Name: Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Naucz się izolować i hodować pierwotne komórki brzegowe prążkowania naczyniowego z ucha wewnętrznego noworodkowych myszy. Ta metoda pozwala badać dysfunkcję stria vascularis i mechanizmy utraty słuchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność Katedrze Otolaryngologii – Chirurgii Głowy i Szyi, Szpitalu Renmin Uniwersytetu w Wuhan (Wuhan, Chiny) oraz Instytutowi Badawczemu Otolaryngologii – Chirurgii Głowy i szyi, Szpitalowi Renmin Uniwersytetu w Wuhan (Wuhan, Chiny) za ich hojne wsparcie i wsparcie. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Budowy i Inkubacji Centrum Służby Zdrowia Chin (ZX0000000037), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81700916, 82301294), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Hubei (2017CFB242) oraz Projekt Badawczy Komisji Zdrowia prowincji Hubei (WJ2017Q005).

Noworodkowe młode myszy (P0-3) zostały dostarczone przez Biont. Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użycia zwierząt laboratoryjnych opublikowanymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia Stanów Zjednoczonych (publikacja NIH, zaktualizowana w 2011 roku) i zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala Renmin na Uniwersytecie w Wuhan (WDRM202400019).
1. Sterylizacja i przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzia do sekcji, w tym dwie pary kleszczy do mikro-sekcji, jedną parę standardowych kleszczy, jedną parę nożyczek chirurgicznych i jedną parę nożyczek do mikro-sekcji. Wysterylizuj wszystkie narzędzia autoklawem i susz je w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml medium zwierzęcego z komórek nabłonkowych (EpiCM-a) zgodnie z zaleceniami producenta. Dodaj surowicę bydła płodu (FBS), suplement wzrostu komórek nabłonkowych (EpiCGS-a) oraz roztwór penicyliny/streptomycyny do ośrodka podstawowego, aby uzyskać końcowe stężenia 2% FBS, 1% EpiCGS-a oraz 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Dezynfekuj stój stereomikroskopu i obudowę 75% etanolem. Następnie umieść narzędzia do autoklawowej sekcji i zdezynfekowany mikroskop w szafce bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie przedmioty wystaw na działanie światła UV przez 30 minut, aby zapewnić pełną sterylność przed rozpoczęciem procesu sekcji.</li>
</ol>
2. Sekcja i izolacja skroniowa w celu pobierania nabłonka słuchowego
<ol>
	<li>Zgodnie z "Wytycznymi dotyczącymi eutanazji zwierząt laboratoryjnych GB/T 39760-2021" znieczulanie młodych myszy (p0–3) podaje 4% izofluranu, a następnie używa hemostatu, aby uszczypnąć tylny palec u nogi. Po obserwacji zniknięcia odruchu szczypania palców, aby potwierdzić, że mysz znajduje się w stanie głębokiego znieczulenia, należy dokonać eutanazji. Następnie zdezynfekuj 75% etanolem i przelej do szafki do zabezpieczenia biologicznego. W razie potrzeby stosuj inne etycznie zatwierdzone metody.</li>
	<li>Unieruchom głowę, otwórz skórę głowy wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek do mikrosekcji, oddziel skórę głowy po obu stronach i wyciąć ją.</li>
	<li>Przetnij głowę noworodka na pół wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek do mikrosekcji. Usuń tkankę mózgową kleszczami, aby odsłonić kości skroniowe (Rysunek 1A).</li>
	<li>Obserwuj obustronne kości skroniowe u podstawy czaszki, usuń inne niepotrzebne kości i zachowaj tkankę skroniową zawierającą ślimak (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przenieś jedną kość skroniową do sterylnej misy o średnicy 35 mm zawierającej świeży roztwór Hank's Balanced Salt (HBSS) na lodzie.</li>
	<li>Przenieś drugą kość skroniową pod mikroskop, zabezpiecz tkankę skroniową jedną parą kleszczy, a drugą parą wykonaj tępe rozwarstwienie tkanki mięśniowej, aż pojawi się biały półkolisty pierścień kosteczkowy (rysunek 1C). Po potwierdzeniu położenia ślimaka kontynuuj tępe rozwarstwienie w dół, aż zaobserwuje się przezroczystą tkankę ślimakową (Rysunek 1D). UWAGA: Kroki 2.6-2.7 należy wykonywać na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy mikro-disekcjonujących ostrożnie usuń mały fragment ściany kości na wierzchołku ślimaka, delikatnie włóż jedną stronę kleszczy do ślimaka i oddziel ścianę kości od labiryntu błoniastego. Usuń ścianę kostną i przedłuż błoniastą tkankę labiryntu w świeżym roztworze Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Rysunek 1E).</li>
