Name: Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół ATAC-seq dla całych larw C. elegans w stadium L4. Ta metoda pokonuje barierę kolagenowej kutikuli, umożliwiając efektywne profilowanie dostępności chromatiny w skali genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J Hersch-González otrzymał stypendium doktoranckie od Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (obecnie Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). J Hersch-González był wspierany stypendium CONAHCYT (obecnie SECIHTI) (788519). Ten projekt był wspierany przez grant PAPIIT-UNAM IN217824 i grant SECIHTI CBF-2025-I-2275 dla VJV. W IFC dziękujemy UBM: Laura Ongay-Larios, Guadalupe Códiz Huerta i Minerwie Mora Cabrera; UBMI: Augusto César Poot-Hernández i Carlosowi Peralta Alvarezowi; oraz Unidad de Cómputo, Imagenología, Taller i Bibliotece. Z wdzięcznością zauważamy Caenorhabditis Genetics Center (CGC) za dostarczenie szczepów użytych w tej pracy. CGC jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Zaleca się noszenie rękawiczek przez cały czas.
UWAGA: Dzień 1: Przygotowanie zsynchronizowanej populacji dżdżyczek. Wszystkie robaki były hodowane na płytkach NGM zasiedlonych E. coli OP50. Rzeczy potrzebne przed rozpoczęciem: (na próbkę lub szczep), Jedna płytka dorosłych robaków 90 mm lub dwie płytki 60 mm, Jedna płytka 90 mm lub dwie płytki 60 mm z pokarmem, sterylny bufor M927 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L. Sterilizować przez autoklawowanie)
1. Zbieranie robaków
<ol>
	<li>Weź płytkę 90 mm (lub dwie 30 mm) z dorosłą populacją robaków.</li>
	<li>Odzyskaj robaki z buforem M9 i przenieś je do 15 mL probówki do wirówki.</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok, aby odzyskać wszystkie robaki z płytki (płytek).</li>
	<li>Pozwól, aby robaki osiedliły się w 15 mL probówce na minutę i ostrożnie usuń bufor M9.</li>
	<li>Upewnij się, że masz ~1 mL robaków.</li>
</ol>
2. Wybielanie
<ol>
	<li>Dodaj 5 mL buforu M9 + 650 μL NaOH 5M + 1300 μL domowego wybielacza (5% roztwór NaClO).</li>
	<li>Wiruj z maksymalną prędkością przez 1-2 min (nie dłużej niż 2,5 min).</li>
	<li>Wiruj w wirówce przy 1000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń surnatę i dodaj 9 mL buforu M9.</li>
	<li>Powtórz sekcje 2.3 i 2.4 pięć razy więcej.</li>
	<li>Resuspenduj zarodki w 7 mL buforu M9. 
	UWAGA: Protokół wybielania może różnić się pod względem efektywności w zależności od temperatury, rodzaju komercyjnego wybielacza28.</li>
</ol>
3. M9 (ciekły) nocne wyklucie jaj
<ol>
	<li>Upewnij się, że probówka z wybielonymi jajami jest odpowiednio zamknięta.</li>
	<li>Umieść probówkę w wolnym ruchu w 20 °C (np. w shakerze wewnątrz pomieszczenia o temperaturze 20 °C).</li>
	<li>Robaki wyklują się przez noc i zatrzymują w fazie L1. 
	UWAGA: Nie zostawiaj probówki dłużej niż 12 godzin.</li>
</ol>
4. Dzień 2: wzrost robaków: odzyskiwanie robaków L1.
<ol>
	<li>Weź probówkę z shakera i potwierdź pod mikroskopem, że są robaki L1.</li>
	<li>Pozwól, aby probówka osiedliła się pionowo przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń surnatę i przenieś ~300 L1 robaków na jedną płytkę 90 mm lub dwie płytki 30 mm z pokarmem.</li>
	<li>Umieść je w inkubatorze 20 °C i pozwól im rosnąć przez 26 godzin, aby osiągnąć stadium L4.</li>
</ol>
5. Dzień 3: Przygotowanie roztworów stężonych: Następujące roztwory muszą być przygotowane, aby wytworzyć świeże roztwory w dniu 4
UWAGA: Można to zrobić w dniu 2 lub 3.
<ol>
	<li>1 mL 10% SDS.</li>
	<li>50 mL 1M HEPES pH 8 (autoklawa).</li>
	<li>250 mL 20% sacharozy (autoklawa).</li>
	<li>100 mL 2M NaCl: przygotować (autoklawa).</li>
	<li>50 mL 2M KCl (autoklawa).</li>
	<li>10 mL 1M CaCl2 (autoklawa).</li>
	<li>10 mL 1M MgCl2 (autoklawa).</li>
	<li>100 mL 1M Tris, pH 7,4.</li>
	<li>5 mL 5M NaCl (autoklawa).</li>
	<li>500 μL 10% Tween-20.</li>
	<li>500 μL 10% Nonidet P40/IGEPAL.</li>
	<li>100 μL 5% Digitonin (należy podgrzać do 65 °C, aby się rozpuścić).</li>
	<li>500 μL 10% BSA (przefiltrowane przez 0,22 μm), przechowywane w 4 °C. 
	Dzień 4: Robaki L4 na ATAC 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem, upewnij się, że masz inkubator w 25 °C, gotową 4 °C wirówkę, podgrzej Digitonin do 65 °C (dla świeżego buforu), masz sterylny bufor M9, sterylną H2O i 20 μm filtry.</li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj świeże roztwory (patrz Tabela 1). Zawsze obsługuj L-15 10% FBS i bufor jajeczny w sterylnych warunkach i trzymaj je na zimno.</li>
</ol>
Tabela 1: Stożek dla przygotowania świeżego roztworu. Przepisy na przygotowanie stożka dla protokołu dysocjacji nematod i zawiesiny komórek (sekcje 6 i 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69791/Table1_JoVE.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

