Name: Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj test neutralizacji z redukcją fluorescencji do pomiaru przeciwciał neutralizujących HEV. Ta metoda wykorzystuje komórki Huh7 i immunofluorescencję do oceny szczepionek i terapii antywirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było częściowo sfinansowane z grantu Biotechnology Industry Research Assistance Council, Departament Biotechnologii, Rząd Indii, przyznanego MS, S i BN. Badania w laboratorium MS są wspierane przez grant rdzenny z Translational Health Science and Technology Institute. SA jest wspierany przez stanowisko Project Research Scientist finansowane przez Indian Council of Medical Research, Rząd Indii. UB jest wspierany przez Senior Research Fellowship z Departament Biotechnologii, Rząd Indii.

Zezwolenie instytucjonalnego komitetu etycznego (IEC) zostało uzyskane w celu pobrania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV przyjętego na Oddział Gastroenterologii, AIIMS, New Delhi. Pacjenci wzięli udział w badaniu po uzyskaniu pisemnej zgody. Szczegóły reagentów i wykorzystanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Izolacja i ilościowa ocena wirusa
<ol>
	<li>Z pacjentem zakażonym wirusem HEV, po uzyskaniu pisemnej zgody, pobrać próbkę kału do oczyszczenia wirusa.</li>
	<li>Resuspendować próbkę kału w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS) w stężeniu końcowym 10% (w/v) i wirować przez 1h w temperaturze 4 °C przy prędkości 7800 x g. 
	​UWAGA: Podczas pobierania próbki kału od pacjenta zakażonego wirusem HEV używać rękawic, a obszar roboczy wyczyścić 70% etanolem po zakończeniu pracy (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa).</li>
	<li>Zebrać surowiec i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Dodać 8% PEG6000 przygotowane w 0,4 M NaCl do surowiczego surowca i inkubować przez 16 h w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>Wirować próbkę przez 30 min w temperaturze 4 °C przy prędkości 18 000 x g.</li>
	<li>Odstawić surowiec i resuspendować osadu w 40 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Skoncentrować surowca do objętości 5 mL przez filtrację przepływową (TFF) za pomocą 30 kDa przepustki membranowej. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm w szafie biobezpieczeństwa, wykonać alikwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć jednej alikwoty do izolacji całkowitego RNA i wykonania RT-qPCR.</li>
	<li>Użyć wielu rozcieńczeń plazmidu pSK-HEV2 [wektor pBluscript zawierający cDNA zakaźnej klonu g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng do 0,000001 ng DNA/reakcja w 10x rozcieńczeniu szeregowym) do wykreślenia krzywej standardowej do ilościowej oceny RNA wirusowego.</li>
	<li>Wykreślić wykres z ilością DNA pSK-HEV2 na osi X i odpowiadającymi wartościami Ct na osi Y. Z wykresu standardowego wyznaczyć stężenie RNA wirusowego.</li>
	<li>Ilościowo ocenić poziom RNA g1-HEV z wykresu standardowego i obliczyć liczbę kopii genomu wirusa według wzoru: Liczba kopii = ng*(liczba/mol) / bazy *(ng/g)*(g/mol baz).</li>
</ol>
2. Zakażenie komórek Huh7 g1-HEV
<ol>
	<li>Pobrać flakon T75 zawierający komórki Huh7. Pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki są konfluencyjne i zdrowe.</li>
	<li>Wybrać medię za pomocą aspiratora (wszystkie kroki wykonywać w szafie biobezpieczeństwa). Dodać 10 mL DPBS, zetrzeć i wybrać.</li>
	<li>Dodać 1 mL 0,05% roztworu trypsyny, upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzona na powierzchni.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze CO2 przez 30-60 s, aż komórki będą w 90% odczepione.</li>
	<li>Dodać 5 mL pełnego medium, równomiernie rozprowadzić na całej powierzchni T75 i wielokrotnie pipetować, aby uzyskać jednorodną populację pojedynczych komórek wolną od agregatów.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do 50 mL szybkiego probierka stożkowego, wirować przez 5 min w temperaturze pokojowej przy prędkości 200 x g.</li>
	<li>Wybrać medię hodowlane z probierka stożkowego w szafie biobezpieczeństwa.</li>
	<li>Dodać 5 mL pełnego medium do probierka, aby zawiesić komórki w jednorodnej zawiesinie poprzez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Pobrać 10 μL zawiesiny komórek i umieścić na szkiełku do liczenia komórek. Policzyć komórki w 4 kwaterach, obliczyć średnią/mL.</li>
	<li>Zasiewać 0,5 x 106 komórek/dołka w płytce 6-dołkowej w 2 mL DMEM (uzupełnione o 10% FBS).</li>
	<li>Następnego dnia usunąć medię, przepłukać 1 mL DPBS i dodać 50 μL wirusa g1-HEV (równoważne 4,5 x 104 kopiom genomu oczyszczonego g1-HEV) w 1 mL serum-wolnego medium (SFM).</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Przepłukać komórki 500 μL DPBS, a następnie dodać 2 mL pełnego medium (DMEM uzupełnione o 2% FBS).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 72 h w inkubatorze CO2 5% w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić dalsze badania.</li>
</ol>
3. Badanie RT-qPCR
<ol>
	<li>Usunąć medię wzrostowy z płytki 6-dołkowej (z kroku 2.15) i przepłukać komórki 1 mL DPBS.</li>
	<li>Dodać 1 mL TRI Reagent bezpośrednio do płytki 6-dołkowej w celu lizy komórek. Kilkukrotnie pipetować lizat w górę i w dół, a następnie przenieść do 1,5 mL mikroprobierka do wirowania. 
	UWAGA: TRI reagent jest toksyczny w przypadku wdechni

