Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila
27 lutego 2026
Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.
Nasze badania analizują rozwojowe funkcje nienono-zakończenia białek złączeń przegrodowych, koncentrując się na identyfikacji i charakteryzacji nowych składników zaangażowanych w strukturę i biologiczne role. Protokół ten ma na celu scharakteryzowanie organizacji i funkcji zasłony skrzyżowania przegrody plisowanej w naepitelu ektodermalnym zarodków Drosophila. Na początek skrzyżuj zdrowe samce i samice Drosophila o odpowiednich genotypach i umieszczaj je w klatkach na zbieranie zarodków z świeżymi talerzami soku jabłkowego posmarowanymi pastą drożdżową.
Pozwól dorosłym osobnikom składać zapłodnione jaja na talerze z sokiem jabłkowym. Usuń płytkę z klatki do zbierania jaj i dojrzewaj zarodki przez 13 do 16 godzin po składaniu jaj w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby osiągnąć etap 16. Następnie utrwala zarodki stadium 16 w odpowiednim roztworze utrwalającym i przeprowadzała immunobarwienie z pożądanymi przeciwciałami.
Dla najlepszych rezultatów zrób obrazowanie zarodków na mikroskopie konfokalnym z obiektywem do zanurzenia olejem 40x. Po skupieniu się na interesującym zarodku ustaw intensywność i wzmocnienie lasera, aby uzyskać silny sygnał fluorescencjonalny bez nadmiernego nasycenia pikseli. Zidentyfikuj zarodki stadium 16, które nie wyrażają zielonego fluorescencyjnego białka zakodowanego przez balanser, wykorzystując morfologię śródjelita.
Skup skan na gruczole ślinowym lub jelicie przednim, a skan Z ustaw tak, aby uwzględnił jak największą średnicę lumenu, aby zobaczyć pełną błonę boczną komórki nabłonkowej. Ustaw odpowiednią średnią liniową i zrób obrazowanie spolaryzowanej tkanki w co najmniej 20 zarodkach kontrolnych i 20 zarodkach Cora 4 mutant stadium 16. Rejestruj dane tylko z embrionów, w których marker połączenia przylegającego jest ściśle zlokalizowany w obszarze apikalno-bocznym błony.
W zarodkach typu dzikiego w stadium 16 ocenić wzbogacenie białek styku przegrody plisowanej wzdłuż obszaru wierzchołkowego błony bocznej w pobliżu styku adherensa. Zapisz trwałe rozmieszczenie markera złącza przegrody fałdowanej wzdłuż błony bocznej u mutanta. Przygotuj świeży roztwór barwnika, rozpuszczając rhodaminą oznakowany 10 kilodalton dekstranu do 1 miligramu na mililitr w 0,5-molowym fosforanie sodu o pH 7,5, z 5-milimolowym chlorkiem potasu.
Za pomocą wyciągacza igieł wciągnij rurkę kapilarną o średnicy zewnętrznej 1 milimetra i średnicy 0,5 milimetra z włóknem do szklanej igły. Następnie załaduj szklaną igłę do uchwytu na igły mikromanipulatora i ustawiaj mikromanipulator obok odwróconego mikroskopu. Ustaw igłę jak najbliżej równoległości do szkiełka mikroskopu i obniż ją do tej samej płaszczyzny Z, co bok szkiełka.
Złam końcówkę igły, uderzając nią o bok szkiełka mikroskopu. Podnieś igłę powyżej poziomu suwaka i wyjmij ją do załadunku. Następnie napełnij rurkę naczyniowatą barwnikiem, używając najmniejszej dostępnej końcówki pipety.
Ponownie załaduj napełnioną igłę do uchwytu na igły. Zbadaj przepływ 10-kilodaltonowego dektranu, wstrzykując niewielką ilość do kropli oleju halowęglowego na powierzchni szkiełka mikroskopowego. Używając pokrywy o grubości 22 x 22 milimetrów, utworz wgłębioną linię na talerzu soku jabłkowego.