<ol><li>Poulet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+histones+in+Physarum+polycephalum+evidence+a+phylogenetic+vicinity+of+mycetozoans+to+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genom.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom.</a> NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).</li>
<li>Meléndez-Ramírez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+landscape+of+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+changes+during+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic landscape of chromatin accessibility and transcriptomic changes during differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Sci. Rep. 11 (1), 16977(2021).</li>
<li>Mansisidor, A. R., Risca, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility%3A+methods%2C+mechanisms%2C+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights.</a> Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).</li>
<li>Koyanagi, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+chromatin+accessibility+during+murine+hematopoiesis+through+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inferring chromatin accessibility during murine hematopoiesis through phylogenetic analysis.</a> BMC Res. Notes. 16 (1), 222(2023).</li>
<li>Gómora-García, J. C., Furlan-Magaril, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+factors+outline+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pioneer factors outline chromatin architecture.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 93, 102480(2025).</li>
<li>Boivin, A., Dura, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chromatin+accessibility+correlates+with+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila.</a> Genetics. 150 (4), 1539-1549 (1998).</li>
<li>Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+as+an+important+driver+of+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin as an important driver of genome organization.</a> Front. Cell Dev. Biol. 8, 579137(2020).</li>
<li>Escamilla-Del-Arenal, M., Recillas-Targa, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+modulates+the+chromatin+structure+and+activity+of+the+chicken+alpha-globin+3%E2%80%B2+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA-1 modulates the chromatin structure and activity of the chicken alpha-globin 3′ enhancer.</a> Mol. Cell. Biol. 28 (2), 575-586 (2008).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+positions+using+DNase-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome positions using DNase-seq.</a> Genome Res. 26 (3), 351-364 (2016).</li>
<li>Johnson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+and+constraint+in+the+nucleosome+core+landscape+of+Caenorhabditis+elegans+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flexibility and constraint in the nucleosome core landscape of Caenorhabditis elegans chromatin.</a> Genome Res. 16 (12), 1505-1516 (2006).</li>
<li>Boyle, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+and+characterization+of+open+chromatin+across+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome.</a> Cell. 132 (2), 311-322 (2008).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position.</a> Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+accessibility+landscape+of+primary+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chromatin accessibility landscape of primary human cancers.</a> Science. 362 (6413), eaav1898(2018).</li>
<li>Shema, E., Bernstein, B. E., Buenrostro, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+single-molecule+epigenomics+to+uncover+genome+regulation+at+unprecedented+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution.</a> Nat. Genet. 51 (1), 19-25 (2019).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+cell+atlas+of+fetal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A human cell atlas of fetal gene expression.</a> Science. 370 (6518), eaba7721(2020).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116.e20 (2020).</li>
<li>Jänes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+dynamics+across+C.+elegans+development+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing.</a> eLife. 7, e37344(2018).</li>
<li>Dhillon-Richardson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+developmental+regulatory+regions%3A+Zebrafish+tissue-specific+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq.</a> Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).</li>
<li>Huynh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+chromatin+state+across+multiple+tissues+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in chromatin state across multiple tissues in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 19 (5), e1010439(2023).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Hillier, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+in+C.+elegans%3A+so+many+genes%2C+such+a+little+worm%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genomics in C. elegans: so many genes, such a little worm.</a> Genome Res. 15 (12), 1651-1660 (2005).</li>
<li>Daugherty, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+dynamics+reveal+novel+functional+enhancers+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility dynamics reveal novel functional enhancers in C. elegans.</a> Genome Res. 27 (12), 2096-2107 (2017).</li>
<li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+complex+collagen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The cuticle of the nematode Caenorhabditis elegans: a complex collagen structure.</a> Bioessays. 16 (3), 171-178 (1994).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), e19505(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of Caenorhabditis elegans. WormBook. , The C. elegans. Research Community. (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów. W pisaniu, analizie ani przygotowaniu tego rękopisu nie użyto żadnej generatywnej sztucznej inteligencji.