	<li>Zabezpiecz błonę podstawną jedną parą szczypiec i ostrożnie rozdziel prążek naczyniowy inną parą kleszczy. Przelej go do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 ml roztworu kolagenazy typu II o pojemności 1mg/mL, umieszczonej na lodzie (Rysunek 1F).</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki, aby pobrać prążkowanie naczyniowe z drugiej strony.</li>
</ol>
3. Rozdzielanie enzymatyczne w celu uzyskania komórek marginalnych wstrążkowego prążkowania naczyniowego
<ol>
	<li>Inkubuj mikrowirówkę zawierającą pobraną tkankę w roztworze kolagenazy typu II o stężeniu 1mg/mL w temperaturze 37 °C przez 30 minut. UWAGA: Roztwór kolagenazy typu II został przygotowany przez rozcieńczenie kolagenazy typu II w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4).</li>
	<li>Wiruj probówkę na 300 × g przez 8 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usuń supernatant. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej, aby zakończyć trawienie, delikatnie tryturuj, aby ponownie zawiesić komórki, i ponownie wiruj w 300 × g przez 8 minut.</li>
	<li>Aspiruj supernatant i dodaj 1 ml świeżego medium hodowlanego. Tryturuj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, przenieś zawieszenie do stożkowej rurki o pojemności 15 mL i dodać dodatkowe medium, aby dostosować całkowitą objętość do 10 mL.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową poprzez powtarzane pipetowanie, a następnie przelej 1 mL zawiesiny do każdej studni na 6-dołowej płycie. Hodować komórki w 2 mL DMEM z dodatkiem 2% FBS, 1% EpiCGS-a oraz 1% roztworu penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .</li>
	<li>Wymieniaj medium codziennie i monitoruj stan komórek. Skupiskowy wzrost komórek marginalnych można zazwyczaj zaobserwować 2 dni po nałożeniu na płyty.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie komórek marginalnych
<ol>
	<li>Trzeciego dnia hodowli obserwuj pojawienie się licznych wrzecionowatych fibroblastów otaczających brukowate skupiska komórek marginalnych (rysunek 2B).</li>
	<li>Wykorzystując różnice w szybkości adhezji, delikatnie pipetuj, aby częściowo usunąć wrzecionowate fibroblasty. Używając pipety o pojemności 1 mL, delikatnie przepłucz zrównoważony roztwór soli D-Hanks na dużych obszarach w każdym z czterech kwadrantów. Monitoruj oczyszczanie komórek pod mikroskopem i odpowiednio dostosuj siłę oraz kierunek pipetowania. Zazwyczaj płukanie na dużych obszarach wykonuje się dwukrotnie. Po każdej rundzie zbadaj gęstość fibroblastów mikroskopowo; Na podstawie tych obserwacji należy stosować lokalne, delikatne pipetowanie na gęsto zaludnionych obszarach fibroblastów, aby uzyskać rzadki i równomierny rozmieszczenie w naczyniu hodowlowym. UWAGA: Zachowano odpowiednią gęstość fibroblastów, ponieważ całkowite usunięcie lub nadmierne oczyszczenie może ograniczać wzrost komórek pierwotnych. Zalecamy utrzymanie stosunku komórek marginalnych do fibroblastów w przybliżeniu 2:1.</li>
	<li>Przerwij oczyszczanie, gdy fibroblasty pod mikroskopem wydają się rzadko rozmieszczone wśród brzegowych klastrów komórek. Usuń supernatant i dodaj 2 mL świeżego podłoża hodowlanego, aby kontynuować uprawę.</li>
</ol>
5. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Drugiego dnia po oczyszczeniu obejrzyj morfologię komórek pod mikroskopem. Przy obserwowaniu odpowiedniej formacji skupisk komórek i odpowiedniej gęstości, aspiruj pożywkę hodowlową i trzykrotnie płucz komórki soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Utrwalaj komórki 4% paradehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu roztworu utrwalającego płucz komórki trzy razy PBS (5 minut na każde płukanie).</li>
	<li>Przepuszczaj komórki 0,5% Triton X-100 przez 15 minut. Usuń roztwór i przepłucz komórki trzy razy PBS (5 minut na każde płukanie).</li>
	<li>Blokuj komórki PBS zawierające 10% surowicy koziej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubuj komórki przeciwmysimi przeciwciałami CK18 monoklonalnymi dla królików (rozcieńczone 1:300 w PBS zawierające 3% surowicy koziej) lub przeciwciałem KCNQ1 (G-8) (rozcieńczone 1:100 w PBS zawierającym 3% surowicy koziej) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Płucz komórki trzy razy PBS (10 minut na każde pranie). Inkubuj odpowiadającym przeciwciałem wtórnym (rozcieńczonym 1:300 w PBS zawierającym 3% surowicy koziej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń przeciwciała wtórne i przemyj komórki trzy razy PBS (10 minut na każde mycie).</li>
