Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4
17 kwietnia 2026
Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.
Nasze badania koncentrują się na tym, jak regulacja epigenetyczna kształtuje ekspresję genów, szczególnie jak dostępność chromatyny kontroluje aktywność genów w różnych warunkach biologicznych. ATAC-seq u C.elegans jest ograniczone przez jego ochronną warstwę zewnętrzną. Nasze protokoły pokonują tę barierę, umożliwiając wiarygodną analizę dostępności chromatyny.
Aby zacząć, uzyskaj synchroniczną populację larwy L1 i pozwól im rosnąć przez 26 godzin w 20 stopniach Celsjusza. Potwierdź pod mikroskopem, że większość dżdżownic jest na etapie L4. Odzyskaj wszystkie dżdżownice z płytek za pomocą bufora M9 i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki do wirowania.
Przepłucz dżdżownice pięć razy jednym mililitrem sterylnej wody, pozwalając im osiadać siłą grawitacji. Następnie przenieś probówkę zawierającą dżdżownice do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, aby usunąć resztki pokarmu z jelit. Następnie weź 50 mikrolitrów pelletu dżdżownic i umieść go w nowej probówce.
Aby lizat dżdżownice, dodaj 200 mikrolitrów świeżego bufora SDS-DTT i mieszaj w rotującej butelce przez dokładnie pięć minut. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego bufora jajecznego. Następnie wiruj w picofuge, aby usunąć nadstan i powtórz sześć razy.
Po tym, dodaj 80 mikrolitrów świeżo przygotowanego pronazy. Za pomocą 200-mikrolitrowej pipety z filtrowanymi końcówkami, mieszaj mieszaninę dżdżownic z pronazą 70 razy i inkubatoruj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj 800 mikrolitrów medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska i wiruj przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po usunięciu nadstanu, dodaj jeden mililitr medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska i wiruj tak jak poprzednio. Po trzykrotnym przepłukaniu pelletu, usuń nadstan i ponownie zawieś pellet w 900 mikrolitrach medium L15 z 10% surowicy byczej z łożyska. Następnie przefiltruj zawiesinę przez filtr o rozmiarze 20 mikrometrów.
Wiruj przefiltrowaną zawiesinę komórkową przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie usuń nadstan, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Dodaj 45 mikrolitrów świeżo przygotowanego bufora lizacyjnego i ostrożnie ponownie zawieś próbkę.
Następnie ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów bufora do mycia bez mieszania próbki. Wiruj przy 500G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Usuń nadstan i utrzymaj próbkę na lodzie.
Podczas wirowania, przygotuj mieszaninę TN5 na próbkę, łącząc 25 mikrolitrów bufora TN5, 24,8 mikrolitrów wody bez nukleaz i 0,2 mikrolitrów enzymu TN5. Po wirowaniu usuń nadstan i utrzymaj jądra na lodzie. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny TN5 do pelletu jądrowego.
Następnie pipetuj w górę i w dół siedem razy, aby wymieszać. Inkubatoruj w 37 stopniach Celsjusza przez 30 minut na bloku termicznym i delikatnie stukaj w probówkę co 10 minut. Po inkubacji z TN5, dodaj 300 mikrolitrów bufora PB i mieszaj wirując z maksymalną prędkością przez 25 sekund.
Przenieś całą objętość z probówki do kolumny wirowania. Wiruj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Dodaj 750 mikrolitrów bufora PE do kolumny wirowania i ponownie wiruj.
Następnie wyrzuć nadstan z probówką do zbioru. Po pustym wirowaniu, umieść kolumnę w nowej oznaczonej 1,5 mililitrowej probówce. Dodaj 10 mikrolitrów bufora EB w 37 stopniach Celsjusza do środka kolumny bez jej dotykania.
Zostaw na pokojową temperaturę przez jedną minutę. Następnie wiruj przez jedną minutę z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz kroki elucji, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów w buforze EB.
Przeprowadź rzeczywistą PCR, aby oszacować odpowiednią liczbę cykli amplifikacji dla amplifikacji biblioteki ATAC. Oszacuj końcową liczbę cykli amplifikacji, wybierając cykl, w którym sygnał amplifikacji osiąga 1/3 maksimum dla każdej próbki. Przeprowadź końcową amplifikację dla biblioteki ATAC i przypisz różny dolny primer do każdej próbki i zarejestruj go.
Amplifikuj każdą próbkę przez oszacowaną liczbę cykli dla tej próbki. Przeprowadź prezentowaną reakcję łańcuchową polimerazy w 200-mikrolitrowych probówkach, używając 10 mikrolitrów biblioteki DNA w całkowitej objętości reakcji 50 mikrolitrów. Przechowuj próbki w minus 20 stopniach Celsjusza, jeśli przerwie się protokół.
Po oczyszczeniu amplifikowanej biblioteki, przeprowadź elektroforezę kapilarną, aby zobaczyć wzór dystrybucji długości fragmentów. Krzywa amplifikacji, która daje oszacowane końcowe amplifikacje biblioteki mniej niż 15 cykli, wskazuje na dobrej jakości materiał nadający się do kontynuacji. Krzywa amplifikacji pokazująca opóźniony wzrost wskazuje na materiał o niskiej jakości i nie powinien być kontynuowany.
