Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA
17 kwietnia 2026
Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.
Nasze badania koncentrują się głównie na patofizjologii związanej z hepatocytami w kontekście przewlekłych chorób wątroby. Protokół ten umożliwia izolację komórek w przekrojach tkanki wątroby oraz ekstrakcji RNA. W przeciwieństwie do FFPE, czyli protokołu Paraformaldehyd-fiksowanego lub CT, który jest przechowywany i igratowany, umożliwia precyzyjną dyskusję mikro oraz wysokiej jakości próbki do dalszej analizy OMI.
Aby rozpocząć, eksponuj slajdy z membraną długopisu na światło ultrafioletowe cztery minuty po 30 minutach. Powłokuj szkiełki 0,1 miligrama na mililitr poli-L-lizyny i pozwól im wyschnąć na powietrzu. Zabezpiecz krawędzie każdego zamka neutralnym nośnikiem mocującym.
Używając środka dekontaminacyjnego RNazy, wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie kriostatu oraz wszystkie narzędzia. Używam 75% etanolu. Dokładnie wyczyść pędzel i narzędzia.
Teraz ustaw temperaturę kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza i pozwól mu się ustabilizować. Pobierz próbki wątroby z magazynu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść próbki w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut, aby się wyrównały.
Nałóż warstwę związku OCT o grubości dwóch do trzech milimetrów na etap próbki. Następnie umieść etap próbki na szybkiej, wolnej półce lub wewnątrz komory kriostatu, aby wstępnie zastygła warstwa związku. Po nałożeniu niewielkiej ilości związku OCT na warstwę wcześniej stwardniałą, umieść wyrównany blok tkanki poziomo na związku i utrzymuj go na miejscu przez 10 do 15 sekund.
Następnie zamontuj etap próbki z przymocowanym blokiem tkankowym na głowicy kriostatu. Teraz ostrożnie włóż ostrze między płytki zaciskowe a tylne płyty z jednej strony kriostatu. Zacisnąć dźwignię zaciskową, aby zabezpieczyć ostrze.
Reguluj grubość kriostatu na 10 mikrometrów. Pociń tkankę na fragmenty i zamontuj je bezpośrednio na wstępnie przygotowanych szkłach błony penów wewnątrz komory kriostatu, utrzymując ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozmrażaj szkiełki w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Myj slajdy trzy razy z RN ACE free PBS po cztery razy po 10 sekund za każde. Nakładaj przefiltrowany roztwór hematoksyliny Mayera na przekroje tkanek przez pięć do dziesięciu sekund. Następnie myj szkiełka trzy razy wodą wolną od rybonukleazy przez 10 sekund za każdym myciem, aby usunąć pozostałości hematoksyliny.
Oceń jakość barwienia pod mikroskopem. Używając chłonnego papieru, wysusz szkiełka i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Przetrzyj powierzchnię stołu laboratoryjnego środkiem dekontaminującym RNazy.
Włącz kontroler i pozwól mikroskopowi zakończyć inicjalizację. Obróć klawisz zgodnie z ruchem wskazówek zegara z pozycji wyłączonej do pozycji włączonej, aby uruchomić system laserowy. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do mikro-sekcji laserowej do przechwytywania laserowego.
Następnie poczekaj na zakończenie inicjalizacji. Teraz włóż sterylną rurkę PCR o masie 0,2 mililitra do urządzenia do pobierania. Za pomocą pipety dodaj 10 mikrolitrów buforu trawienia proteazy K do nakrętki rurki PCR.
Załaduj urządzenie do pobierania do uchwytu na próbkę mikroskopu. W oknie urządzenia change collector. Przejdź do regulacji punktu odniesienia, wyreguluj ostrość aparatu, aby wyraźnie widzieć punkt odniesienia, a jeśli trzeba, użyj strzałek, by go wycentrować.
Załaduj fragment tkanki do uchwytu na próbkę, z tkanką skierowaną w dół, a etykietą po prawej stronie. Wybierz obiektyw 10 x i zidentyfikuj obszary zainteresowania o określonych cechach patologicznych. Przejdź do menu laserowego.
Kliknij kalibruj, wybierz tak i zakończ kalibrację. W panelu sterowania laserem ustaw moc lasera na 50, aperturę na pięć i prędkość na dziewięć. Następnie użyj graficznego paska narzędzi, aby narysować okrąg wokół docelowego obszaru.