	<li>Nałóż 1-2 krople medium antyfade zawierającego DAPI na preparaty, zamontuj pokrywki i zbadaj próbki za pomocą konfokalnego systemu laserowego skanowania. UWAGA: Z wyjątkiem etapów płukania, wszystkie roztwory inkubacyjne, w tym przeciwciała, dodawano w objętościach wystarczających, by całkowicie pokryć komórki.</li>
</ol>
6. ZabiegH2O2 i barwienie ROS
<ol>
	<li>Po 7 dniach hodowli, gdy komórki marginalne utworzą zbieg monowarstwy, indukuj stres oksydacyjny poprzez obróbkę 1 mM H2O2. Przygotuj roztwór roboczy o mocy 1 mM, rozcieńczając roztwór zapasowy 30% H2O2 w stosunku 1:10000 w ośrodku komórek nabłonkowych. Inkubuj grupy eksperymentalne tym roztworem roboczym, lecząc grupy kontrolne wyłącznie ośrodkiem komórkowym nabłonka.</li>
	<li>Po 16 godzinach leczenia ostrożnie usuń podłoże i przemyj komórki PBS. Oceń poziom ROS wewnątrzkomórkowy w komórkach marginalnych za pomocą zestawu do badania gatunków reaktywnego tlenu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Usuń podłoże hodowlane, następnie dodaj rozcieńczony MitoTracker Red CMXRos (barwnik selektywny na mitochondria) oraz DCFH-DA do komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki trzy razy PBS (po 5 minut każda), zamontuj pokrywki i obserwuj próbki za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego skanującego.</li>
</ol>
7. Leczenie D-galaktozą i barwienie SA-β-gal
<ol>
	<li>Po 7 dniach hodowli, gdy komórki marginalne tworzą zbieg monowarstwy, proszek D-galaktozy rozpuszczano w podłożu EpiCM-a, aby przygotować roztwór roboczy D-galon o stężeniu 40 mg/mL. Inkubować grupy eksperymentalne tym roztworem (2 mL na dołek na płytkę 6-dołkową, 48 h, w temperaturze 37 °C), aby wywołać starzenie komórkowe, lecząc grupy kontrolne o tej samej objętości medium Epi.</li>
	<li>Po 48 godzinach zabiegu ostrożnie usuń podłoże i przemyj komórki PBS. Oceń starzenie komórkowe w komórkach marginalnych za pomocą zestawu do barwienia SA-β-galon zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Utrwalaj komórki roztworem utrwalającym przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu utrwalacza przemyj komórki trzy razy PBS (5 minut na każde pranie).</li>
	<li>Inkubuj komórki roztworem roboczym o pojemności SA-β-galon zawierającym 5% X-Gal (1 mL na dołek na płytkę 6-dołkową) przez noc w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze bezCO2.</li>
	<li>Uchwyć zdjęcia barwienia SA-β-gal pod jasnym polem oświetlenia za pomocą mikroskopu.</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Aby porównać grupy leczone H₂O₂ a kontrolną pod względem średniej intensywności immunofluorescencji barwienia ROS oraz między grupami leczonymi D-galaktozą a kontrolnymi pod względem udziału komórek dodatnich z powodu SA-β-gal, należy stosować testy t po ocenie prawidłowości i log-normalności.</li>
</ol>

<ol><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li>
<li>Bovee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stria+vascularis%3A+Renewed+attention+on+a+key+player+in+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss.</a> Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).</li>
<li>Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+wall+Na%2CK-ATPase+and+endocochlear+potentials+decline+with+age+in+quiet-reared+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils.</a> Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).</li>
<li>Hibino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+highly+positive+endocochlear+potential+formed%3F+The+specific+architecture+of+the+stria+vascularis+and+the+roles+of+the+ion-transport+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).</li>
<li>Johns, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+stria+vascularis+in+neglected+otologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The role of the stria vascularis in neglected otologic disease.</a> Hear Res. 428, 108682(2023).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+stria+vascularis+in+the+pathogenesis+of+sensorineural+hearing+loss%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review.</a> Front Neurosci. 15, 774585(2021).</li>
<li>Ohlemiller, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+age-related+endocochlear+potential+reduction+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model.</a> Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).</li>