<ol><li>Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+proposals+for+classification+of+the+family+Hepeviridae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).</li>
<li>Nan, Y., Zhang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+and+infection+of+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular biology and infection of hepatitis E virus.</a> Front Microbiol. 7, 1419(2016).</li>
<li>Kamar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+E+virus+and+chronic+hepatitis+in+organ-transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients.</a> N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).</li>
<li>Purcell, R. H., Emerson, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+E%3A+An+emerging+awareness+of+an+old+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease.</a> J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).</li>
<li>Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+E+virus%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis E virus: Advances and challenges.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Hepatitis+E%22">Hepatitis E</a>. , WHO. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e</a> (2025).</li>
<li>Songtanin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+E+virus+infections%3A+Epidemiology%2C+genetic+diversity%2C+and+clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations.</a> Viruses. 15 (6), 1389(2023).</li>
<li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+with+camelid+hepatitis+E+virus+in+a+liver+transplant+recipient+who+regularly+consumes+camel+meat+and+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk.</a> Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).</li>
<li>Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+E+virus+open+reading+frame+2+protein%3A+Beyond+viral+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid.</a> Front Microbiol. 12, 739124(2021).</li>
<li>Nair, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+induced+synthesis+of+a+novel+viral+factor+mediates+efficient+replication+of+genotype-1+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).</li>
<li>Meister, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+systems+for+the+study+of+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Cell culture systems for the study of hepatitis E virus.</a> Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).</li>
<li>Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+for+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell culture models for hepatitis E virus.</a> Viruses. 11 (7), 608(2019).</li>
<li>Kaushik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+salts+block+hepatitis+E+virus+replication+by+inhibiting+the+activity+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).</li>
<li>Gupta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+zinc+oxide+nanoparticles+and+tetrapods+against+the+Hepatitis+E+and+Hepatitis+C+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses.</a> Front Microbiol. 13, 881595(2022).</li>
<li>Ansari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+controllability+analysis+reveals+the+antiviral+potential+of+Etravirine+against+hepatitis+E+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection.</a> mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).</li>
<li>Gremmel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+E+virus+neutralization+by+porcine+serum+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies.</a> J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+high-throughput+neutralization+assay+for+hepatitis+E+virus+%28HEV%29+involving+detection+of+secreted+Porf2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2.</a> Viruses. 11 (1), 64(2019).</li>
<li>Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+PCR-based+seroneutralization+assay+in+cell+culture+for+diagnosis+of+hepatitis+E%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E.</a> J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).</li>
<li>Emerson, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+neutralization+epitopes+and+broad+cross-genotype+neutralization+of+Hepatitis+E+virus+confirmed+by+a+quantitative+cell-culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay.</a> J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).</li>
<li>Deshmukh, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+candidate+hepatitis+E+virus+DNA+vaccine+expressing+complete+and+truncated+ORF2+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice.</a> Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).</li>
<li>Gupta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+characterization+of+the+hepatitis+E+virus+like-particles+in+the+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris.</a> Front Microbiol. 11, 141(2020).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Reduction+Neutralization+Test%3A+A+novel%2C+rapid%2C+and+efficient+method+for+characterizing+the+neutralizing+activity+of+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Issues+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus.</a> Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).</li>
<li>Bewley, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+SARS-CoV-2+neutralizing+antibody+by+wild-type+plaque+reduction+neutralization%2C+microneutralization+and+pseudotyped+virus+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays.</a> Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).</li>
<li>Islam, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibodies+against+the+Japanese+encephalitis+virus+are+produced+by+a+12%C3%A1kDa+E+coli+expressed+envelope+protein+domain+III+%28EDIII%29+tagged+with+a+solubility-controlling+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide.</a> Vaccine. 56, 127143(2025).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

