Name: Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:33:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowe z rogówek myszy przy użyciu sekwencyjnego trawienia enzymatycznego. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając analizy scRNA-seq oraz cytometrię przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność i szacunek wszystkim zwierzętom, które przyczyniły się do rozwoju swoich komórek w tym badaniu. Badanie to było częściowo wspierane przez Prowincjonalne Projekty Naukowo-Technologiczne Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [do S.O.]); Fundusz Naukowy Prowincji Fujian dla Wybitnych Młodych Naukowców (2023J06053 [dla S.O]); Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82101084 [dla S.O.]; Prowincjonalny Program Badań Podstawowych Guizhou (nauki przyrodnicze) (QKHJC-ZK[2025]MS-473) [dla S.O.]; Fundusz Unii Badań Medycznych na rzecz wysokiej jakości rozwoju zdrowia prowincji Guizhou (2024GZYKYJJKM0043) [dla S.O.].

Samice myszy C57BL/6 (B6), w wieku 6-8 tygodni, zostały dostarczone przez Centrum Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou. Zwierzęta były trzymane w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności , z czasem dostępem do jedzenia i wody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou (Nr 2305185) i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie narzędzi chirurgicznych: Oczyść dwie pary nożyczek okulistycznych, dwie pary kleszczy okulistycznych, jedną parę kleszczy tkankowych oraz jedną rurkę wirówki o pojemności 2 mL poprzez dwukrotne płukanie wodą destylowaną (DDW). Wysterylizuj instrumenty i rurkę za pomocą autoklawu parowego. Wszystkie produkty susz przez noc w tradycyjnym piekarniku w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu<ol>
		<li>Dodatkowe hormonalne medium nabłonkowe (SHEM): Przygotuj SHEM, uzupełniając podłoże DMEM/F12 o następujące składniki: 5% (v/v) surowicę płodową bydła (FBS), 0,5% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO), 10 ng/mL czynnika wzrostu naskórka myszy, transferynę 5,5 μg/mL, hydrokortyzonu 0,5 μg/mL, 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny). UWAGA: SHEM służy do utrzymania żywotności komórek podczas przetwarzania. Można ją zastąpić alternatywnymi podłożami, takimi jak bazalny DMEM lub fosforanowa buforowana sól fizjologiczna (PBS) zawierająca co najmniej 10% (v/v) FBS.</li>
		<li>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)<ol>
			<li>Rozpuścić 22,4 g proszku PBS w 2 L wody podwójnie destylowanej (DDW) pod mieszaniem za pomocą mieszadła magnetycznego, aby uzyskać 1× PBS.</li>
			<li>Zautoklaw roztwór PBS dzień wcześniej i pozwól mu ostygnąć.</li>
			<li>W warunkach sterylnych przelej 47,5 mL sterylnego 1× PBS do probówki wirówki 50 mL i dodaj 2,5 mL 1% (v/v) penicylin-streptomycyny. UWAGA: Formuła 1× PBS (2 L) zawiera 137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4 oraz 2 mM NaH2PO4, pH 7,2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozwiązania kolagenazy A<ol>
			<li>Roztwór zapasowy: Rozpuścić 1 g proszku kolagenazy A w 40 mL DDW. Filtr sterylizuj przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
			<li>Roztwór roboczy: Rozcieńcz 1 mL roztworu kolagenazy A w 4 mL sterylnego DDW, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mg/mL.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Roztwór trypsyny: Rozmraża dostępny komercyjnie roztwór 0,25% (w/v) trypsyny/EDTA (zawierający 0,91 mM EDTA) na lodzie przed użyciem.</li>
		<li>Roztwór Trypan Blue (0,4%): Rozpuszcz 0,4 g Trypan Blue w 100 mL DDW. Przefiltruj za pomocą papieru filtrującego i przechowuj w temperaturze 4 °C. UWAGA: Roztwór Trypan Blue 0,4% służy do oceny całkowitej liczby komórek, proporcji pojedynczych komórek oraz żywotności. Może być zastępowany komercyjnymi zestawami do barwienia żywych/martwych lub zautomatyzowanymi systemami liczenia komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie rogówek myszy
<ol>
	<li>Wysterylizuj mikroskop i miejsce robocze, przecierając 75% etanolem, a następnie wystaw to miejsce na działanie światła UV wewnątrz szafki zabezpieczającej przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotuj następujące szalczki w warunkach sterylnych: jedną szalkę Petriego o średnicy 60 mm z 5 mL medium SHEM, trzy szalki Petriego o pojemności 60 mm, każda zawierająca 5 mL 1× PBS z dodatkiem 5% penicylin-streptomycyny (P-S), trzy szalerze Petriego o średnicy 60 mm, każda z 5 mL zwykłego 1× PBS oraz jedną sterylną rurkę do wirówki 2 mL</li>