<li>Mahendrasingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+time+course+of+degeneration+of+different+cochlear+structures+in+the+CD%2F1+mouse+model+of+accelerated+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).</li>
<li>Lee, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+marginal+cells+in+mouse+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).</li>
<li>Ohlemiller, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocochlear+potential+as+an+indicator+of+reticular+lamina+integrity+after+noise+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice.</a> Hear Res. 361, 138-151 (2018).</li>
<li>Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+synaptopathy+in+acquired+sensorineural+hearing+loss%3A+Manifestations+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms.</a> Hear Res. 349, 138-147 (2017).</li>
<li>Levano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+neonatal+cochlear+explants+as+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model.</a> J Vis Exp. (197), e65160(2023).</li>
<li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+cochlear+hair+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. (199), e65687(2023).</li>
<li>Schmiedt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window%3A+A+model+of+metabolic+presbyacusis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis.</a> J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).</li>
<li>Kurata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+evaluation+of+vascular+findings+in+the+cochlea+in+patients+with+presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis.</a> JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).</li>
<li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Med. 2, 30(2004).</li>
<li>Ding, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-106a+facilitates+the+sensorineural+hearing+loss+induced+by+oxidative+stress+by+targeting+connexin-43%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43.</a> Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+inhibition+prevents+oxidative+stress+in+age-related+hearing+loss+via+PAR-Ca%282%2B%29-AIF+axis+in+cochlear+strial+marginal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells.</a> Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+1+expression+attenuates+glucose+oxidase-induced+damage+in+rat+cochlear+marginal+strial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells.</a> Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).</li>
<li>Fetoni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+presbycusis+in+animal+models%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review.</a> Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).</li>
<li>Marie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-accelerated+mouse+prone+8+%28SAMP8%29+as+a+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss.</a> Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+sensorineural+hearing+loss+research%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review.</a> Life Sci. 358, 123156(2024).</li>
<li>Bommakanti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+histopathology+in+human+genetic+hearing+loss%3A+State+of+the+science+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects.</a> Hear Res. 382, 107785(2019).</li>
<li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+hereditary+hearing+loss%3A+Pathology+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear.</a> Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+challenges+of+CRISPR-Cas+gene-editing+to+disease+treatment+in+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Precis+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics.</a> Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+methods+and+research+progress+of+livestock+and+poultry+immortalized+cell+lines%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review.</a> Front Vet Sci. 9, 956357(2022).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że badania nie mają żadnych konfliktów interesów komercyjnych ani finansowych.

Przez dziesięciolecia badania nad ubytkiem słuchu koncentrowały się głównie na roli komórek włoskowych sensorycznych i ich połączeń synaptycznych z neuronami zwojowymi spiralnymi11. Liczne opublikowane badania poświęcono tworzeniu i optymalizacji modeli hodowli in vitro komórek włoskowatych, które odegrały niezbędną rolę w badaniu ubrań komórek włoskowatych, regeneracji oraz skutków leków ototoksycznych12,13. Jednak rosnąca liczba...