FRNT to metoda oparta na immunobarwieniu służąca do oszacowania potencjału neutralizującego przeciwciał. Została zastosowana do oszacowania wartości NT50 dla przeciwciał przeciwko wielu wirusom, w tym wirusowi dengue (DENV), koronawirusowi odpowiedzialnemu za ciężki ostre zespół oddechowy -2 (SARS-CoV-2) oraz wirusowi japońskiego zapalenia mózgu (JEV)23,24,25. W tej metodzie wirus jest inkubiowany z przeciwciałem test...

Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest dodatnio-pasmowym, jednoniciowym wirusem RNA, który należy do rodziny Hepeviridae1,2. Zazwyczaj powoduje samoograniczające się ostre zapalenie wątroby, ale może powodować przewlekłe zapalenie wątroby u osób z obniżoną odpornością3,4. Kobiety w ciąży mają wysokie ryzyko rozwoju fulminancyjnego niewydolności wątroby, przy czym wskaźnik śmiertelności wzrasta do 30%5. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgłosiła około 19,47 miliona przypadków ostrego zapalenia wątroby typu E (AHE) i 3450 zgonów spowodowanych przez HEV na całym świecie w 2021 roku6. HEV jest przenoszone w krajach rozwijających się głównie poprzez zanieczyszczoną żywność i wodę, z powodu złej sanitacji, podczas gdy sporadyczna infekcja zawodowa w krajach rozwiniętych jest związana z konsumpcją surowego lub niedostatecznie ugotowanego mięsa6. HEV jest klasyfikowany na osiem genotypów. Genotyp (g) 1- i g2- HEV zakaża wyłącznie ludzi. g3- i g4-HEV mają szerokie grono gospodarzy, takich jak ludzie, króliki, świnie, dziki i jelenie. g5- i g6-HEV zakażają dziki, podczas gdy g7- i g8-HEV zakażają wielbłądy. Pojedynczy przypadek ludzkiej transmisji g7-HEV został zgłoszony na Bliskim Wschodzie poprzez spożycie mięsa i mleka wielbłądów7,8. Infekcja HEV jest najczęstsza w krajach o niskim i średnim dochodzie. Kilka wodorodnych wybuchów chorób zostało zgłoszonych w endemicznych regionach Południowej i Południowo-Wschodniej Azji, Afryki i Meksyku, głównie spowodowanych przez infekcję g1- i mniej często g2-HEV. Sporadyczne przypadki infekcji zawodowej w krajach rozwiniętych w Europie i Azji Wschodniej są głównie spowodowane przez g3-HEV6,7.
Genom HEV to plus-pasmowa RNA o długości 7,2 kb zawierająca 7-metyloguaninową czapeczkę na końcu 5′, trzy otwarte ramki odczytu (ORF) i poliadenylowane końce 3’. ORF1 koduje białko niestrukturalne poliproteiny, złożone z siedmiu różnych domen: Metylotransferaza (Met), domena Y, papainowa proteaza cysteinowa (PCP), domena V, makrodoména (domena X), helikaza (Hel) i RNA-zależna polimeraza RNA (RdRp). ORF2 koduje białko kapsydu, odpowiedzialne za montaż kapsydu wirusa. ORF3 koduje fosfoproteinę, która działa jako wiroporina i pomaga w uwolnieniu wirusa9. Dodatkowa otwarta rama odczytu, ORF4, jest obecna w g1-HEV, która jest translatowana poprzez mechanizm niezależny od czapeczki, z użyciem wewnętrznego elementu przypominającego miejsce wejścia rybosomalnego, zlokalizowany w obrębie ORF1. Ekspresja ORF4 jest wzmacnana przez związki indukujące stres śródplazmatyczny. ORF4 ma być zaproponowany do promowania montażu kompleksu replikacyjnego g1-HEV10.