	<li>Uśpienie myszy za pomocą uduszeniaCO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Dokładnie przepłucz głowicę myszy i zamknięte powieki przez trzykrotne zanurzenie w PBS zawierającym 5% P-S, zanim przejdziesz do enukleacji.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek okulistycznych wykonaj nacięcie wzdłuż tylnego bieguna każdej gałki ocznej i ostrożnie umieść izolowane oczy w szalce Petriego zawierającej lodowato zimne medium SHEM (Rysunek 1A). UWAGA: Aby zmaksymalizować żywotność komórek, wszystkie roztwory powinny być wstępnie schłodzone do 4 °C, a wszystkie etapy sekcji muszą być wykonywane na lodzie.</li>
	<li>Natychmiast przenieś szalkę Petriego z gałkami ocznymi do szafki biologicznej bezpieczeństwa. Przemyj gałki oczne trzy razy w 1× PBS zawierającym 5% P-S, inkubując przez 5 minut podczas każdej płukania.</li>
	<li>Pod mikroskopem rozcinającym ostrożnie oddziel tkankę rogówki: Za pomocą nożyczek okulistycznych i kleszczy wykonaj nacięcie od bieguna tylnego w kierunku limbusu rogówki. Delikatnie odłącz rogówkę od twardówki i spojówki wzdłuż krawędzi limbala. Całkowicie usuń soczewkę i tęczówkę, używając dwóch par kleszczy (Rysunek 1B).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy okulistycznych przenieś tkankę rogówki do szalki Petriego zawierającej 1× PBS i przepłucz trzy razy (po 5 minut każda), aby usunąć resztki tkanki nierogówki i antybiotyki. UWAGA: Tęczówka często mocno przylega do rogówki. Upewnij się, że jest delikatnie i całkowicie usunięta za pomocą kleszczy, aby uniknąć zanieczyszczenia, pozostawiając jedynie przezroczystą tkankę rogówki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy okulistycznych przenieś oczyszczoną tkankę rogówki do rurki wirówki o pojemności 2 mL i dodaj 1 ml roztworu roboczego kolagenazy A (5 mg/mL).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek okulistycznych pokrój tkankę rogówki na fragmenty o grubości około 0,5 mm × 0,5 mm bezpośrednio wewnątrz rurki.</li>
	<li>Inkubuj probówkę zawierającą fragmenty rogówki i roztwór kolagenazy A w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (rysunek 2A-C).</li>
	<li>Podczas trawienia kolagenazy A monitoruj tkankę co 10 minut. Zakończ trawienie, gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanek, przechodząc do wirowania. Wiruj próbkę w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w wirówce. Ostrożnie zasysaj supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet w 200 μL roztworu trypsyny/EDTA o stężeniu 0,25%.</li>
	<li>Inkubuj probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby strawić pozostałe fragmenty tkanki.</li>
</ol>
3. Izolacja pojedynczych komórek rogówki
<ol>
	<li>Delikatnie trituruj mieszaninę (tkankę i roztwór trypsyny/EDTA) wielokrotnie za pomocą pipety P1000 z szerokim końcówką, aby rozłożyć tkankę do zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	<li>Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 300 x g przez 5 minut i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1 mL PBS zawierającego 0,04% albuminy surowicy bydłej (BSA), aby uzyskać zawiesinę pojedynczą. UWAGA: W przypadku komórek przeznaczonych do sekwencjonowania lub cytometrii przepływowej należy ponownie zawiesić w PBS bez surowicy (PBS). Dla komórek, które będą hodowane, użyj 1x PBS z dodatkiem 0,04% BSA.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez wstępnie zwilżony filtr komórek o pojemności 40 μm do nowej rurki wirówki 50 mL, aby usunąć grudki i zanieczyszczenia. UWAGA: Wstępnie zwilż sitko komórkowe PBS, aby zminimalizować utratę komórek. W razie potrzeby filtrowane komórki można ponownie odwirować i zawiesić w pożądanej objętości do stężenia.</li>
</ol>
4. Liczenie komórek
<ol>
	<li>Połącz 9 μL zawiesiny ogniwowej z 1 μL roztworu 0,4% Trypan Blue i wymieszaj delikatnie.</li>
	<li>Powoli ładuj mieszankę do komory hemocytometru przez wyznaczony kanał załadunku. Policz komórki metodą czterech kwadrantów, aby określić całkowitą liczbę komórek, żywotność oraz proporcję pojedynczych komórek. Wykonaj co najmniej dwie techniczne repliki.</li>
</ol>