W układzie słuchowym różne tkanki w ślimaku współdziałają, aby przekształcić złożone fale dźwiękowe w sygnały elektryczne1. Prążek naczyniowy reguluje skład jonowy endolimfy i generuje potencjał endoślimakowy (EP), utrzymując tym samym homeostazę ślimakową i zapewniając prawidłowe funkcjonowanie komórek włoskowych wewnętrznych i zewnętrznych. Składa się z trzech odrębnych typów komórek: komórek marginalnych, komórek pośrednich oraz komórek podstawnych. Komórki marginalne tworzą spolaryzowaną monowarstwę nabłonkową, która bezpośrednio zwrócona jest do endolimfy i jest uszczelniona przez ciasne połączenia. Błona bazolateralna komórek marginalnych jest wzbogacona o dwa kluczowe transportery potasu: Na⁺/K⁺-ATPazę i NKCC1, które odpowiadają za regulację transportu jonów sodu i potasu w mięśniu naczyniowym. Wykazano, że funkcja Na⁺/K⁺-ATPazy jest bezpośrednio powiązana z EP 2,3. Kanały K⁺ KCNQ1/KCNE1 znajdują się na błonie wierzchołkowej komórek marginalnych i generują dodatkowy potencjał dyfuzji K⁺, który przyczynia się do powstawania EP4. Komórki marginalne są wzbogacone w wiele białek związanych z potasem i pełnią rolę głównej jednostki komórkowej napędzającej recykling potasu w endolimfie ślimakowej. Dlatego komórki marginalne są kluczowymi komórkami odpowiedzialnymi za wytwarzanie i utrzymanie EP.
Wykazano, że prążkowo-naczyniowe (SV) odgrywają kluczową rolę w patogenezie wielu zaburzeń związanych z ubytkiem słuchu czuciowo-nerwowym (SNHL), w tym utraty słuchu powiązanej z wiekiem (ARHL), utraty słuchu wywołanej hałasem (NIHL), dziedzicznego (HHL) oraz lekowego utraty słuchu (DIHL). Ponadto kilka innych zaburzeń słuchu, takich jak autoimmunologiczna choroba ucha wewnętrznego (AIED), autozapalna choroba ucha wewnętrznego (AID) oraz choroba Ménière'a (MD), choć etiologicznie odrębne, również wykazano w ostatnich badaniach zaangażowanie SV w ich podstawowe mechanizmy patogenne 5,6. Dlatego kluczowe jest opracowanie wiarygodnych modeli komórkowych do badania patogenezy utraty słuchu. Badania wykazały, że zmniejszona gęstość komórek marginalnych jest silnym predyktorem EP przez cały okres życia myszy, podczas gdy zanik prążkowania naczyniowego stanowi wczesną charakterystyczną zmianę w ARHL 7,8. Hodowla in vitro komórek marginalnych może stanowić wiarygodny model do badania patogenezy ARHL oraz eksploracji potencjalnych celów terapeutycznych. Poza ARHL najnowsze badania wykazały wysoką korelację i możliwy związek między rozpryskiem naczyniowym a innymi zaburzeniami słuchu, sugerując, że modele komórek marginalnych in vitro mogą mieć szersze zastosowania 5,9,10.
Badanie opisuje protokół do sekcji i hodowli prążkowego naczynia naczyniowego u noworodków myszy, a następnie oczyszczenie komórek marginalnych za pomocą różnicowego płytkowa, co stanowi wiarygodny model komórkowy do badań nad patologiami związanymi z dziążkowym naczyniowym (stria vasculariis).