Mimo że HEV nie replikuje się skutecznie in vitro, niektóre szczepy wirusa, izolowane od pacjentów z zapaleniem wątroby E, zostały z powodzeniem propagowane w hepatocytach, linii komórek płuc i linii komórek nabłonkowych jelita grubego11. Jednakże trudno jest propagować wirusa mocno w hodowlach komórkowych. Zakażająca kopia cDNA g1-HEV (szczep Sar55) została użyta do badań in vitro, ale dotychczas nie udało się osiągnąć efektywnej produkcji i propagacji szczepów g1-HEV w hodowlach komórkowych. Niektóre szczepy g3- i g4-HEV rosną lepiej w hodowlach komórkowych12. Niemniej jednak, wyczyszczony wirus uzyskiwany z komórek przetransfekowanych in vitro przetranskrypcyjną i uczapeczkowaną RNA genomową HEV p6 nie jest wystarczający do wielu analiz. Co więcej, wszystkie cząsteczki HEV produkowane w hodowlach komórkowych są prawie otoczone otoczkami, co wpływa na ich zakaźność. W przeciwieństwie do tego, HEV znajdujący się w zanieczyszczonej żywności i wodzie nie ma otoczki i jest bardzo zakaźny. HEV obecny w kale pacjenta nie ma otoczki i jest częstym źródłem naturalnej infekcji. Dlatego użycie HEV wyczyszczonego z kału pacjenta zapewnia efektywną infekcję w systemie hodowlanym komórek ssaczych. Nasze wcześniejsze badania wykazały niezawodność wyczyszczonego g1-HEV z kału pacjenta w ilościowej ocenie replikacji wirusa w ludzkich komórkach hepatoma (Huh7). Wyczyszczony wirus przechowywany w -80 °C zachowuje zakaźność przez kilka lat i został wykorzystany w wielu niezależnych badaniach do oszacowania replikacji wirusowej10,13,14,15. To badanie zaprojektowało test neutralizacji HEV przy użyciu wyczyszczonego g1-HEV uzyskanego od pacjenta. Wirus został wyczyszczony, oznaczony, scharakteryzowany i przechowywany w alikwotach w -80 °C do przyszłego użycia w testach neutralizacji. P

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture dish</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>37 degree incubator shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>50163013</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>50mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-well cell culture dish</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 594 secondary IgG Antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ORF2 antibody</td><td>Genscript</td><td>NA</td><td>Syntetyzowany na zamówienie przez Genscript i charakteryzowany w naszym laboratorium14</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG antibody</td><td>Genscript</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>HIMEDIA</td><td>MB083</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>HIMEDIA</td><td>AL007A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td>FBS</td></tr><tr><td>ImageJ 1.54g</td><td>ImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>HIMEDIA</td><td>RM-10701</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>HIMEDIA</td><td>GRN3660</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline pH 7.4</td><td>HIMEDIA</td><td>TL1006</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Polyethyleneglycol 6000</td><td>SIGMA</td><td>81255</td><td>PEG6000</td></tr><tr><td>SOLIScript 1-step Probe Kit</td><td>SOLIS BIODYNE</td><td>08-57-00250</td><td></td></tr><tr><td>TRI reagent</td><td>Molecular Research Centre</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300-54</td><td></td></tr></tbody></table>

test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu e do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Hepatitis E Virus Fluorescence Reduction Neutralization Test for Measuring Neutralizing Antibody Titers

