanie sterowane przez sukcynanany State-3u było istotnie niższe w komórkach nieprzepuszczalnych, co wskazuje na kluczową rolę digitoniny umożliwiającej wejście sukcynatów do komórki.Podsumowując, protokół ten oferuje wiarygodny sposób badania bioenergetyki mitochondrialnej. Łączy fizjologiczne znaczenie architektury całych komórek z precyzją izolowanych testów mitochondrialnych, umożliwiając kontrolowane dostarczanie substratów i inhibitorów przy zachowaniu integralności organelli. Optymalizując stężenie i gęstość komórek cyfrytoniny, naukowcy mogą uzyskać dokładne i powtarzalne pomiary.To elastyczne podejście jest idealne do badania modulacji funkcji mitochondriów za pośrednictwem receptorów i stanowi potężną platformę do badań nad chorobami oraz odkrywania leków.

cholinergic-liganddependent-modulation-oxidative-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę oceny fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C przy użyciu cyfrytoniny. Technika selektywnej permeabilizacji błony komórkowej umożliwia badanie oddychania mitochondrialnego w kontekście komórkowym.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Przeglądaj więcej filmów