Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Głównym celem tego eksperymentu jest pokazanie metody oceny bioenergetyczności mitochondrialnej w nienaruszonych hodowanych komórkach neuroblastoma przy użyciu selektywnej permeabilizacji i kombinacji inhibitorów substratów. Tradycyjnie oddech mitochondrialny ocenia się za pomocą instrumentów takich jak wysokorozdzielczy respirometr Oroboros O2K, elektroda tlenowa typu Clark oraz analizator Seahorse XF. Tradycyjne metody opierające się na izolowanej lub wzbogaconej frakcji mitochondrialnej z tkanek lub komórek często naruszają strukturę mitochondriów.

Na przykład ten obraz mitochondriów odizolowanych z kory myszy z mikroskopu elektronowego transmitującego ujawnia wyraźny kontrast w integralności strukturalnej w zależności od tego, czy mitochondria są otoczone w terminalach presynaptycznych, czy nie. Mitochondria pozostające zamknięte w zakończeniach przedsynaptycznych wyglądają na strukturalnie nienaruszone, co wskazują cyjanowe strzałki na tym zdjęciu. Natomiast mitochondria nieotoczone lub pozbawione otaczającej struktury błoniastej często wyglądają zdeformowane, co przedstawiają żółte strzałki.

Analizator Seahorse Flex jest powszechnie używany do badania bioenergetyki mitochondriów zarówno w komórkach hodowanych, jak i w izolowanych mitochondriach. W analizie komórek hodowanych zachowuje się architektura komórkowa i sieci sygnalizacyjne. Jednak błona plazmatyczna nienaruszonych komórek jest nieprzepuszczalna dla wielu substratów cyklu kwasu trikarboksylowego.

Ogranicza to zakres analizy metabolicznej w porównaniu z izolowanymi mitochondriami, które nie mają bariery błony plazmatycznej, ale często wykazują artefakty strukturalne. W związku z tym oba systemy mają swoje wrodzone ograniczenia. Przedstawiona tutaj technika wykorzystuje fakt, że błona plazmatyczna jest bogata w cholesterol, podczas gdy błona mitochondrialna zawiera go bardzo niewiele.

Stosując detergent wiążący cholesterol, taki jak digitonina, możemy selektywnie przepuszczać błonę plazmatyczną, pozostawiając błonę mitochondrialną nienaruszoną. Takie podejście pozwala na kontrolowane wprowadzanie substratów mitochondrialnych i inhibitorów do komórki bez naruszania integralności organelli. Dzięki temu technika ta umożliwia analizę funkcjonalną mitochondriów w kontekście nienaruszonych komórek, łącząc zalety architektury całej komórki z dostępnością izolowanych testów mitochondrialnych.

Rozpocznij eksperyment od subkonfluentnej miski hodowlowej komórek. Delikatnie umyj komórki sterylnym buforem fosforanowym Dodaj odpowiednią ilość roztworu tritonowego, aby równomiernie pokryć monowarstwę komórki. Po wyszywaniu wyjmij miskę i delikatnie stukaj lub potrząśnij nią poziomo, aby pomóc wypchnąć komórki.

Używając pipety picetolitrowej i kontrolera pipety, kilkakrotnie podnieś i opuszczaj zawiesinę komórki, aby rozbić grudki i uzyskać zawiesinę pojedynczą. Zbadaj zawiesinę komórkową pod mikroskopem, aby potwierdzić jednolitą zawiesinę pojedynczą. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

Dostosuj stężenie komórek tak, aby 100 mikrolitrów zawiesiny zawierało około 10 000 komórek. Ostrożnie przelać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płyty testowej Seahorse XF. Zostaw jedną studnię pustą, aby służyła jako kontrola tła podczas badania.

Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórek przez dwie do trzech godzin, aby komórki mogły przykleić się do dna dołka. Po przyłączeniu komórek delikatnie dodaj 300 mikrolitrów podłoża do każdego dołku. Wróć płytkę do inkubatora i inkubuj przez noc, aby komórki mogły się ustabilizować i rosnąć.

Upewnij się, że komórki tworzą jednolitą monowarstwę na dnie każdego dołka. Unikaj przeludnienia. Komórki powinny być zbieżne, ale nie nadmiernie zbiegające, aby zapewnić optymalną wydajność testu.

Noc przed eksperymentem nawilż wkład sensorowy XFp 24, dodając do każdego dołku po jednym ml bufora kalibracyjnego. Alternatywnie możesz użyć soli fosforanowej z buforem fizjologicznym, pH 7,4. Zostaw wkład w temperaturze pokojowej na noc na łóżku.