Tu opisujemy zoptymalizowany protokół profilowania dostępności chromatinu na poziomie genomu przez ATAC-seq w całych robakach Caenorhabditis elegans w stadium L4. Dostępność chromatinu bezpośrednio wpływa na ekspresję genów, naprawę DNA, replikację i rekombinację, a chociaż ATAC-seq stał się standardowym podejściem dla próbek komórek i tkanek, jego zastosowanie do całych organizmów stwarza unikalne wyzwania techniczne, szczególnie w przypadku nicieni z nieprzepuszczalną, bogatą w kolagen kutikulą. Jednocześnie o...

Genomy eukariotyczne są gęsto upakowane wewnątrz jądra komórkowego. Aby nadążyć za ograniczeniami przestrzennymi, DNA jest ciasno owinięte wokół nukleosomów, kompleksów wieloproteinowych złożonych z ośmiu histonów, które są silnie zachowane w różnych gromadach1. Wzorce dostępności chromatyny różnią się w zależności od stanu komórkowego w tkankach i wzorców specyficznych dla genów2,3,4. Dostępność nukleosomów silnie koreluje z aktywną transkrypcją, szczególnie na promotorach i odległych regionach regulacyjnych, takich jak wzmacniacze, które są dostępne dla czynników transkrypcyjnych5. Otwarte regiony chromatyny odgrywają również ważne role w naprawie DNA, replikacji i segregacji chromosomów3. Natomiast, zmniejszona dostępność zazwyczaj koreluje z ciszącym heterochromatyną i powtarzającymi się sekwencjami6,7.
Mapowanie dostępności chromatyny było potężnym podejściem do zrozumienia regulacji genów. Różne techniki były stosowane do badania dostępności chromatyny. Wśród najwcześniejszych metod mikrokocytarna nukleaza (MNase) i trawienie DNAzą I były używane do mapowania pozycjonowania i dostępności nukleosomów w określonych loci8,9. Te techniki zostały później zaimplementowane w badaniach na poziomie genomowym po połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS)10,11. Jednakże, te techniki wymagają starannej kalibracji stężenia enzymu i czasu reakcji, wraz z znaczną liczbą komórek, dla udanej implementacji.
W 2013 roku laboratorium Greenleaf stworzyło test na dostępność chromatyny przez transpozytazę z użyciem sekwencjonowania (ATAC-seq) aby bezproblemowo mapować dostępność chromatyny na poziomie genomowym przy użyciu niewielkiej liczby komórek12. ATAC-seq wykorzystuje komercyjnie dostępną transpozytazę Tn5 do preferencyjnego wstawiania krótkich sekwencji DNA (czyli kodów kreskowych) do otwartych regionów chromatyny, zazwyczaj pozbawionych nukleosomów, i koreluje z aktywnymi promotorami i wzmacniaczami. Protokół wymaga permeabilizacji komórek i izolację jąder, po czym następuje ograniczone trawienie Tn5 dla tagmentacji hiperdostępnej chromatyny. Później, uzupełniające indeksy są włączane podczas PCR, ułatwiając wielokrotne sekwencjonowanie próbek przed NGS13. ATAC-seq okazało się być solidnym protokołem, który również umożliwia in silico analizę śladów czynników transkrypcyjnych i został zaimplementowany na poziomie pojedynczych komórek14,15,16,17. Oprócz próbek od myszy i ludzi, ATAC-seq został zaimplementowany w różnych systemach, w tym w rybkach i bezkręgowcach, takich jak Drosophila i nicienie Caenorhabditis elegans18,19,20.
Przez dekady, C. elegans był potężnym systemem modelowym w dziedzinach takich jak rozwój, biologia komórki i neuronauki, prowadząc do fundamentalnych odkryć, w tym identyfikacji mikro RNA i interferencji RNA (RNAi)21,22. Ma kompaktowy 100 MB genom z około 20 000 genami kodującymi białka23. Regulacja genów odbywa się poprzez aktywność promotorów, jak również dystalnych wzmacniaczy, które zostały skutecznie przemapowane przez ATAC-seq w różnych tkankach, stadiach rozwojowych i punktach czasowych starzenia się24,18. Profilowanie dostępności chromatyny stało się zatem cennym narzędziem do zrozumienia regulacji genów w C. elegans. W związku z tym, ATAC-seq ma szczególne znaczenie dla badań nad krajobrazami epigenetycznymi w różnych warunkach środowiskowych lub dzikich izolatach, aby odkryć różnorodne reakcje transkrypcyjne. Ponadto, mógłby dostarczyć wglądu w architekturę chromatyny innych patogennych i niepatogennych nicieni.