<ol><li>Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+cornea%3Astructure%2C+function%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the cornea:structure, function, and development.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).</li>
<li>Delmonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+management%3Atargeting+the+ocular+surface+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).</li>
<li>Dou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+limbal+heterogeneity+involved+in+corneal+homeostasis+and+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege.</a> Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).</li>
<li>Adan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3Abasic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry:basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Altshuler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+limbal+epithelial+stem+cell+populations+mediate+corneal+homeostasis+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).</li>
<li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+transcriptome+helps+define+the+limbal%2Fcorneal+epithelial+stem%2Fearly+transit+amplifying+cells+and+how+autophagy+affects+this+population%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).</li>
<li>Collin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+cell+atlas+of+human+cornea+that+defines+its+development%2C+limbal+progenitor+cells+and+their+interactions+with+the+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells.</a> Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+method+for+achieving+a+single-cell+suspension+from+mouse+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas.</a> Exp Eye Res. 233, 109544(2023).</li>
<li>Espana, E. M., Birk, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+structure+and+function+of+the+corneal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Composition, structure and function of the corneal stroma.</a> Exp Eye Res. 198, 108137(2020).</li>
<li>Topouzi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+and+3D+culture+of+dermal+papilla+cells+from+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles.</a> Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+amniotic+membrane+de-epithelialization+method+on+its+biological+properties+and+ability+to+promote+limbal+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).</li>
<li>Hewett, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+endothelial+cells+from+micro-+and+macro-vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels.</a> Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+small+slow-cycling+Langerhans+cells+in+the+limbal+basal+epithelium+that+express+ABCG2%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2.</a> Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).</li>
<li>Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+methods+to+isolate+mouse+limbal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells.</a> Exp Eye Res. 212, 108767(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Wprowadzenie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek znacząco zwiększyło wykorzystanie technologii genomicznych, transkryptomicznych, epigenetycznych i proteomicznych w badaniach okulistycznych 9,10,11,12. W konsekwencji przygotowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek stało się coraz ważniejsze, ponieważ pozwala wykrywać różnice sygnalizacyjne między pojedynczymi komórkami i dost...