Inkubacja w inkubatorze bez COT w temperaturze 37 stopni Celsjusza nie jest wymagana, ponieważ wkład podczas ładowania dochodzi do temperatury pokojowej. Zwołaj wszystkie mrożone roztwory i 2x bufor mikroglijowy w temperaturze pokojowej. Sprawdź pH, powinno wynosić 7,4.

Dostosuj w razie potrzeby. Przygotuj wszystkie podłoża i roztwory do wstrzykiwania oraz ponownie sprawdź pH. Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie do czasu użycia.

Przygotuj rurki do jedzenia oznaczone A, B, C i D do roztworów portów wtrysku wkładów sensorowych. Najlepiej jest przygotować roztwory zawierające odpowiednie inhibitory lub substraty dla każdego portu. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie załaduj 50 mikrolitrów każdego roztworu portu wtryskowego, od A do D.

Uruchomić bioanalizator Seahorse na godzinę do dwóch przed eksperymentem, aby umożliwić inkubatorowi stabilizację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz każdą studnię i grupuj zgodnie z projektem eksperymentalnym oraz wytycznymi Wave Desktop 2.6. Zaprogramuj bioanalizator pod odpowiednią mieszankę, wagę i cykl pomiarowy.

Zobacz tabelę 8 dla odniesienia. Ważne jest, aby wyłączyć opcję równowagi na początku cyklu pomiarowego. Trzymanie go na nim niepotrzebnie wydłuża eksperyment i może wyczerpać podłoża.

Uruchomić urządzenie Maszyna najpierw skalibruje wkład sensora, co zajmuje około 15 minut. Zacznij przygotowywać płytkę komórki zaraz po umieszczeniu wkładu sensora w kalibrację. Ostrożnie aspiruj bufor, nie naruszając komórek, przy około 700 mikrolitrach 1x buforu mitochondrialnego do każdej dołki z przylegającymi komórkami, i pozwól płytce stać przez minutę, aby się wyrównała.

Ostrożnie zasysaj bufor z każdej dołki, nie naruszając komórek przyczepnych. Powtórz proces pralki trzy razy, aby upewnić się, że medium jest kompletne. Równolegle dodaj 50 mikrolitrów buforu mitochondrialnego do studni tła bez komórek.

Używaj łąkotki jako wizualnego punktu odniesienia dla spójności objętości. Ostrożnie zasysaj bufor z dołków zawierających komórki, pozostawiając około 50 mikrolitrów do utrzymania nawodnienia komórek. Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, albo w kąpieli wodnej, utrzymując ją nad powierzchnią wody, albo w inkubatorze niestalowym z nasyconą atmosferą, aby zapobiec parowaniu.

Tuż przed załadowaniem do analizatora dodaj 450 mikrolitrów podgrzanego buforu mitochondrialnego zawierającego substraty, inhibitory lub leki, w razie potrzeby, do każdego dołku, co daje łączną objętość do 500 mikrolitrów. Płytka jest teraz gotowa do przeprowadzenia testu za pomocą skalibrowanego nakładu czujnika w bioanalizatorze Seahorse. Najpierw wykonujemy test sprzężenia, aby zbadać stopień sprzężenia między systemem transportu elektronów a fosforylacją oksydacyjną.

Test sprzężenia pomaga odróżnić funkcję mitochondriów od dysfunkcji. Na tym diagramie mitochondrialnego systemu transportu elektronów pokazujemy złożone inhibitory specyficzne jeden, trzy i pięć wraz z węzłami różnych substratów, takich jak pirocian czy malat i sukcynan, przekazują elektrony do systemu. Ta wizualizacja jest przydatna do zrozumienia, jak działa test oraz roli różnych substratów i inhibitorów.

Najpierw badamy dwa różne stężenia digitoniny: pięć mikromolowych i dziesięciomikromolowe, pod kątem ich skuteczności w ułatwianiu transportu elektronów przez błonę plazmatyczną oraz umożliwianiu testu sprzężenia. W tym badaniu poziom sprzężenia oddechowego oceniano poprzez sekwencyjne pomiary tempa zużycia tlenu w obecności sukcynianu jako substratu oraz rotenonu jako inhibitora złożonego jednego czynnika. ADP, oligomycyna, FCCP i antymycyna A były następnie kolejno wstrzykiwane, a pomiary OCR rejestrowano po każdym zastrzyku.

