Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących
22 maja 2026
Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.
Głównym celem testu neutralizacji opartego na redukcji fluorescencji jest ilościowa ocena potencjału neutralizującego kandydata na szczepionkę i przeciwciał przeciwko HEV. Znany cytopatyczny charakter HEV ogranicza zastosowanie testu PRND. Ten protokół koncentruje się na immunologicznym szkoleniu PRND, aby wizualizować zainfekowane komórki i później je analizować. Na początek, zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7.
Następnie, umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek na dołek w jednym mililitru pełnego DMEM uzupełnionego o 10%FBS. Inkubuj komórki przez noc w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów bezsurowicowego pożywka zawierająca 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do wysiewanych komórek.
Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Użyj 500 mikrolitrów DPBS do przemycia komórek trzy razy. Dodaj dwa mililitry DMEM uzupełnionego o 2%FBS do dołków.
Inkubuj komórki w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Przemyj komórki trzy razy z 500 mikrolitri DPBS, inkubująć przez pięć minut w temperaturze pokojowej między każdym przemywaniem. Dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do komórek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Następnie przemyj komórki z DPBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim przemyciu inkubuj je w DPBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego zawierającego 5% normalnego surowicy koziego, 0,5% albuminy bydlęcej i 0,3% Triton X100 w DPBS.
Inkubuj w szekerze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór blokujący i przemyj raz z 500 mikrolitri DPBS. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego w rozcieńczeniu jedno do pięćset.
Inkubuj komórki przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki z DPBS trzy razy, jak pokazano wcześniej. Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu jedno do tysiąc i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
Wykonaj cykl mycia i inkubacji, jak pokazano wcześniej. Dodaj 10 mikrolitrów środka przeciwzapalnego z DAPI na szkiełko. Zamontuj pokryw szklany z komórkami skierowanymi w stronę środka, unikając pęcherzyków powietrza.
Zabezpiecz pokryw szklany lakierem do paznokci, aby zachować go do wizualizowania mikroskopii konfokalnej. Zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7. Następnie umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek w jednym mililitru pełnego DMEM na dołek.
Następnego dnia przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenie przeciwciał przeciwko ORF2 i królicze immunoglobuliny G w pożywce bez surowicy, z początkową koncentracją przeciwciał 25 mikrogramów na mililitr, aż do końcowego rozcieńczenia 10 do potęgi minus pięć. Ostateczna objętość rozcieńczenia powinna wynosić 100 mikrolitrów. Następnie dodaj 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do każdego rozcieńczenia przeciwciała.
Inkubuj mieszaninę przeciwciał i wirusa w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri DPBS. Dodaj mieszaninę przeciwciał i wirusa do komórek.
Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri buforu. Po dodaniu DMEM z 2%FBS, inkubuj przez 72 godziny w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Przetwórz komórki na immunofluorescencyjne barwienie, jak pokazano wcześniej. Po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych otwórz oprogramowanie ImageJ. Wybierz Plik i otwórz obraz.
Następnie wybierz Obraz, Typ i kliknij 8-bit, aby przekonwertować obraz RGB do formatu 8-bitowego. Dostosuj próg, wybierając Obraz i wybierając Dostosuj, a następnie Próg, ustawiając poziom dolny na 40, a górny na 255. Wybierz Analizuj, wybierz Analizuj Cząstki i włącz Wyświetl wyniki, Wyczyść wyniki, Podsumuj, Wyklucz na krawędziach i Kompozytowe regiony zainteresowania.
Następnie kliknij OK, aby uzyskać liczbę plamek fluorescencyjnych. Oblicz procentowe neutralizację i NT50 jako antylog Log10 NT50, używając podanego wzoru. Narysuj wykres przedstawiający średnią i odchylenie standardowe wszystkich pól.
Znaczący poziom kwasu rybonukleinowego g1-HEV został wykryty w zainfekowanych komórkach w porównaniu z niezainfekowanymi komórkami kontrolnymi. Test immunofluorescencyjny z użyciem przeciwciała przeciwko ORF2 potwierdził ekspresję ORF2 w zainfekowanych komórkach HuH-7. 50% tytuł neutralizacji przeciwciała przeciwko ORF2 szacowano na 2,1 razy 10 do potęgi trzy.
Przedstawione obrazy pokazują wygląd niezainfekowanych i
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje test neutralizacji z redukcją fluorescencji (FRNT), zaprojektowany do pomiaru potencjału neutralizacji przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu E (HEV). Metoda ta stanowi wartościową alternatywę dla testów neutralizacji z redukcją placków (PRNT), które nie są możliwe do zastosowania w przypadku wirusów niecytopatycznych, takich jak HEV. FRNT umożliwia badaczom oszacowanie miana neutralizacji 50% (NT50) przeciwciał anty-HEV, co wspiera rozwój szczepionek oraz przeciwciał terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Immunologia
- Opracowywanie szczepionek
Wprowadzenie
- Testy neutralizacji wirusów oceniają skuteczność przeciwciał lub szczepionek przeciwko konkretnym wirusom.