Jednym z głównych wyzwań metodologicznych w C. elegans jest obecność bogatej w kolagen kutikuły, która musi zostać rozdzielona, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek z całych robaków25. Aby sprostać temu wyzwaniu, skompilowałyśmy i zoptymalizowały różne protokoły, aby rozdzielić nicienie, a następnie wykonać ATAC-seq w C. elegans18,26. Preferowane jest używanie stadium larwalnego L4, ponieważ zwierzęta na tym etapie rozwoju mają transkrypcjonalnie aktywny zarodek, co przekłada się na otwartą chromatynę, zapewniając spójne i informacyjne źródło dostępności chromatyny w komórkach somatycznych. Przedstawiamy tutaj szybki i wydajny protokół do rozdzielania robaków i generowania zawiesiny komórkowej, umożliwiający ATAC-seq w C. elegans. Nas

<table><tbody><tr><td>250 mL, 0.22 &micro;m PES</td><td>Ultra Curz</td><td>sc-200253</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPURE XP</td><td>Nalgene</td><td>A63886</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Maplica</td><td>200100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 20 &micro;m</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2315</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141-500 mg</td><td></td></tr><tr><td>Disposable gloves</td><td>Microflex</td><td>94-243</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>sigma</td><td>D0632-10G</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, pure</td><td>Sigma</td><td>1003661421</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>biowest</td><td>S181S-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)</td><td>Illumina</td><td>20034211</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Syber 50 mL</td><td>Sigma</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leivobitz)</td><td>sigma</td><td>L4386-10L</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride anhydrous</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (50 preps)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&reg; High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma</td><td>74835-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm</td><td>Tritech</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm</td><td>Interlux</td><td>C9015-2C</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 10 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800108</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 20 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800708</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800608</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541 -500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic Powder</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic, Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-01 500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>JT Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>sigma</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hypochlorite</td><td>Cloralex</td><td>544394479</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter PVDF 0.22 &micro;m</td><td>Ultra Curz</td><td>Sc-358812</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503 1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza dostępności chromatiny w całym caenorhabditis elegans larw l4