<table><tbody><tr><td>Rurka wirówki 15 mL</td><td>Servicebio</td><td>EP-1501-J</td><td>Zastosowanie do kultury</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórek 35 mm</td><td>NEST</td><td>706001</td><td>Zastosowanie do sekcji</td></tr><tr><td>4% paradehydu</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Płyta 6-dołkowa</td><td>Servicebio</td><td>CCP-6H</td><td>Zastosowanie do kultury</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Sprzężone przeciwciało przeciw królikom</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-2</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Medium montażowe antyfade z DAPI</td><td>Absin</td><td>ABS9235</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Beyotime</td><td>C0037</td><td>Wykorzystanie do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Biosharp</td><td>BS164</td><td>Zastosowanie do kultury</td></tr><tr><td>Konfokalny System Laserowego Skanowania</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV1200</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>DCFH-DA</td><td>Invitrogen</td><td>C2938</td><td>Barwienie ROS</td></tr><tr><td>D-gal</td><td>Solarbio</td><td>D8310</td><td>Wykorzystanie do modelowania komórek</td></tr><tr><td>EpiCM-a Medium</td><td>Sciencell</td><td>4131</td><td>Zastosowanie do kultury</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Napęd na tylne koła</td><td>F11020-11</td><td>Zastosowanie do sekcji</td></tr><tr><td>Serum koziego</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Mkbio</td><td>MM0707</td><td>Wykorzystanie do modelowania komórek</td></tr><tr><td>Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS)</td><td>Biosharp</td><td>BL561A</td><td>Zastosowanie do kultury</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Napęd na tylne koła</td><td>R510-22-10</td><td>Zastosowanie do sekcji</td></tr><tr><td>Przeciwciało KCNQ1 (G-8)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-365186</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX7-1063</td><td>Zastosowanie do sekcji</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td>Wykorzystywany do obserwacji wyników barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td>Barwienie ROS</td></tr><tr><td>Noworodkowe szczenięta myszy (P0-P3)</td><td></td><td></td><td>dostarczone przez BIONT</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciwko myszom dla królików CK18</td><td>Proteintech</td><td>10830-1-AP</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Starzenie i beta; - Zestaw do barwienia galaktozydazą</td><td>Beyotime</td><td>C0602</td><td>Barwienie starzenia</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>barwienie immunofluorescencyjne</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Isolation and Culture of Primary Marginal Cells of the Stria Vascularis from Neonatal Mice

Prążkowo-naczyniowe to kluczowa struktura w uchu wewnętrznym odpowiedzialna za generowanie i utrzymanie potencjału endokołlearnego (EP), a jej dysfunkcja jest ściśle związana z różnymi formami utraty słuchu. Prążkowate naczyniowe składa się z komórek marginalnych, pośrednich i bazalnych, z których komórki marginalne odgrywają kluczową rolę w powstawaniu i utrzymaniu EP. Dlatego ustanowienie modelu hodowli pierwotnej in vitro komórek marginalnych jest niezbędne do badania cech biologicznych prążkowania naczyniowego i jego udziału w zaburzeniach związanych z utratą słuchu.
W tym badaniu z powodzeniem wyizolowaliśmy i hodowaliśmy pierwotne komórki marginalne z prążkowych naczyń noworodkowych myszy. Tkanki przedsionkowe pozyskano przez mikrosekcję, trawione kolagenazą typu II i oczyszczane przez różnicowanie płytek w celu usunięcia większości fibroblastów, przy czym hodowlane komórki osiągały ponad 80% zbiegu do 7 dnia. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało stabilną ekspresję cytokeratyny 18 (CK18) oraz potasu podrodziny kanałów Q członek 1 (KCNQ1), potwierdzając skuteczną izolację, wysoką czystość i zachowaną funkcję fizjologiczną komórek marginalnych.
Na podstawie tego modelu opracowano modele stresu oksydacyjnego in vitro oraz starzenia komórkowego, wykorzystując odpowiednio nadtlenek wodoru (H2, O2) i D-galaktozę. Komórki leczone wykazywały istotnie zwiększony poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) oraz pozytywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związanej ze starzeniem, co wskazuje na wysoką wrażliwość pierwotnych komórek marginalnych na stres oksydacyjny i bodźce wywołujące starzenie się. Łącznie to badanie ustanawia stabilny i powtarzalny system hodowli i modelowania pierwotnych komórek marginalnych myszy, zapewniając wiarygodną platformę in vitro do badania dysfunkcji pręży naczyniowej oraz powiązanych mechanizmów.