Ułóż około 25 zarodków kontrolnych i Cora 4 mutant na etapie 16 lub 17 na tacy soku jabłkowego. Upewnij się, że ich tylne końce są wyrównane wzdłuż linii, a powierzchnie brzuszne skierowane do góry. Następnie naklej kawałek taśmy dwustronnej na pokrywkę 22 x 22 milimetry numer 2.
Dotknij taśmą linii zarodka i lekko pocieraj okładkę, aby przenieść zarodki z płytki na dwustronną taśmę. Następnie dodaj kroplę oleju z halowęglowym do szkiełka mikroskopowego i przymocuj pokrywę do preparatu, pozwalając kapilarnemu działaniu utworzyć wiązanie. Ustaw pokrywę bliżej boku zamka, naprzeciwko zmatnionej części.
Wysusz zarodki na trzy do pięciu minut w pojemniku z suszaczem i całkowicie przykryj je olejem halowęglowodorowym. Zamontuj szkiełko z zarodkami na odwróconym mikroskopie tak, że zarodki są skierowane do góry i od obiektu. Ustaw mikromanipulator tak, aby igła była skierowana do tylnego końca zarodków pod kątem jak najbliższym równoległości do zarodków, a oś Z mikromanipulatora dostosuj tak, aby końcówka igły była wyrównana ze środkiem zarodka wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej.
Następnie wstrzyknij zarodki, szybko wprowadzając stopień do igły, tak aby końcówka igły weszła do hemokoela. Wstrzyknąć około 0,2 do 0,5 nanolitra barwnika za pomocą strzykawki o pojemności 10-25 lub 50 mililitrów. Szybko wyjmij igłę i przenieś etap do następnego zarodka do wstrzyknięcia barwnika.
Następnie dodaj dodatkowy olej z halowęglowodorem na zarodki. Przykryj zarodki pokrywką 22 x 22 milimetrów, aby stworzyć jednolitą warstwę oleju między pokrywami i zapobiec zgniatkowaniu. Po wstrzyknięciu barwnika dextran wykonaj obrazowanie na mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.
Na mikroskopie konfokalnym uzyskaj stos Z na około jednej czwartej głębokości zarodka wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej, aby ocenić lumen tchawicy. Zbadaj światło tchawicy, gruczoł ślinowy lub jelita tylne pod kątem nagromadzenia oznakowanego dekstranu. Zapisz genotyp i stadium rozwojowe każdego zarodka oraz czy znakowany dekstran gromadzi się w jakimkolwiek narządzie rurkowatym.
Zwróć uwagę na embriony, w których przestrzeń periwitelna jest mocno zabarwiona barwnikiem, ponieważ mogą one oznaczać niezamierzone wstrzyknięcie w tę przestrzeń. W zarodkach typu dzikiego makroglobulin dopełniony (MCR) był jednolicie lokalizowany wzdłuż błony bocznej na etapie 13, wzbogacony w obszarze wierzchołkowym błony bocznej na etapie 14 i silnie zlokalizowany w obszarze apikalno-bocznym, tuż u podstawy połączenia adherensa w stadium 16. Barwienie przeciwciał korowych definiowało dojrzałe, plisowane połączenia przegrody w zarodkach typu dzikiego stadium 16 podobnie jak Mcr.
W zarodkach Cora 4 mutantnych Mcr nie osiągnął silnej lokalizacji wierzchołkowej do stadium 16 i pozostał rozmieszczony wzdłuż błony bocznej. Lokalizacja E-kadheryny była podobna w zarodkach typu dzikiego i mutanta Cora 4 w stadium 16. W zarodkach typu dzikiego stadium 17, którym wstrzyknięto 10-kilodaltonowy dektran znakowany rodaminą, barwnik otaczał tchawicę, ale nie przenikał do lumenu.
