Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Głównym celem testu neutralizacji opartego na redukcji fluorescencji jest ilościowa ocena potencjału neutralizującego kandydata na szczepionkę i przeciwciał przeciwko HEV. Znany cytopatyczny charakter HEV ogranicza zastosowanie testu PRND. Ten protokół koncentruje się na immunologicznym szkoleniu PRND, aby wizualizować zainfekowane komórki i później je analizować. Na początek, zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7.

Następnie, umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek na dołek w jednym mililitru pełnego DMEM uzupełnionego o 10%FBS. Inkubuj komórki przez noc w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów bezsurowicowego pożywka zawierająca 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do wysiewanych komórek.

Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Użyj 500 mikrolitrów DPBS do przemycia komórek trzy razy. Dodaj dwa mililitry DMEM uzupełnionego o 2%FBS do dołków.

Inkubuj komórki w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Przemyj komórki trzy razy z 500 mikrolitri DPBS, inkubująć przez pięć minut w temperaturze pokojowej między każdym przemywaniem. Dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do komórek i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Następnie przemyj komórki z DPBS, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim przemyciu inkubuj je w DPBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego zawierającego 5% normalnego surowicy koziego, 0,5% albuminy bydlęcej i 0,3% Triton X100 w DPBS.

Inkubuj w szekerze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór blokujący i przemyj raz z 500 mikrolitri DPBS. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego w rozcieńczeniu jedno do pięćset.

Inkubuj komórki przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki z DPBS trzy razy, jak pokazano wcześniej. Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu jedno do tysiąc i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.

Wykonaj cykl mycia i inkubacji, jak pokazano wcześniej. Dodaj 10 mikrolitrów środka przeciwzapalnego z DAPI na szkiełko. Zamontuj pokryw szklany z komórkami skierowanymi w stronę środka, unikając pęcherzyków powietrza.

Zabezpiecz pokryw szklany lakierem do paznokci, aby zachować go do wizualizowania mikroskopii konfokalnej. Zlicz świeżo podzielone komórki HuH-7. Następnie umieść szklany pokryw szklany o jakości mikroskopowej w 12-dołkowej płytce i wysiej 0,2 miliona komórek w jednym mililitru pełnego DMEM na dołek.

Następnego dnia przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenie przeciwciał przeciwko ORF2 i królicze immunoglobuliny G w pożywce bez surowicy, z początkową koncentracją przeciwciał 25 mikrogramów na mililitr, aż do końcowego rozcieńczenia 10 do potęgi minus pięć. Ostateczna objętość rozcieńczenia powinna wynosić 100 mikrolitrów. Następnie dodaj 1,8 razy 10 do potęgi czterech kopii genomu oczyszczonego g1-HEV do każdego rozcieńczenia przeciwciała.

Inkubuj mieszaninę przeciwciał i wirusa w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri DPBS. Dodaj mieszaninę przeciwciał i wirusa do komórek.

Inkubuj w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Przemyj komórki z 500 mikrolitri buforu. Po dodaniu DMEM z 2%FBS, inkubuj przez 72 godziny w 37 stopniach Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Przetwórz komórki na immunofluorescencyjne barwienie, jak pokazano wcześniej. Po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych otwórz oprogramowanie ImageJ. Wybierz Plik i otwórz obraz.

Następnie wybierz Obraz, Typ i kliknij 8-bit, aby przekonwertować obraz RGB do formatu 8-bitowego. Dostosuj próg, wybierając Obraz i wybierając Dostosuj, a następnie Próg, ustawiając poziom dolny na 40, a górny na 255. Wybierz Analizuj, wybierz Analizuj Cząstki i włącz Wyświetl wyniki, Wyczyść wyniki, Podsumuj, Wyklucz na krawędziach i Kompozytowe regiony zainteresowania.

Następnie kliknij OK, aby uzyskać liczbę plamek fluorescencyjnych. Oblicz procentowe neutralizację i NT50 jako antylog Log10 NT50, używając podanego wzoru. Narysuj wykres przedstawiający średnią i odchylenie standardowe wszystkich pól.

Znaczący poziom kwasu rybonukleinowego g1-HEV został wykryty w zainfekowanych komórkach w porównaniu z niezainfekowanymi komórkami kontrolnymi. Test immunofluorescencyjny z użyciem przeciwciała przeciwko ORF2 potwierdził ekspresję ORF2 w zainfekowanych komórkach HuH-7. 50% tytuł neutralizacji przeciwciała przeciwko ORF2 szacowano na 2,1 razy 10 do potęgi trzy.

Przedstawione obrazy pokazują wygląd niezainfekowanych i