Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy
3 kwietnia 2026
Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.
Protokół ten wprowadza przede wszystkim metodę pozyskiwania wysokiej jakości pojedynczych komórek z nienaruszonych rogówek myszy. Nasza metoda to użyteczne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co pozwala im być kompatybilnymi z zastosowaniami w kolejnych fazach, takich jak pojedyncze komórki na grubym, cienkim i przepływowym przebiegu. Na początek umieść uśpioną myszkę C57BL6 w wieku od sześciu do ośmiu tygodni na sterylnym stole do sekcji ciała.
Po przepłukaniu zamkniętych powiek PBS użyj nożyczek okulistycznych, aby wykonać nacięcie wzdłuż tylnego bieguna gałki ocznej, a następnie ostrożnie umieść odizolowane oko w szalce Petriego zawierającej lodowate, uzupełniające hormonalne nabłonkowe medium. Po trzykrotnym płukaniu gałki ocznej 1XPBS z dodatkiem 5% streptomycyny penicyliny, użyj nożyczek okulistycznych i kleszczy, aby wykonać nacięcie od tylnego bieguna w kierunku limbusu rogówki. Delikatnie odłącz rogówkę od twardówki i spojówki wzdłuż granicy kończyny, a następnie za pomocą dwóch par kleszczy całkowicie usuń soczewkę i tęczówkę.
Po trzykrotnym przemyciu tkanki rogówki w PBS przenieś czystą tkankę do nowej rurki. Dodaj jeden mililitr pięciu miligramów na roztwór kolagenazy A i pokrój tkankę na fragmenty o wymiarach około 0,5 na 0,5 milimetra za pomocą nożyczek okulistycznych. Inkubuj probówkę zawierającą fragmenty rogówki w roztworze kolagenazy A w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.
Sprawdzaj tkankę co 10 minut podczas trawienia. Gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanki, odwidź próbkę w 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie aspiruj supernatant. Następnie ponownie zawiesić pellet w 200 mikrolitrach roztworu EDTA 0,25% trypsyny.
Umieść probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionych na 37 stopni Celsjusza na 10 minut, aby strawić pozostałe fragmenty tkanek. Na koniec użyj pipety P1000 wyposażonej w końcówkę o szerokim przełycie, aby delikatnie trójić mieszankę i uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Wiruj zawiesinę ogniwową, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesij pellet komórkowy w PBS zawierającym 0,04% BSA.
Po zliczeniu izolowanych komórek rogówki za pomocą hemocytometru stwierdzono, że z ośmiu komórek uzyskano łącznie 1,05 razy 10 do mocy pięciu komórek o średniej żywotności komórek 94,6% i stosunku pojedynczych komórek przekraczających 96,3%, co potwierdza przydatność zawiesiny do dalszych zastosowań. Analiza immunofluorescencji wykazała, że zawiesina komórkowa składała się z 83,5% komórek nabłonkowych z dodatnim wynikiem pan-CK, 13,5% komórek stromalnych z dodatnim keratokiem oraz około 3% komórek ujemnych dla obu markerów. RNA wyodrębnione z zawiesiny jednokomórkowej wykazywało wysoką integralność RNA około 8,8 oraz stosunek rybosomalnego RNA 28S na 18S około 2,15, co potwierdza doskonałą jakość RNA.
Po uzyskaniu pojedynczych komórek możemy scharakteryzować funkcję komórek rogówki i eksplorację śladów powierzchniowych. W tym kontekście badanie interakcji międzykomórkowych. Wyzwaniem w tej metodzie jest praktyczne oddzielenie rogówki od innych tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia solidny protokół izolacji wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek mysich. Metoda ta łączy precyzyjną dyssekcję tkanki z sekwencyjnym trawieniem enzymatycznym, co umożliwia przygotowanie żywotnych pojedynczych komórek odpowiednich do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) oraz cytometria przepływowa. Protokół pozwala na uzyskanie wysokiej liczby komórek, doskonałej żywotności oraz zachowanie integralności RNA, co ułatwia szczegółową analizę heterogeniczności komórkowej rogówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Oftalmologia
- Biologia komórki
- Analiza pojedynczych komórek
Wprowadzenie
- Rogówka jest zewnętrzną warstwą oka, niezbędną dla widzenia oraz homeostazy powierzchni gałki ocznej.