Chromatin Accessibility Profiling in Whole Caenorhabditis elegans L4 Larvae

Dostępność chromatyny odgrywa istotne role w transkrypcji, naprawie DNA i segregacji chromosomów. Hiperdostępne regiony zwykle korelują z aktywnymi promotorami i wzmacniaczami, ułatwiając wiązanie czynników transkrypcyjnych i aktywność regulacyjną. Test dostępności chromatyny za pomocą sekwencjonowania opartej na transpozytacji (ATAC-seq) umożliwia profilowaniu dostępności chromatyny w całym genomie przy użyciu bardzo niewielu komórek. Jednak jego zastosowanie w Caenorhabditis elegans jest ograniczone przez bogatą w kolagen kutikulę nicieni, która komplikuje dysocjację komórek. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół wykonywania ATAC-seq w całych robakach na etapie L4. Procedura rozpoczyna się od synchronizowanych kultur i obejmuje zniszczenie kutikuły, dysocjację enzymatyczną i przygotowanie zawiesiny komórek. Permeabilizowane jądra są następnie poddawane transpozycji Tn5, a następnie amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i czyszczeniu bibliotek gotowych do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Ten protokół wymaga 30 μL osiadłych robaków, można go wykonać w jeden dzień i generuje 5 000–9 000 szczytów dostępności w odniesieniu do szczepu referencyjnego Bristol N2. Ten usprawnionony proces można dostosować do innych etapów rozwojowych lub populacji komórek wyodrębnionych FACS. Poprzez zmniejszenie barier technicznych w ATAC-seq w C. elegans, ta metoda rozszerza możliwości badania dostępności chromatyny w całym genomie w odpowiedzi na czynniki genetyczne i środowiskowe w kontekście całego organizmu.

Kontrola jakości po tagmentacji zapewnia dokładną przygotowanie biblioteki 
Podczas protokołu ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na qPCR wykonane po tagmentacji chromatyny (sekcja 9), ponieważ jest to kluczowy krok do oceny jakości DNA i wydajności eksperymentu. Rysunek 1A przedstawia dwie krzywe amplifikacyjne; lewa (poniżej 15 cykli) przedstawia materiał dobrej jakości, co pokazuje, że wszystko było pomyślne do tego punktu, więc można kontynuować. Krzywa po prawej...

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Chromatin accessibility plays essential roles in transcription, DNA repair, and chromosome segregation. Hyper-accessible regions usually correlate with ...