Rozkład długości fragmentów po amplifikacji wykazał
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół przeprowadzania ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) w całych nicieni Caenorhabditis elegans na etapie rozwojowym L4. Metoda ta pozwala przezwyciężyć trudności wynikające z bogatej w kolagen kutykuli nicieni, umożliwiając efektywne profilowanie dostępności chromatyny w całym genomie przy minimalnej liczbie komórek. Usprawniony schemat postępowania ułatwia badania dynamiki chromatyny w odpowiedzi na zmiany genetyczne i środowiskowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Epigenetyka
- Biologia molekularna
Wstęp
- Dostępność chromatyny jest kluczowa dla transkrypcji, naprawy DNA oraz segregacji chromosomów.
- Regiony chromatyny o wysokiej dostępności są powiązane z aktywnymi promotorami i enhancerami.
- Metoda ATAC-seq umożliwia mapowanie dostępnych regionów chromatyny w całej skali genomu przy użyciu niewielkiej liczby komórek.
- Implementacja tej metody w C. elegans jest utrudniona ze względu na twardą kutykulę kolagenową tego organizmu.
Cel badania
- Opracowanie i przedstawienie zoptymalizowanego protokołu ATAC-seq dla całych nicieni C. elegans.
- Umożliwienie wydajnego profilowania dostępności chromatyny w stadium L4.
- Zmniejszenie barier technicznych w stosowaniu metody ATAC-seq u tego organizmu modelowego.
Zastosowane metody
- Zsynchronizowana hodowla C. elegans w stadium L4.
- Rozrywanie kutykuli i dysocjacja enzymatyczna w celu uzyskania zawiesin komórkowych.
- Przygotowanie permeabilizowanych jąder do transpozycji Tn5.
- Amplifikacja PCR i oczyszczanie bibliotek gotowych do sekwencjonowania NGS.
Główne wyniki
- Protokół wymaga jedynie 30 μL osadu z nicieni.
- Cały proces można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.
- Generuje od 5 000 do 9 000 pików dostępności chromatyny w szczepie referencyjnym Bristol N2.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych etapów rozwojowych lub populacji komórek oczyszczonych metodą FACS.
Wnioski
- Ten zoptymalizowany protokół ATAC-seq umożliwia wiarygodne profilowanie dostępności chromatyny w całych nicieni C. elegans.
- Rozszerza on możliwości badania dynamiki chromatyny w całej skali genomu w odpowiedzi na różne zaburzenia.
- Uproszczony schemat pracy zmniejsza bariery techniczne dla badaczy wykorzystujących ten organizm modelowy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Profilowanie dostępności chromatyny w całym genomie u larw Caenorhabditis elegans w stadium L4 umożliwia bezpośrednią analizę krajobrazów regulacyjnych w nienaruszonym organizmie wielokomórkowym. Ten zoptymalizowany schemat ATAC-seq redukuje bariery techniczne, zwiększając wiarygodność predykcyjną w badaniach nad regulacją genów i ułatwiając ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkrywania. Adaptacyjność tego protokołu zwiększa jego wartość w ramach walidacji celów w całym portfolio oraz w inicjatywach z zakresu genomiki funkcjonalnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mapowanie regionów dostępnej chromatyny w wysokiej rozdzielczości w celu funkcjonalnej walidacji celów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnienie aktywności elementów regulacyjnych w kontekście całego organizmu.
- Ułatwia analizę sieci regulacji genów istotnych dla modeli chorób w oparciu o sformułowane hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowany schemat postępowania w celu generowania powtarzalnych danych o dostępności chromatyny z niewielkich ilości materiału wyjściowego.
- Dostarcza ilościowe wyniki w postaci pików, odpowiednie do analizy porównawczej w różnych warunkach genetycznych lub środowiskowych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewowego badania zaburzeń regulatorowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia ocenę dynamiki chromatyny w odpowiedzi na zaburzenia genetyczne lub środowiskowe w modelu istotnym dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie zmian regulacyjnych z efektami fenotypowymi.
- Stanowi platformę do identyfikacji translacyjnych biomarkerów stanu chromatyny, przy wsparciu dodatkowych badań.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół ATAC-seq wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne – umożliwiając rzetelne profilowanie chromatyny w całych organizmach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie dostępnych elementów regulacyjnych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych o dostępności chromatyny do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Generuje liczbę pików i profile w obrębie całego genomu w celu porównania stanów regulacyjnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia badanie zmian w chromatynie związanych z zaburzeniami istotnymi dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Adaptowalny przepływ pracy wspiera szerokie zastosowanie w różnych etapach rozwoju i populacjach komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad mechanizmami regulacyjnymi i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia profilowanie chromatyny dzięki jednodniowemu, skalowalnemu protokołowi wymagającemu minimalnej ilości materiału wyjściowego.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie solidnych i powtarzalnych danych epigenomicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dowody dotyczące dostępności chromatyny.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obchodzenia się z nicieniami, dysocjacji komórek oraz przygotowywania bibliotek NGS.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury sekwencjonowania następnej generacji oraz wsparcia bioinformatycznego w analizie danych.
- Standaryzacja między zespołami jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności i porównywalności wyników między badaniami.
- Protokół można dostosować do innych etapów rozwojowych lub populacji komórek oczyszczonych metodą FACS, w zależności od potrzeb.
- Ograniczenia techniczne mogą wynikać z wielkości materiału wejściowego lub wydajności niszczenia kutykuli.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Isolation and Dissociation of Caenorhabditis elegans into Single-Cell Suspension
2:47
Nuclei Isolation and Chromatin Tagmentation for ATAC Sequencing
5:25
ATAC Library Amplification and Cycle Optimization Using qPCR
6:36
Results
7:25
Conclusion