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) wymaga wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych.
- Tkanka rogówki jest gęsta i złożona, co sprawia, że dysocjacja komórek jest trudna.
- Istniejące protokoły często skutkują niską żywotnością komórek lub słabą jakością RNA.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z nienaruszonych rogówek mysich.
- Zapewnienie wysokiej żywotności komórek oraz integralności RNA na potrzeby dalszych analiz.
- Umożliwienie dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji głównych typów komórek rogówki.
Zastosowane metody
- Disekcja rogówek ueutanazowanych myszy C57BL6.
- Sekwencyjne trawienie enzymatyczne z użyciem kolagenazy A oraz trypsyny-EDTA.
- Mechaniczne rozdrobnienie i delikatna tryturacja w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
- Ocena żywotności komórek przy użyciu barwienia błękitem trypanowym i zliczania w hemocytometrze.
- Barwienie immunofluorescencyjne na pancytokeratynę (komórki nabłonka) oraz keratokan (komórki zrębu).
- Analiza integralności RNA z użyciem bioanalizatora.
Główne wyniki
- Uzyskano około 1,05 × 105 komórek z ośmiu rogówek.
- Wysoka żywotność komórek (94,6%) i odsetek pojedynczych komórek (96,3%).
- Skład komórkowy: 83,5% pan-CK-dodatnich komórek nabłonkowych, 13,5% keratokan-dodatnich komórek zrębu, ~3% ujemnych dla obu markerów.
- Wskaźnik integralności RNA (RIN) na poziomie ~8,8 oraz stosunek 28S/18S rRNA wynoszący ~2,15, co wskazuje na doskonałą jakość RNA.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na niezawodne otrzymywanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z rogówek myszy.
- Przygotowane preparaty komórkowe nadają się do wymagających zastosowań analitycznych, w tym do scRNA-seq.
- Metoda ta ułatwia szczegółowe badania funkcji komórek rogówki oraz oddziaływań międzykomórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek z rogówek myszy są niezbędne dla rozwoju badań okulistycznych na etapie odkryć oraz umożliwiają wysokorozdzielcze profilowanie komórkowe. Niniejszy protokół rozwiązuje krytyczny problem przygotowania żywotnych, z nienaruszonym RNA pojedynczych komórek z gęstej tkanki oka, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność późniejszych analiz pojedynczych komórek. Solidne przygotowanie komórek zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i wspiera ciągłość translacyjną między etapem odkryć a badaniami przedklinicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej rogówki z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie żywotności komórek i integralności RNA.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki dokładnej identyfikacji typów komórek.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celów okulistycznych na wczesnym etapie badań.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Zapewnia standaryzowane zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności do opracowywania testów.
- Gwarantuje powtarzalność i ilościowe wyniki w przypadku późniejszego sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
- Przygotowuje zwalidowany materiał biologiczny do skalowalnych procesów przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na odrębne populacje komórek rogówki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby dzięki zachowaniu naturalnej różnorodności komórek rogówki.
- Utrzymuje jakość RNA niezbędną do odkrywania i walidacji translacyjnych biomarkerów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając ciągłość danych od etapu odkrycia po fazę przedkliniczną.
- Ogranicza niejednoznaczność biologiczną w przedklinicznych badaniach okulistycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając płynne przejście od dysocjacji tkanek do analizy pojedynczych komórek oraz późniejszych badań funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie wysokiej wierności profilowania pojedynczych komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe zawiesiny pojedynczych komórek, gotowe do analiz i przesiewania związków.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne wskaźniki żywotności komórek, kwantyfikacji typów komórek oraz integralności RNA do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zachowuje różnorodność komórkową i jakość RNA w celu dopasowania biomarkerów i walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany protokół możliwy do adaptacji w różnych programach badawczych w dziedzinie okulistyki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne preparaty pojedynczych komórek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową w badaniach i rozwoju w dziedzinie okulistyki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu dyssekcji tkanek oka oraz technik trawienia enzymatycznego.
- Niezbędny jest dostęp do testów żywotności komórek, immunofluorescencji oraz aparatury do analizy integralności RNA.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych typów gęstych tkanek po optymalizacji protokołu.
- Precyzja w separacji tkanek jest krytyczna, aby uniknąć kontaminacji i zapewnić czystość próbek.