W zarodkach Cora 4 mutant stadium 17 barwnik gromadził się w lumencie tchawicy w ciągu 10 minut od wstrzyknięcia. Protokół ten pozwala naukowcom z pełnym przekonaniem określić, czy gen koduje rdzeń, czy pomocniczy komponent złączeń plisowanych przegrod w tkankach embrionalnych Drosophila. Etapowanie zarodka jest absolutnie kluczowe podczas wykonywania tej techniki, ponieważ wymaga stadium 16 zarodków.
Połączenia przegrody dojrzewają z czasem, aż w pełni ugruntują się w stadium 16. Uważamy, że ten protokół można skutecznie wdrożyć w otwartym przesiewie genetycznym z wykorzystaniem linii interferencyjnych RNA do identyfikacji nowych genów złączeń przegrody plistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article presents protocols designed to evaluate the organization and barrier function of pleated Septate Junctions (pSJs) in ectodermally-derived epithelial tissues of Drosophila embryos. pSJs serve as an occluding barrier in tissues such as the epidermis, salivary glands, trachea, and hindgut, functioning similarly to vertebrate tight junctions. The described methods enable researchers to assess both the structural organization and functional integrity of pSJs in both control and mutant Drosophila embryos.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Cell biology
- Drosophila genetics
Background
- pSJs are critical for forming an occluding barrier in Drosophila epithelial tissues.
- They are composed of at least 30 proteins required for their formation.
- Core pSJ proteins localize along the lateral membrane and become enriched at the apical lateral region by stage 16 of embryogenesis.
- By late stage 15, these tissues have a fully functional occluding junction.
Purpose of Study
- To evaluate the organization of pSJs in Drosophila embryos.
- To assess the barrier function of pSJs in various epithelial tissues.
- To provide protocols for testing whether unknown genes encode core pSJ components.
Methods Used
- Immunostaining to visualize pSJ protein localization.
- Dye permeability assays to test occluding barrier function.
- Comparative analysis of control and mutant embryos.
Main Results
- Protocols allow for the demonstration of pSJ occluding function.
- Enable identification of defects in pSJ organization or function in mutants.
- Support testing of candidate genes for roles in pSJ formation.
Conclusions
- The described protocols are effective for interrogating pSJ structure and function in Drosophila embryos.
- They facilitate the identification of core pSJ components and assessment of gene function.
- These methods advance understanding of epithelial barrier formation in invertebrates.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Defining the organization and barrier function of pleated Septate Junctions (pSJs) in Drosophila embryonic epithelia addresses a critical challenge in validating epithelial barrier models for early discovery. Quantitative immunostaining and dye penetration assays provide predictive confidence in the functional integrity of candidate junctional proteins, supporting mechanistic de-risking and target validation. These protocols enable robust assessment of gene function in epithelial barrier formation, informing risk-adjusted advancement in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of candidate gene function in epithelial barrier assembly.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of core junctional proteins.
- Provides functional evidence for target validation in barrier-forming tissues.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream permeability and localization assays.
- Facilitates assay standardization and reproducibility through quantitative immunostaining and dye penetration outputs.
- Enables reliable evaluation of genetic or chemical perturbations affecting junctional integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of epithelial barrier dysfunction when extending findings to vertebrate systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of barrier-modulating targets.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development in epithelial integrity studies.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position within the early discovery continuum, bridging target validation and assay development for epithelial barrier research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene function in junctional assembly and barrier formation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for permeability and protein localization.
- Analytics: Provides measurable readouts to compare control and mutant conditions.
- Translational Research: Offers a foundation for preclinical continuity in barrier function studies.
- Enterprise Reuse: Protocols are adaptable for evaluating additional candidate genes or perturbations in epithelial models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in barrier function.
- Operational Value: Standardizes and scales immunostaining and permeability assays for cross-study reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in epithelial barrier programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets implicated in epithelial integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and epithelial tissue handling.
- Needs access to fluorescence microscopy and quantitative imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of immunostaining and dye penetration protocols.
- Adaptable to other model systems with appropriate protocol modifications.
- Limitations include model organism specificity and potential differences from vertebrate tight junctions.