Test neutralizacji wirusowej mierzy potencjał neutralizacji przeciwciała lub mieszaniny przeciwciał przeciwko odpowiedniemu wirusowi. Jest to wartościowa technika do oceny skuteczności kandydatów na szczepionki i przeciwciał neutralizujących opracowanych przeciwko wirusowi. Test neutralizacji z redukcją płytek (PRNT) jest popularną metodą do oceny tytru przeciwciał neutralizujących specyficznych dla wirusa. Jednak PRNT nie jest wykonalny w przypadku wirusów niecytopatycznych. Wirus zapalenia wątroby typu E (HEV) jest wirusem RNA o dodatnim ładunku, pojedynczego łańcucha, należącym do rodziny Hepeviridae. Jest główną przyczyną ostrej wirusowej hepatit w skali światowej. Nie wykazuje żadnego efektu cytopatycznego w hodowli komórek ssaków. Szczepionka przeciwko HEV jest dostępna w Chinach. Jednak szczepionki lub przeciwciała terapeutyczne przeciwko HEV nie są dostępne w większości świata. Kilka laboratoriów pracuje nad kandydatami na szczepionki przeciwko HEV. Test neutralizacji do oceny skuteczności szczepionek przeciwko HEV będzie bardzo przydatnym narzędziem dla badaczy. Opisujemy tu test neutralizacji z redukcją fluorescencji (FRNT) do oszacowania 50% tytru neutralizacji (NT50) przeciwciał przeciwko HEV. Przeciwciała przeciwko HEV z neutralizowanym ORF2 lub neutralizowany HEV IgG królika zostały użyte do zakażenia komórek Huh7, po czym przeprowadzono immunofluorescencyjne barwienie białka ORF2 wirusa. Liczba fluorescencyjnych pozytywnych komórek została określona w aplikacji ImageJ, a NT50 oszacowano na 2,1 x 103. Ta metoda może być zastosowana do oszacowania NT50 przeciwciał przeciwko HEV obecnych w surowicy myszy szczepionych, surowicy osób wyzdrowiałych z HEV oraz przeciwciałach przeciwko HEV produkowanych w laboratorium.

Zakażenie komórek Huh7 wirusem g1-HEV i charakterystyka wirusa
Wirus g1-HEV wyizolowano z próbki kału w serii etapów, zgodnie z przedstawionym schematem (Rysunek 1A). Liczbę kopii genomu oczyszczonego g1-HEV oszacowano za pomocą RT-qPCR, a następnie wirusa przechowywano w temperaturze -80 °C. Aby potwierdzić infekcję wirusową i replikację, komórki Huh7 zainfekowano 1,8 × 104 ekwiwalentów kopii genomu z oczyszczonego zapasu g1-HEV przez ...

Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Virus neutralization assay measures the neutralization potential of an antibody or a mixture of antibodies against the corresponding virus. It is a ...