Wybierz pojedynczy kształt, naciśnij start cut, aby wykonać mikro-sekcję laserową i ustawić urządzenie do zbierania rozciętej tkanki. Aby przechwycić dokumentację, obrazy, wybierz plik i wybierz zapisz obrazy, aby zapisać zdjęcia przed i po w preferowanym formacie. Po zebraniu pożądanych komórek kliknij "unload", aby usunąć kolektora ze sceny.
Sprawdź, czy w kapsle pozostało 10 mikrolitrów buforu trawienia proteazy K i w razie potrzeby uzupełnij. Zamknij rurkę i dokładnie ją zawietrz. Następnie krótko obróć rurkę w wirówce.
Przechowuj probówkę w temperaturze do minus 80 stopni Celsjusza aż do ekstrakcji RNA. Przekrój wątroby barwiony hematoksyliną na szkiełku długopisowym był widoczny pod mikroskopem przed i po mikrosekcji laserowej. Obszary zainteresowania wykazujące mikropęcherzykową steatozę zostały precyzyjnie zebrane do kapsułki rurki PCR.
Zachowując nienaruszoną morfologię komórkową. Całkowity kwas rybonukleinowy wyekstrahowany z około 1000 i 2000 komórek mikroskopii laserowej mikroskopii odbierającej dał odpowiednio 110,7 nanograma i 213,3 nanograma. Wszystkie próbki wykazywały wysoką czystość z absorpcją 260 na 280 nanometrów w zakresie od 1,9 do 2,1.
Elektroforeza żelowa wykazała wyraźne pasma rybosomalnych rybosomalnych rybo-nukleinowych. Bioanalizatorowe profile kwasu rybonukleinowego z zaledwie 1000 komórek. Otrzymał integralność kwasu rybonukleinowego 6,7.
Q-R-T-P-C-R dla genu housekeeping beta-aktyna dał wartości progowe cyklu w zakresie od 17 do 19. Ocena bibliotek sekwencjonowania przez bioanalizator skonstruowana z 50 nanogramów całkowitego kwasu rybonukleinowego wykazała charakterystyczny szczyt między 300 a 500 parami zasad. Sekwencjonowanie RNA tych bibliotek dało dane wysokiej jakości z wynikami Q 20 i Q 30, przekraczającymi 90% oraz niskim wskaźnikiem błędów w różnych replikacjach.
Ważnym aspektem jest zapobieganie degradacji poprzez kontrolowane zatrzymywanie, szybkie barwienie i warunki proste poprzez nasze przetwarzanie. Zamówienie tej procedury pozwala na jej wykorzystanie do PCR w czasie rzeczywistym oraz sekwencjonowania z kluczami biblioteki zoptymalizowanymi do fragmentacji. Ustalona w próbkach wątroby.
Protokół ten umożliwia profilowanie podgrup hepatocytów i wspiera badania hepatologiczne skoncentrowane na patologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół mikrodissekcji laserowej (LCM) oraz ekstrakcji RNA z przekrojów wątroby myszy utrwalonych paraformaldehydem (PFA) i zatopionych w OCT. Metoda ta umożliwia izolację konkretnych obszarów histologicznych do późniejszych analiz transkrypcyjnych, zapewniając wysoką czystość i integralność RNA, odpowiednią do czułych zastosowań, takich jak qPCR oraz sekwencjonowanie RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hepatologia
- Biologia molekularna
- Histologia
Wstęp
- Przewlekłe choroby wątroby często wymagają analizy molekularnej subpopulacji hepatocytów z rozdzielczością przestrzenną.
- Tradycyjne metody FFPE mogą naruszać integralność RNA, ograniczając możliwości dalszych analiz.
- LCM pozwala na precyzyjną izolację określonych populacji komórek z kompleksowych tkanek.
- Fiksacja w PFA i zatapianie w OCT zachowują morfologię tkanki oraz jakość RNA na potrzeby badań transkryptomicznych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu izolacji specyficznych populacji komórek wątroby za pomocą LCM z tkanek utrwalonych w PFA i zatopionych w OCT.
- Wyekstrahowanie wysokiej jakości RNA z próbek w skali mikro, odpowiedniego do analiz transkrypcyjnych.
- Walidacja skuteczności protokołu w zastosowaniach analitycznych, takich jak qPCR oraz sekwencjonowanie RNA.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie szkiełek z membraną PEN z naświetlaniem UV i powłoką z poli-L-lizyny.
- Kriosekcjonowanie wątroby mysiej utrwalonej w PFA i zatopionej w OCT w temperaturze -20°C.