- Metoda PRNT jest powszechnie stosowana, lecz nie nadaje się do wirusów niecytopatycznych, takich jak HEV.
- HEV jest główną przyczyną ostrego wirusowego zapalenia wątroby, a powszechny dostęp do szczepionek lub przeciwciał terapeutycznych jest ograniczony.
- Niezbędne są wiarygodne testy neutralizacji do oceny kandydatów na szczepionki przeciw HEV oraz odpowiedzi przeciwciał.
Cel badania
- Opracowanie i opis testu neutralizacji opartego na fluorescencji dla HEV.
- Przedstawienie metody szacowania NT50 przeciwciał przeciwko HEV.
- Ułatwienie oceny kandydatów na szczepionki oraz skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.
Zastosowane metody
- Wirus HEV został zneutralizowany przeciwciałami anty-HEV ORF2 lub królika IgG.
- Zneutralizowany wirus został użyty do zakażenia komórek Huh7.
- Barwienie immunofluorescencyjne skierowano przeciwko wirusowemu białku ORF2.
- Liczbę komórek fluorescencyjnie dodatnich określono przy użyciu oprogramowania ImageJ.
- Wartości NT50 obliczono na podstawie redukcji fluorescencji.
Główne wyniki
- Metoda FRNT pozwoliła na pomyślną oszacowanie NT50 dla przeciwciał przeciwko HEV.
- Wartość NT50 dla badanych przeciwciał wyniosła 2,1 x 103.
- Metoda ta ma zastosowanie do surowic od immunizowanych myszy, osób po przechorowaniu HEV oraz przeciwciał wytworzonych w laboratorium.
Wnioski
- Test FRNT stanowi praktyczny i skuteczny sposób pomiaru przeciwciał neutralizujących HEV.
- Metoda ta wspomaga ocenę kandydatów na szczepionki oraz terapii opartych na przeciwciałach przeciwko HEV.
- Rozwiązuje ona ograniczenia testu PRNT w przypadku wirusów niecytopatycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar mian przeciwciał neutralizujących przeciwko wirusowi zapalenia wątroby E (HEV) jest kluczowy dla oceny kandydatów na szczepionki oraz opracowywania przeciwciał terapeutycznych, zwłaszcza ze względu na brak efektu cytopatycznego w standardowych hodowlach komórkowych. Test neutralizacji z redukcją fluorescencji (FRNT) umożliwia rzetelną ocenę skuteczności przeciwciał w sytuacjach, gdy tradycyjne testy płytkowe nie są możliwe do zastosowania, co ma bezpośredni wpływ na wczesne etapy odkryć i procesy badań translacyjnych. Zdolność ta wspiera decyzje dotyczące portfolio poprzez dostarczanie praktycznych danych na temat immunogenności i potencjału neutralizacji interwencji przeciwko HEV.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią kwantyfikację neutralizacji HEV zależnej od przeciwciał w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie funkcjonalnych oddziaływań przeciwciało-wirus.
- Zapewnia pewność prognostyczną w procesie rozwoju kandydatów na szczepionki i przeciwciała.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny test do pomiaru mian neutralizujących w systemach wirusowych niecytopatycznych.
- Umożliwia ilościowe porównanie kandydackich przeciwciał oraz surowic pobranych od osób immunizowanych lub ozdrowieńców.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów przesiewowych i procesów optymalizacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o neutralizacji ze strategiami biomarkerów translacyjnych dla HEV.
- Zapewnia ciągłość przejścia od etapu screeningu przeciwciał w fazie odkrywania do przedklinicznej oceny skuteczności.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów szczepionkowych oraz programów przeciwciał terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda FRNT integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, zapewniając ilościowy i powtarzalny odczyt neutralizacji przeciwciał w przypadku HEV, co stanowi pomost między wczesnym wyborem kandydatów a walidacją translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie zdolności do neutralizacji.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz i powtarzalność w celu oceny wielu próbek przeciwciał lub surowic.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary NT50 w celu porównania potencjału neutralizującego w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy neutralizację in vitro ze strategiami biomarkerów przedklinicznymi dla HEV.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do testów neutralizacji w badaniach nad wirusami niecytopatycznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie przeciwciał przeciwko HEV.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy neutralizacji dla wirusów niecytopatycznych, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywne kosztowo rozwijanie szczepionek i przeciwciał przeciwko HEV.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe dane dotyczące neutralizacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie immunofluorescencji i ilościowej analizy obrazu.
- Konieczny jest dostęp do hodowli komórek Huh7, odczynników do immunobarwienia oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania testu i interpretacji danych.
- Adaptacja do innych wirusów niecytopatycznych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Zależność od dostępności zwalidowanych przeciwciał anty-HEV oraz surowic referencyjnych.