Wzrost i cechy morfologiczne komórek hodowanych Dzięki temu protokołowi udało nam się ustanowić pierwotne hodowle komórek marginalnych wyizolowanych z ślimaka myszy. Drugiego dnia hodowli mikroskopia świetlna wykazała, że komórki przyklejały się do podłoża i zaczęły tworzyć skupiska kolonii (Rysunek 2Aa). Trzeciego dnia oczyściliśmy komórki (rysunek 2B). Kolejne obserwacje w kolejnych dniach wykazały, że pierwotne komórki marginalne ulegały...

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

The stria vascularis is a key structure in the inner ear responsible for generating and maintaining the endocochlear potential (EP), and its dysfunction ...

Stworzyliśmy pierwotny model komórek marginalnych do badania dysfunkcji prążkowego naczynia w utracie słuchu. Protokół ten może być stosowany do badania dysfunkcji prążkowego naczynia naczyniowego w przypadku utraty słuchu związanej z wiekiem, hałasu i dziedzicznej. Na początek przygotuj narzędzia do sekcji, w tym dwie pary kleszczy do mikro-sekcji, po jednej parze standardowych kleszczy, nożyczki chirurgiczne oraz nożyczki do mikro-sekcji.Wysterylizuj wszystkie narzędzia autoklawem i susz je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie umieść sterylizowane narzędzia w zlewce alkoholowej umieszczonej w szafce bezpieczeństwa biologicznego. Używając 75% etanolu, dokładnie zdezynfekuj podium i obudowę mikroskopu stereo. Umieść zdezynfekowany stereomikroskop w szafce bezpieczeństwa biologicznego i wystaw wszystkie przedmioty na promieniowanie ultrafioletowe przez 30 minut, aby zapewnić pełną sterylność przed rozpoczęciem procesu sekcji.Ostrożnie zdezynfekuj uśpionego szczeniaka myszy za pomocą 75% etanolu. Umieść zdezynfekowanego szczeniaka na sześciocentymetrowej misce wewnątrz szafki bioasekuracyjnej do sekcji na sekcję. Unieruchom główkę mocno prostymi kleszczami.Używając nożyczek do mikrosekcji, otwórz skórę głowy wzdłuż szwu strzałkowego i oddziel ją obstronnie nożyczkami, aby całkowicie ją wyciąć. Następnie, używając nożyczek do mikro-sekcji, przeciąż głowę noworodka myszy wzdłuż linii środkowej. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń tkankę mózgową, aby odsłonić kości skroniowe.Obserwuj obustronne kości skroniowe u podstawy czaszki i usuń niepotrzebne otaczające je kości, zachowując przy zachowaniu tkanki skroniowej zawierającej ślimak. Przełóż jedną kość skroniową do 35-milimetrowej sterylnej misy zawierającej świeży roztwór Hanks'Balanced Salt Solution, umieszczoną na lodzie. Przenieś drugą kość skroniową do sterylnej miseczki umieszczonej pod stereomikroskopem na lodzie.Jedną parą kleszczy mocno zabezpiecz tkankę skroniową kości. Używając innej pary kleszczy, wykonaj tępe rozwarstwienie, aby usunąć tkankę mięśniową powierzchniową, aż pojawi się biały półkolisty pierścień kostkowy. Potwierdź pozycję ślimaka wzrokowo i kontynuuj tępe rozwarstwienie w dół, aż zauważymy przezroczystą tkankę ślimakową.Za pomocą kleszczy mikrosekcjonujących ostrożnie usuń mały kawałek ściany kości ślimaka, utrzymując tkankę na lodzie. Delikatnie włóż jedną stronę kleszczy do ślimaka i ostrożnie oddziel ścianę kości od błoniastego labiryntu. Usuń odłączoną ścianę kostną i przedłuż błoniastą tkankę labiryntu do świeżego roztworu Hanks's Balanced Salt.Jedną parą kleszczy zabezpiecz błonę podstawową, a następnie ostrożnie rozdziel prążek naczyniowy inną parą kleszczy. Powtórz procedurę pobierania po stronie przeciwległej. Przenieś izolowane prążkowanie naczyniowe do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej jeden mililitr roztworu kolagenazy typu II umieszczonej na lodzie.Umieść próbkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie, używając wirówki, kręć rurką z 300G przez osiem minut. Ostrożnie usuń supernatant z