Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA
April 17th, 2026
Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.
Nasze badania koncentrują się głównie na patofizjologii związanej z hepatocytami w kontekście przewlekłych chorób wątroby. Protokół ten umożliwia izolację komórek w przekrojach tkanki wątroby oraz ekstrakcji RNA. W przeciwieństwie do FFPE, czyli protokołu Paraformaldehyd-fiksowanego lub CT, który jest przechowywany i igratowany, umożliwia precyzyjną dyskusję mikro oraz wysokiej jakości próbki do dalszej analizy OMI.
Aby rozpocząć, eksponuj slajdy z membraną długopisu na światło ultrafioletowe cztery minuty po 30 minutach. Powłokuj szkiełki 0,1 miligrama na mililitr poli-L-lizyny i pozwól im wyschnąć na powietrzu. Zabezpiecz krawędzie każdego zamka neutralnym nośnikiem mocującym.
Używając środka dekontaminacyjnego RNazy, wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie kriostatu oraz wszystkie narzędzia. Używam 75% etanolu. Dokładnie wyczyść pędzel i narzędzia.
Teraz ustaw temperaturę kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza i pozwól mu się ustabilizować. Pobierz próbki wątroby z magazynu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść próbki w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut, aby się wyrównały.
Nałóż warstwę związku OCT o grubości dwóch do trzech milimetrów na etap próbki. Następnie umieść etap próbki na szybkiej, wolnej półce lub wewnątrz komory kriostatu, aby wstępnie zastygła warstwa związku. Po nałożeniu niewielkiej ilości związku OCT na warstwę wcześniej stwardniałą, umieść wyrównany blok tkanki poziomo na związku i utrzymuj go na miejscu przez 10 do 15 sekund.
Następnie zamontuj etap próbki z przymocowanym blokiem tkankowym na głowicy kriostatu. Teraz ostrożnie włóż ostrze między płytki zaciskowe a tylne płyty z jednej strony kriostatu. Zacisnąć dźwignię zaciskową, aby zabezpieczyć ostrze.
Reguluj grubość kriostatu na 10 mikrometrów. Pociń tkankę na fragmenty i zamontuj je bezpośrednio na wstępnie przygotowanych szkłach błony penów wewnątrz komory kriostatu, utrzymując ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozmrażaj szkiełki w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Myj slajdy trzy razy z RN ACE free PBS po cztery razy po 10 sekund za każde. Nakładaj przefiltrowany roztwór hematoksyliny Mayera na przekroje tkanek przez pięć do dziesięciu sekund. Następnie myj szkiełka trzy razy wodą wolną od rybonukleazy przez 10 sekund za każdym myciem, aby usunąć pozostałości hematoksyliny.
Oceń jakość barwienia pod mikroskopem. Używając chłonnego papieru, wysusz szkiełka i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Przetrzyj powierzchnię stołu laboratoryjnego środkiem dekontaminującym RNazy.
Włącz kontroler i pozwól mikroskopowi zakończyć inicjalizację. Obróć klawisz zgodnie z ruchem wskazówek zegara z pozycji wyłączonej do pozycji włączonej, aby uruchomić system laserowy. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do mikro-sekcji laserowej do przechwytywania laserowego.
Następnie poczekaj na zakończenie inicjalizacji. Teraz włóż sterylną rurkę PCR o masie 0,2 mililitra do urządzenia do pobierania. Za pomocą pipety dodaj 10 mikrolitrów buforu trawienia proteazy K do nakrętki rurki PCR.
Załaduj urządzenie do pobierania do uchwytu na próbkę mikroskopu. W oknie urządzenia change collector. Przejdź do regulacji punktu odniesienia, wyreguluj ostrość aparatu, aby wyraźnie widzieć punkt odniesienia, a jeśli trzeba, użyj strzałek, by go wycentrować.
Załaduj fragment tkanki do uchwytu na próbkę, z tkanką skierowaną w dół, a etykietą po prawej stronie. Wybierz obiektyw 10 x i zidentyfikuj obszary zainteresowania o określonych cechach patologicznych. Przejdź do menu laserowego.
Kliknij kalibruj, wybierz tak i zakończ kalibrację. W panelu sterowania laserem ustaw moc lasera na 50, aperturę na pięć i prędkość na dziewięć. Następnie użyj graficznego paska narzędzi, aby narysować okrąg wokół docelowego obszaru.
Wybierz pojedynczy kształt, naciśnij start cut, aby wykonać mikro-sekcję laserową i ustawić urządzenie do zbierania rozciętej tkanki. Aby przechwycić dokumentację, obrazy, wybierz plik i wybierz zapisz obrazy, aby zapisać zdjęcia przed i po w preferowanym formacie. Po zebraniu pożądanych komórek kliknij "unload", aby usunąć kolektora ze sceny.
Sprawdź, czy w kapsle pozostało 10 mikrolitrów buforu trawienia proteazy K i w razie potrzeby uzupełnij. Zamknij rurkę i dokładnie ją zawietrz. Następnie krótko obróć rurkę w wirówce.
Przechowuj probówkę w temperaturze do minus 80 stopni Celsjusza aż do ekstrakcji RNA. Przekrój wątroby barwiony hematoksyliną na szkiełku długopisowym był widoczny pod mikroskopem przed i po mikrosekcji laserowej. Obszary zainteresowania wykazujące mikropęcherzykową steatozę zostały precyzyjnie zebrane do kapsułki rurki PCR.
Zachowując nienaruszoną morfologię komórkową. Całkowity kwas rybonukleinowy wyekstrahowany z około 1000 i 2000 komórek mikroskopii laserowej mikroskopii odbierającej dał odpowiednio 110,7 nanograma i 213,3 nanograma. Wszystkie próbki wykazywały wysoką czystość z absorpcją 260 na 280 nanometrów w zakresie od 1,9 do 2,1.
Elektroforeza żelowa wykazała wyraźne pasma rybosomalnych rybosomalnych rybo-nukleinowych. Bioanalizatorowe profile kwasu rybonukleinowego z zaledwie 1000 komórek. Otrzymał integralność kwasu rybonukleinowego 6,7.
Q-R-T-P-C-R dla genu housekeeping beta-aktyna dał wartości progowe cyklu w zakresie od 17 do 19. Ocena bibliotek sekwencjonowania przez bioanalizator skonstruowana z 50 nanogramów całkowitego kwasu rybonukleinowego wykazała charakterystyczny szczyt między 300 a 500 parami zasad. Sekwencjonowanie RNA tych bibliotek dało dane wysokiej jakości z wynikami Q 20 i Q 30, przekraczającymi 90% oraz niskim wskaźnikiem błędów w różnych replikacjach.
Ważnym aspektem jest zapobieganie degradacji poprzez kontrolowane zatrzymywanie, szybkie barwienie i warunki proste poprzez nasze przetwarzanie. Zamówienie tej procedury pozwala na jej wykorzystanie do PCR w czasie rzeczywistym oraz sekwencjonowania z kluczami biblioteki zoptymalizowanymi do fragmentacji. Ustalona w próbkach wątroby.
Protokół ten umożliwia profilowanie podgrup hepatocytów i wspiera badania hepatologiczne skoncentrowane na patologii.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