Rogówka, położona w najbardziej zewnętrznej warstwie gałki ocznej, jest niezbędna do swojej bariery i funkcji refrakcyjnej, ze względu na wysoce zorganizowaną architekturę składającą się z pięciu odrębnych warstw: nabłonka, warstwy Bowmana, stromy, błony Descemeta oraz śródbłonka1. Nabłonek rogówki to niekeratynowa, warstwowa struktura płaskokształtna, która stanowi fizyczną barierę przed patogenami zewnętrznymi i wykazuje silne właściwości antybakteryjne i regeneracyjne. Zławie, złożone z precyzyjnie ułożonych włókien kolagenowych, zachowuje przezroczystość rogówki oraz jednolity współczynnik załamaniaświatła 2. Śródbłonek, będący warstwą jednokomórkową, reguluje transfer płynów między stromą a wodną korzycią, zachowując tym samym nawodnienie rogówki i dopływ składników odżywczych3. Niemniej jednak ta złożoność strukturalna i komórkowa historycznie stanowiła poważne wyzwania w badaniu funkcji biologicznych rogówki i ich mechanizmów4.
Aby badać interakcje międzykomórkowe i identyfikować markery specyficzne dla typu komórek, szeroko stosuje się techniki takie jak sortowanie cytometrii przepływowej5 oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq)6 . Główną przeszkodą techniczną wspólną dla obu podejść jest jednak przygotowanie wysokiej jakości zawiesin jednokomorowych. Parametry takie jak całkowita wydajność komórek, udział pojedynczych komórek oraz żywotność komórek są kluczowe dla wiarygodności dalszych zastosowań mających na celu charakteryzację funkcji komórek rogówki i ekspresji markerów powierzchniowych7. Pomimo jego znaczenia, nadal brakuje ustandaryzowanych i efektywnych protokołów generowania zawiesin jednokomórkowych z całych rogówek myszy.
Opracowano kilka metod pozyskiwania zawiesin jednokomórkowych z tkanki rogówki. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne z użyciem kolagenazy A, trypsyny lub TrypLE zostało wykorzystane do izolowania pojedynczych komórek zarówno z rogówki ludzkiej, jak i mysiej8. Powtarzająca się trypsynizacja była również stosowana do dysocjacji rogówki⁷. Dodatkowo komercyjne zestawy do dysocjacji wielotkankowej, takie jak te firmy Miltenyi Biotec, zostały z powodzeniem zastosowane do generowania zawiesin pojedynczych komórek rogówki9. W naszym wcześniejszym badaniu porównawczym różnych metod trawienia rogówki wykazaliśmy, że sekwencyjne leczenie kolagenazą i trypsyną stanowi optymalne podejście. Metoda ta konsekwentnie daje wysoką liczbę komórek, doskonałą żywotność (≥94,6%), wysoki odsetek pojedynczych komórek (96,3%) oraz dobrze zachowaną integralność RNA10.
W tym protokole przedstawiamy szczegółową, krok po kroku procedurę generowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych z całych rogówek myszy, wykorzystując tę zoptymalizowaną strategię trawienia enzymatycznego, opartą na naszych ugruntowanych doświadczeniach i wcześniejszych ustaleniach.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwkrólikowy przeciw osłom</td><td>Abcam</td><td>ab150064</td><td></td></tr><tr><td>Antykeratyna</td><td>Abcam</td><td>ab230175</td><td></td></tr><tr><td>Antypancytokeratyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AE1/AE3, Alexa FluorTM 488</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator autoklawu</td><td>An Shen</td><td>LDZH-100KBS</td><td></td></tr><tr><td>Albumina serum bydła V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr komórkowy</td><td>NEST</td><td>258369</td><td>40 &mu; m</td></tr><tr><td>Maszyna odśrodkowa</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331 Hamburg</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>&nbsp; Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Tablica licząca</td><td>MARIENFELD</td><td>M407859</td><td></td></tr><tr><td>Rurka odśrodkowa</td><td>NEST</td><td>620611</td><td>2 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Slip pokrywkowy</td><td>MARIENFELD</td><td>M407859</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0065</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop rozcinający</td><td>Carl ZEISS</td><td>VISU150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp; Media</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; bovine&nbsp; surowica</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Solarbio</td><td>IH0100</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Gibco</td><td>23337619</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu naskórka myszy</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>chirurgii okulistycznej&nbsp; Kleszcze</td><td>Dumot</td><td>0208-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne okulistyczne</td><td>FST</td><td>15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>AISITE</td><td>DH6000 II</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>NEST</td><td>705201</td><td>60mm</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator termostatyczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>T8070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>Stół ultra-czyszczący</td><td>You Qi</td><td>VS-840-2</td><td></td></tr><tr><td>4% paradehydu</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

A Protocol for Harvesting Single-cell Suspension from Mouse Corneas

Jako najbardziej zewnętrzna warstwa gałki ocznej, rogówka odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy powierzchni oka i widzenia. Najnowsze osiągnięcia w sekwencjonowaniu pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) umożliwiły wysoką rozdzielczość analizę heterogeniczności komórek rogówki, jednak przygotowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z tkanki rogówki pozostaje wyzwaniem ze względu na ich gęstą i złożoną strukturę. W tym badaniu ustalamy solidny protokół generowania zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy. Procedura polega na rozdrobnieniu rogówek na drobne fragmenty, a następnie sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym przy użyciu kolagenazy A i trypsyny. Jakość zawiesziny komórkowej oceniano za pomocą wielu wskaźników: do oceny żywotności i liczebności komórek zastosowano barwienie trypanowe na niebieski; barwienie immunofluorescencyjne dla pancytokeratyny i keratokanu umożliwiło identyfikację i ilościowe określenie głównych typów komórek rogówki; a integralność RNA została zweryfikowana za pomocą bioanalizatora. Protokół ten konsekwentnie zapewnia przygotowania pojedynczych komórek o wysokiej liczbie komórek, doskonałej żywotności (≥ 94,6%) oraz wysokim odsetku pojedynczych komórek (96,3%), spełniając wymagania zgodne z wymagającymi zastosowaniami w dalszej fazie, w tym scRNA-seq.

Jakość zawiesin jednokomórkowych oceniano na podstawie całkowitej wydajności komórek, proporcji pojedynczych komórek oraz żywotności komórek. Zawieszenie zostało zabarwione Trypan Blue i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej w wielu polach (Rysunek 3). Z czterech oczu myszy (osiem rogówek) uzyskano łącznie 1,05 × 105 komórek , ze średnią żywotnością komórek 94,6% i stosunkiem pojedynczych komórek przekraczającym 96,3%. Wyniki te potwierdzają, że przygotowana za...