- Barwienie hematoksyliną i praca w warunkach wolnych od RNazy w całym przebiegu procedury.
- Mikrosekcja laserowa (LCM) obszarów zdefiniowanych histologicznie (ok. 1 000 komórek).
- Ekstrakcja RNA, kwantyfikacja i ocena jakości (stosunek A260/A280, RIN, elektroforeza żelowa).
- Walidacja końcowa za pomocą qPCR dla β-actin oraz sekwencjonowanie RNA z przygotowaniem biblioteki z optymalizacją fragmentacji.
Główne wyniki
- Wydajność izolacji RNA z 1 000–2 000 komórek wynosiła od 110,7 do 213,3 ng.
- Czystość RNA była wysoka (A260/A280: 1,9–2,1).
- Wartość wskaźnika integralności RNA (RIN) wynosiła średnio 6,7 ± 0,9, co jest zgodne z utrwaleniem w PFA.
- Analiza qPCR dla β-actin wykazała wartości Ct w zakresie 17–19, co wskazuje na dobrą jakość RNA.
- Biblioteki RNA-seq wykazały charakterystyczne piki (300–500 bp) oraz >90% zasad spełniających progi jakości Q20/Q30.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną, rozdzielczą przestrzennie analizę ekspresji genów w tkance wątroby.
- Wyekstrahowany RNA charakteryzuje się czystością i integralnością wystarczającą dla czułych aplikacji w dalszych etapach analizy.
- Metoda ta wspiera profilowanie podgrup hepatocytów oraz badania hepatologiczne skoncentrowane na patologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrosekcja laserowa (LCM) tkanki wątroby myszy utrwalonej w paraformaldehydzie i zatopionej w OCT umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie transkrypcyjne określonych populacji komórek, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Podejście to pozwala na uzyskanie RNA o wysokiej czystości, odpowiedniego do czułych analiz w dalszych etapach, co ułatwia pewną walidację celów oraz badanie szlaków istotnych dla przebiegu choroby. Protokół ten stanowi rozwiązanie kluczowego problemu w portfelach B+R skoncentrowanych na hepatologii i patologii, które wymagają solidnych, regionowo specyficznych wglądów molekularnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia przestrzennie precyzyjną analizę podgrup hepatocytów w obrębie złożonej tkanki wątroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację histologicznie zdefiniowanych obszarów do analizy RNA.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie sygnatur molekularnych z konkretnymi cechami patologicznymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas selekcji projektów w portfolio dzięki dostarczeniu wysokiej jakości danych RNA specyficznych dla danego regionu.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki biologiczne do dalszych etapów qPCR oraz sekwencjonowania RNA.
- Zapewnia powtarzalność analizy poprzez standaryzację przetwarzania tkanek oraz pomiar parametrów jakości RNA.
- Dostarcza danych ilościowych (np. wartości Ct, integralność RNA) w celu wiarygodnej oceny związków.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu zastosowaniach transkrypcyjnych w modelach chorób wątroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profilowanie molekularne z histopatologią istotną dla choroby w celu odkrywania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie czułych analiz opartych na RNA.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne przy podejmowaniu decyzji o postępach przedklinicznych, zapewniając integralność próbek i jakość danych.
- Wspiera badania oparte na patologii w modelach przewlekłych chorób wątroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół LCM wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając ukierunkowaną analizę ekspresji genów w utrwalonych sekcjach tkanek, co stanowi pomost między oceną histologiczną a odczytami molekularnymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia przestrzennie rozdzieloną weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych w tkance wątroby.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki RNA do opracowywania i walidacji testów.
- Analityka: Zapewnia wysokiej czystości RNA oraz rzetelne parametry jakościowe (A260/A280, RIN, wartości Ct) do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy cechy histopatologiczne z profilami transkrypcyjnymi w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia reużywalny schemat postępowania dla transkryptomiki przestrzennej w modelach tkanek utrwalonych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i ekstrakcję RNA w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób wątroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w kriosekcjonowaniu, barwieniu histologicznym oraz obsłudze aparatury LCM.
- Konieczny jest dostęp do pomieszczeń wolnych od RNaz oraz infrastruktury analitycznej do oceny jakości RNA.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów przetwarzania tkanek i ekstrakcji RNA pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody do innych typów tkanek lub modeli chorobowych wraz z przeprowadzeniem walidacji.
- Integralność RNA jest z natury ograniczona przez utrwalanie w PFA, jednak pozostaje ona wystarczająca do analiz qPCR i RNA-seq.