Lewy panel przedstawia wykresy liniowe przedstawiające kinetyczne napięcie tlenu w mikrokomorze przejściowej. Zazwyczaj wartość ta powinna pozostawać między 100 a 200 milimetrami rtęci, aby zapewnić wykrywanie w zakresie dynamicznym czujnika. Te zbiory danych zostały wygenerowane w trybie punkt-punkt w oprogramowaniu Agilent Wave, które wyświetla OCR jako serię częstotliwości w okresie pomiarowym, umożliwiając wizualizację dynamicznych zmian, w szczególności 10-mikromolowych digitonin zwiększonego transportu sukcynatów w porównaniu do pięciu mikrotrzonowców, co skutkuje niższym napięciem tlenu w mikrokomorze i odpowiednio wyższym pobieraniem tlenu.

Wykres danych uzyskanych z tych eksperymentów wykazał, że oddech podstawowy pośredniczony przez kompleksy dwa do czterech był istotnie wyższy przy 10 mikromolowych digitoninach w porównaniu do pięciu mikromolowych, co wskazuje na bardziej efektywny transport sukcynianów przez przepuszczalną błonę plazmatyczną przy wyższym stężeniu. Na podstawie tej obserwacji, biorąc pod uwagę, że 10 mikromolowych digitonin zapewniało optymalną permeabilizację, następnie zmniejszyliśmy liczbę komórek do 20 000 komórek na jamkę, aby obniżyć oddech bazalny. Ta korekta zapewniła, że każde wzmocnienie oddechowe wywołane lekami lub substratami pozostawało w zakresie dynamicznej detekcji systemu.

Po optymalizacji stężenia i liczby komórek digitoniny przeprowadzono kolejny test sprzężenia, aby ocenić wpływ agonistów i antagonistów muskarynowych na oddychanie mitochondrialne. Jednym z ważnych odkryć z tego zestawu eksperymentów było to, że w komórkach nieleczonej digitoniną oddech podstawowy, pośredniczony przez kompleksy zwiększone sukcynianami od dwóch do czterech, a także oddech stan-3 i stan-3u, był istotnie zmniejszony. Wskazuje to, że sukcynian nie został przetransportowany do komórki w warunkach nieprzepuszczalnych.

Wykres danych z wielu niezależnych eksperymentów wykazał, że antagonista muscarinowy atropina znacząco zmniejszał oddychanie podstawne pośredniczone przez kompleksy dwa do czterech w komórkach neuroblastoma w porównaniu do agonisty muskarynowego acetylocholiny, który utrzymywał wysoki poziom oddychania. Ponadto zarówno oddech stanu-3, jak i stanu-3u był istotnie niższy w komórkach nieprzepuszczalnych niż w komórkach przepuszczalnych, co podkreśla skuteczność digitoniny w selektywnym przepuszczaniu błony plazmatycznej bez upośledzenia funkcji mitochondriów. Test przepływu elektronów ocenia sekwencyjny transfer elektronów do mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, pomagając zidentyfikować mechanizmy dysfunkcji mitochondrialnej lub modulacji.

W początkowej fazie badania komórki były traktowane pirosurowianem, malianem i FCCP, co wywołało wysoki poziom niesprzężonego oddychania napędzanego kompleksami od pierwszego do czterech. Późniejsze dodanie rotenonu hamowało aktywność kompleksu jeden, zmniejszając oddech bazalny i izolując aktywność kompleksu od drugiego do cztery. Chociaż nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic między warunkami leczonymi lekami a kontrolą, jedną z istotnych obserwacji było to, że oddychanie sterowane przez sukcynanany State-3u było istotnie niższe w komórkach nieprzepuszczalnych, co wskazuje na kluczową rolę digitoniny umożliwiającej wejście sukcynatów do komórki.

Podsumowując, protokół ten oferuje wiarygodny sposób badania bioenergetyki mitochondrialnej. Łączy fizjologiczne znaczenie architektury całych komórek z precyzją izolowanych testów mitochondrialnych, umożliwiając kontrolowane dostarczanie substratów i inhibitorów przy zachowaniu integralności organelli. Optymalizując stężenie i gęstość komórek cyfrytoniny, naukowcy mogą uzyskać dokładne i powtarzalne pomiary.

To elastyczne podejście jest idealne do badania modulacji funkcji mitochondriów za pośrednictwem receptorów i stanowi potężną platformę do badań nad chorobami oraz odkrywania leków.