probówki i dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do pelletu.Delikatnie dawkuj, aby zakończyć trawienie, i ponownie wiruj probówkę w 300G przez osiem minut. Następnie aspiruj i odrzucaj nadmiar. Dodaj do pelletu jeden mililitr świeżego medium hodowlanego.Delikatnie trytrować, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przełóż zawieszenie do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i dodaj dodatkowe medium hodowlane, aby dostosować całkowitą objętość do czterech mililitrów. Dokładnie wymieszaj zawiesinę ogniwową poprzez powtarzane pipetowanie.Przelej jeden mililitr zawiesiny do każdego dołka z płytką sześciodołkową i dodaj DMEM uzupełniony o 2% FBS, 1% EpiCGS-a i 1% streptomycyny penicyliny. Włóż płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla, aby hodować komórki. Wymieniaj medium codziennie.Aby zastąpić nośnik, zasysaj stare medium z dołka za pomocą pipety. Dodaj świeży roztwór soli Hanks'Balanced do prania, a następnie wdechuj. Dodaj świeże podłoże hodowlane.Regularnie monitoruj stan komórek pod mikroskopem. Obserwuj skupiskowy wzrost komórek marginalnych około dwóch dni po nałożeniu na deskerze. Trzeciego dnia zidentyfikuj liczne wrzecionowate fibroblasty otaczające brukowate skupiska komórek marginalnych.Używając pipety o średnicy jednego mililitra, delikatnie pipetuj, aby częściowo usunąć wrzecionowate fibroblasty w zależności od ich różnych szybkości adhezji. Delikatnie przepłucz zrównoważony roztwór soli D-Hanks'a na dużych obszarach w każdym z czterech ćwiartków naczynia hodowlanego trzy razy, aby uzyskać równomierne rozmieszczenie fibroblastów w całej misce. Po każdej rundzie mikroskopowo zbadaj gęstość fibroblastów i zastosuj lokalne, delikatne pipetowanie na gęsto zaludnionych obszarach fibroblastów, aby uzyskać rzadki i równomierny rozkład w całej misce hodowlanej.Używając pipety, usuń zużyty materiał i dodaj dwa mililitry świeżego medium hodowlanego, aby kontynuować uprawę. Wykonaj obrazowanie po immunobarwieniu komórek marginalnych przeciwciałami przeciwciałami anty-CK18 18 i KCNQ1 oraz lecz komórki marginalne D-galaktozą w celu wywołania starzenia komórkowego. Drugiego dnia po oczyszczeniu komórek barwienie immunofluorescencyjne wykazało ekspresję CK18 i KCNQ1 w hodowanych komórkach.Półmaksymalne stężenie hamujące nadtlenku wodoru zostało określone na podstawie krzywej odpowiedzi dawkowej po ocenie żywotności komórek przy różnych stężeniach nadtlenku wodoru za pomocą testu CCK-8. W porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną, leczenie nadtlenkiem wodoru o jednym milimolarnym stopniu znacznie zwiększyło wewnątrzkomórkową zieloną fluorescencję, co wskazuje na zwiększone nagromadzenie reaktywnych form tlenu. Komórki marginalne leczone degalaktozą wykazały istotny wzrost barwienia związanego ze starzeniem się beta-galaktozydazy, co wskazuje na starzenie komórkowe w porównaniu z nieleczonymi grupami kontrolnymi.Kluczowym wyzwaniem podczas realizacji tego protokołu jest zapobieganie uszkodzeniom komórek podczas sekcji oraz optymalizacja oczyszczania, wyczucia czasu i proporcji. Naukowcy mogą wykonywać detekcję ROS, barwienie starzenia, elektrofizjologię, a także analizę Western blot i qPCR, wykorzystując tę technikę. Przyszłe badania mogą badać systemy kokultur dotyczące czynnika wzrostu, optymalizacji i uwiecznienia komórek marginalnych.

isolation-culture-primary-marginal-cells-stria-vascularis-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Naucz się izolować i hodować pierwotne komórki brzegowe prążkowania naczyniowego z ucha wewnętrznego noworodkowych myszy. Ta metoda pozwala badać dysfunkcję stria vascularis i mechanizmy utraty słuchu.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Przeglądaj więcej filmów