Głównym celem testu neutralizacji opartego na redukcji fluorescencji jest ilościowa ocena potencjału neutralizującego kandydata na szczepionkę i przeciwciał przeciwko HEV. Znany cytopatyczny charakter HEV ogranicza zastosowanie testu PRND. Ten protokół koncentruje się na immunologicznym szkoleniu PRND, aby wizualizować zainfekowane komórki i później je analizować. Na początek, zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7.Następnie, umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek na dołek w jednym mililitru pełnego DMEM uzupełnionego o 10%FBS. Inkubuj komórki przez noc w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów bezsurowicowego pożywka zawierająca 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do wysiewanych komórek.Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Użyj 500 mikrolitrów DPBS do przemycia komórek trzy razy. Dodaj dwa mililitry DMEM uzupełnionego o 2%FBS do dołków.Inkubuj komórki w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Przemyj komórki trzy razy z 500 mikrolitri DPBS, inkubująć przez pięć minut w temperaturze pokojowej między każdym przemywaniem. Dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do komórek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Następnie przemyj komórki z DPBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim przemyciu inkubuj je w DPBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego zawierającego 5% normalnego surowicy koziego, 0,5% albuminy bydlęcej i 0,3% Triton X100 w DPBS.Inkubuj w szekerze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór blokujący i przemyj raz z 500 mikrolitri DPBS. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego w rozcieńczeniu jedno do pięćset.Inkubuj komórki przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki z DPBS trzy razy, jak pokazano wcześniej. Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu jedno do tysiąc i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.Wykonaj cykl mycia i inkubacji, jak pokazano wcześniej. Dodaj 10 mikrolitrów środka przeciwzapalnego z DAPI na szkiełko. Zamontuj pokryw szklany z komórkami skierowanymi w stronę środka, unikając pęcherzyków powietrza.Zabezpiecz pokryw szklany lakierem do paznokci, aby zachować go do wizualizowania mikroskopii konfokalnej. Zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7. Następnie umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek w jednym mililitru pełnego DMEM na dołek.Następnego dnia przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenie przeciwciał przeciwko ORF2 i królicze immunoglobuliny G w pożywce bez surowicy, z początkową koncentracją przeciwciał 25 mikrogramów na mililitr, aż do końcowego rozcieńczenia 10 do potęgi minus pięć. Ostateczna objętość rozcieńczenia powinna wynosić 100 mikrolitrów. Następnie dodaj 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do każdego rozcieńczenia przeciwciała.Inkubuj mieszaninę przeciwciał i wirusa w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri DPBS. Dodaj mieszaninę przeciwciał i wirusa do komórek.Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri buforu. Po dodaniu DMEM z 2%FBS, inkubuj przez 72 godziny w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Przetwórz komórki na immunofluorescencyjne barwienie, jak pokazano wcześniej. Po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych otwórz oprogramowanie ImageJ. Wybierz Plik i otwórz obraz.Następnie wybierz Obraz, Typ i kliknij 8-bit, aby przekonwertować obraz RGB do formatu 8-bitowego. Dostosuj próg, wybierając Obraz i wybierając Dostosuj, a następnie Próg, ustawiając poziom dolny na 40, a górny na 255. Wybierz Analizuj, wybierz Analizuj Cząstki i włącz Wyświetl wyniki, Wyczyść wyniki, Podsumuj, Wyklucz na krawędziach i Kompozytowe regiony zainteresowania.Następnie kliknij OK, aby uzyskać liczbę plamek fluorescencyjnych. Oblicz procentowe neutralizację i NT50 jako antylog Log10 NT50, używając podanego wzoru. Narysuj wykres przedstawiający średnią i odchylenie standardowe wszystkich pól.Znaczący poziom kwasu rybonukleinowego g1-HEV został wykryty w zainfekowanych komórkach w porównaniu z niezainfekowanymi komórkami kontrolnymi. Test immunofluorescencyjny z użyciem przeciwciała przeciwko ORF2 potwierdził ekspresję ORF2 w zainfekowanych komórkach HuH-7. 50% tytuł neutralizacji przeciwciała przeciwko ORF2 szacowano na 2,1 razy 10 do potęgi trzy.Przedstawione obrazy pokazują wygląd niezainfekowanych i

hepatitis-e-virus-fluorescence-reduction-neutralization-test-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Ten film prezentuje test neutralizacji mierzący skuteczność surowicy w neutralizacji wirusów SARS-CoV-2. Obejmuje wirusy pseudotypowane, rozcieńczenie surowicy i kwantyfikację na podstawie luminescencji, ujawniającą miano neutralizacji.

Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Opisana tutaj jest skuteczna metoda wytwarzania zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) o wysokim mianie w celu skutecznego infekowania komórek wątroby. Dzięki przedstawionej metodzie można zbierać zarówno bezotoczkowe, jak i otoczkowe cząstki wirusa i wykorzystywać je do inokulacji różnych linii komórkowych.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Poznaj test neutralizacji z redukcją fluorescencji do pomiaru przeciwciał neutralizujących HEV. Ta metoda wykorzystuje komórki Huh7 i immunofluorescencję do oceny szczepionek i terapii antywirusowych.

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Przeglądaj więcej filmów