Nasze badania koncentrują się na tym, jak regulacja epigenetyczna kształtuje ekspresję genów, szczególnie jak dostępność chromatyny kontroluje aktywność genów w różnych warunkach biologicznych. ATAC-seq u C.elegans jest ograniczone przez jego ochronną warstwę zewnętrzną. Nasze protokoły pokonują tę barierę, umożliwiając wiarygodną analizę dostępności chromatyny.Aby zacząć, uzyskaj synchroniczną populację larwy L1 i pozwól im rosnąć przez 26 godzin w 20 stopniach Celsjusza. Potwierdź pod mikroskopem, że większość dżdżownic jest na etapie L4. Odzyskaj wszystkie dżdżownice z płytek za pomocą bufora M9 i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki do wirowania.Przepłucz dżdżownice pięć razy jednym mililitrem sterylnej wody, pozwalając im osiadać siłą grawitacji. Następnie przenieś probówkę zawierającą dżdżownice do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, aby usunąć resztki pokarmu z jelit. Następnie weź 50 mikrolitrów pelletu dżdżownic i umieść go w nowej probówce.Aby lizat dżdżownice, dodaj 200 mikrolitrów świeżego bufora SDS-DTT i mieszaj w rotującej butelce przez dokładnie pięć minut. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego bufora jajecznego. Następnie wiruj w picofuge, aby usunąć nadstan i powtórz sześć razy.Po tym, dodaj 80 mikrolitrów świeżo przygotowanego pronazy. Za pomocą 200-mikrolitrowej pipety z filtrowanymi końcówkami, mieszaj mieszaninę dżdżownic z pronazą 70 razy i inkubatoruj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj 800 mikrolitrów medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska i wiruj przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.Po usunięciu nadstanu, dodaj jeden mililitr medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska i wiruj tak jak poprzednio. Po trzykrotnym przepłukaniu pelletu, usuń nadstan i ponownie zawieś pellet w 900 mikrolitrach medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska. Następnie przefiltruj zawiesinę przez filtr o rozmiarze 20 mikrometrów.Wiruj przefiltrowaną zawiesinę komórkową przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie usuń nadstan, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Dodaj 45 mikrolitrów świeżo przygotowanego bufora lizacyjnego i ostrożnie ponownie zawieś próbkę.Następnie ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów bufora do mycia bez mieszania próbki. Wiruj przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Usuń nadstan i utrzymaj próbkę na lodzie.Podczas wirowania, przygotuj mieszaninę TN5 na próbkę, łącząc 25 mikrolitrów bufora TN5, 24,8 mikrolitrów wody bez nukleaz i 0,2 mikrolitrów enzymu TN5. Po wirowaniu usuń nadstan i utrzymaj jądra na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny TN5 do pelletu jądrowego.Następnie pipetuj w górę i w dół siedem razy, aby wymieszać. Inkubatoruj w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut na bloku termicznym i delikatnie stukaj w probówkę co 10 minut. Po inkubacji z TN5, dodaj 300 mikrolitrów bufora PB i mieszaj wirując z maksymalną prędkością przez 25 sekund.Przenieś całą objętość z probówki do kolumny wirowania. Wiruj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Dodaj 750 mikrolitrów bufora PE do kolumny wirowania i ponownie wiruj.Następnie wyrzuć nadstan z probówką do zbioru. Po pustym wirowaniu, umieść kolumnę w nowej oznaczonej 1,5 mililitrowej probówce. Dodaj 10 mikrolitrów bufora EB w 37 stopniach Celsjusza do środka kolumny bez jej dotykania.Zostaw na pokojową temperaturę przez jedną minutę. Następnie wiruj przez jedną minutę z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz kroki elucji, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów w buforze EB.Przeprowadź rzeczywistą PCR, aby oszacować odpowiednią liczbę cykli amplifikacji dla amplifikacji biblioteki ATAC. Oszacuj końcową liczbę cykli amplifikacji, wybierając cykl, w którym sygnał amplifikacji osiąga 1/3 maksimum dla każdej próbki. Przeprowadź końcową amplifikację dla biblioteki ATAC i przypisz różny dolny primer do każdej próbki i zarejestruj go.Amplifikuj każdą próbkę przez oszacowaną liczbę cykli dla tej próbki. Przeprowadź prezentowaną reakcję łańcuchową polimerazy w 200-mikrolitrowych probówkach, używając 10 mikrolitrów biblioteki DNA w całkowitej objętości reakcji 50 mikrolitrów. Przechowuj próbki w minus 20 stopniach Celsjusza, jeśli przerwie się protokół.Po oczyszczeniu amplifikowanej biblioteki, przeprowadź elektroforezę kapilarną, aby zobaczyć wzór dystrybucji długości fragmentów. Krzywa amplifikacji, która daje oszacowane końcowe amplifikacje biblioteki mniej niż 15 cykli, wskazuje na dobrej jakości materiał nadający się do kontynuacji. Krzywa amplifikacji pokazująca opóźniony wzrost wskazuje na materiał o niskiej jakości i nie powinien być kontynuowany.Rozkład długości fragmentów po amplifikacji wykazał

chromatin-accessibility-profiling-whole-caenorhabditis-elegans-l4

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje procedurę ręcznego izolowania jelit od dorosłych nicieni Caenorhabditis elegans w celu wprowadzenia ich do genomiki, proteomiki, mikrobiomu lub innych testów.

Ręczna sekcja jelit Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Poznaj zoptymalizowany protokół ATAC-seq dla całych larw C. elegans w stadium L4. Ta metoda pokonuje barierę kolagenowej kutikuli, umożliwiając efektywne profilowanie dostępności chromatiny w skali genomu.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Przeglądaj więcej filmów