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

As the outermost layer of the eyeball, the cornea plays a critical role in maintaining ocular surface homeostasis and vision. Recent advances in ...

Protokół ten wprowadza przede wszystkim metodę pozyskiwania wysokiej jakości pojedynczych komórek z nienaruszonych rogówek myszy. Nasza metoda to użyteczne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co pozwala im być kompatybilnymi z zastosowaniami w kolejnych fazach, takich jak pojedyncze komórki na grubym, cienkim i przepływowym przebiegu. Na początek umieść uśpioną myszkę C57BL6 w wieku od sześciu do ośmiu tygodni na sterylnym stole do sekcji ciała.Po przepłukaniu zamkniętych powiek PBS użyj nożyczek okulistycznych, aby wykonać nacięcie wzdłuż tylnego bieguna gałki ocznej, a następnie ostrożnie umieść odizolowane oko w szalce Petriego zawierającej lodowate, uzupełniające hormonalne nabłonkowe medium. Po trzykrotnym płukaniu gałki ocznej 1XPBS z dodatkiem 5% streptomycyny penicyliny, użyj nożyczek okulistycznych i kleszczy, aby wykonać nacięcie od tylnego bieguna w kierunku limbusu rogówki. Delikatnie odłącz rogówkę od twardówki i spojówki wzdłuż granicy kończyny, a następnie za pomocą dwóch par kleszczy całkowicie usuń soczewkę i tęczówkę.Po trzykrotnym przemyciu tkanki rogówki w PBS przenieś czystą tkankę do nowej rurki. Dodaj jeden mililitr pięciu miligramów na roztwór kolagenazy A i pokrój tkankę na fragmenty o wymiarach około 0,5 na 0,5 milimetra za pomocą nożyczek okulistycznych. Inkubuj probówkę zawierającą fragmenty rogówki w roztworze kolagenazy A w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Sprawdzaj tkankę co 10 minut podczas trawienia. Gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanki, odwidź próbkę w 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie aspiruj supernatant. Następnie ponownie zawiesić pellet w 200 mikrolitrach roztworu EDTA 0,25% trypsyny.Umieść probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionych na 37 stopni Celsjusza na 10 minut, aby strawić pozostałe fragmenty tkanek. Na koniec użyj pipety P1000 wyposażonej w końcówkę o szerokim przełycie, aby delikatnie trójić mieszankę i uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Wiruj zawiesinę ogniwową, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesij pellet komórkowy w PBS zawierającym 0,04% BSA.Po zliczeniu izolowanych komórek rogówki za pomocą hemocytometru stwierdzono, że z ośmiu komórek uzyskano łącznie 1,05 razy 10 do mocy pięciu komórek o średniej żywotności komórek 94,6% i stosunku pojedynczych komórek przekraczających 96,3%, co potwierdza przydatność zawiesiny do dalszych zastosowań. Analiza immunofluorescencji wykazała, że zawiesina komórkowa składała się z 83,5% komórek nabłonkowych z dodatnim wynikiem pan-CK, 13,5% komórek stromalnych z dodatnim keratokiem oraz około 3% komórek ujemnych dla obu markerów. RNA wyodrębnione z zawiesiny jednokomórkowej wykazywało wysoką integralność RNA około 8,8 oraz stosunek rybosomalnego RNA 28S na 18S około 2,15, co potwierdza doskonałą jakość RNA.Po uzyskaniu pojedynczych komórek możemy scharakteryzować funkcję komórek rogówki i eksplorację śladów powierzchniowych. W tym kontekście badanie interakcji międzykomórkowych. Wyzwaniem w tej metodzie jest praktyczne oddzielenie rogówki od innych tkanek.

a-protocol-for-harvesting-single-cell-suspension-from-mouse-corneas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Ten film pokazuje hodowlę komórek glejowych Müllera (MG) wyizolowanych z siatkówki myszy. Siatkówki są dysocjowane w zawiesinę jednokomórkową za pomocą enzymów trawiennych. Komórki są następnie hodowane w pożywce z czynnikiem wzrostu, który sprzyja proliferacji komórek MG i śmiertelności komórek neuronalnych. Martwe komórki neuronalne są usuwane podczas pasażowania, a komórki MG są hodowane w celu dalszej analizy.

Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Naucz się izolować wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowe z rogówek myszy przy użyciu sekwencyjnego trawienia enzymatycznego. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając analizy scRNA-seq oraz cytometrię przepływową.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Przeglądaj więcej filmów