Name: Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę badania mammosfer w celu oceny właściwości komórek macierzystych raka piersi indukowanych przez Api5 w liniach MCF-10A. Protokół umożliwia analizę samoodnawiania i ekspresji markerów pluripotencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez granty od CSIR-ASPIRE (37WS(0078)/2023-24/EMR-II/ASPIRE) oraz SERB-POWER (SPG/2021/002661-G), a także częściowo przez fundusze rdzeniowe IISER, Pune. S.B. był finansowany dzięki stypendium UGC-SRF. Chcielibyśmy podziękować prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) za hojne udostępnienie komórek MCF10A oraz dr Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd) za jego cenne uwagi dotyczące rękopisu.

1. Pokrycie płytek do hodowli tkankowych poli(2-hydroksyetylometakrylan), pHEMA
<ol>
	<li>Rozpuść 1,2 g pHEMA (masa cząsteczkowa ̴ 300 000) w 100 mL 95% etanolu, ciągle mieszając w temperaturze 65 °C, aby przygotować 1,2% roztwór pHEMA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pokrój standardowe płytki do hodowli tkankowej pHEMA, nakładając 1 mL na każde pole płytki 6-polowej. Objętość roztworu pHEMA można dostosować w zależności od wielkości naczynia do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Pozwól płytkom wyschnąć w piekarniku w temperaturze 40 °C w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Wystaw płytki na działanie światła UV przez 15 min, a następnie przeprowadź trzy płukania buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), zanim zastosujesz je do ustawienia testu formowania mammosfer.</li>
</ol>
2. Wysiew mammosfer pierwszego pokolenia
<ol>
	<li>Hoduj 3D dysocjowane komórki MCF10A (Kontrola i przewlekła ekspresja Api5), uzyskane poprzez dysocjację 3D kultur dnia 16 w środowisku hodowli14. 
	UWAGA: Skład środowiska hodowli: DMEM z wysoką zawartością glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony o 5% surowicy końskiej, 10 µg/mL insuliny, 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 20 ng/mL rekombinantnego ludzkiego czynnika wzrostu naskórka (EGF), 100 ng/mL toksyny cholery i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wysuń zużyte środowisko, przepłucz komórki 1 mL DPBS, a następnie dodaj 500 µL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2  przez 12-15 min, aż wszystkie komórki zostaną trypsynizacji.</li>
	<li>Po oderwaniu wszystkich komórek dodaj 2 mL środowiska resuspendującego, aby zneutralizować aktywność trypsyny, a następnie przekręć zawiesinę komórek z prędkością 112 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Skład środowiska resuspendującego: DMEM z wysoką zawartością glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony o 20% surowicy końskiej i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną.</li>
	<li>Wysuń nadstan i resuspenduj pellet komórek w 1 mL środowiska mammosfer. Przepuść zawiesinę komórek przez igłę 25 G, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę. 
	UWAGA: Skład środowiska mammosfer: DMEM/F12 uzupełnione o 20 ng/mL czynnika wzrostu naskórka (EGF), 1 × suplement B27 bez witaminy A i 200 jednostek/mL penicyliny z streptomycyną (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Za pomocą licznika Heinca zlicz liczbę komórek i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu 0,2 × 104 komórek na pole. 
	UWAGA: Utrzymuj niską gęstość wysiewu, aby dokładnie określić wydajność formowania mammosfer, minimalizując w ten sposób wpływ agregacji komórek. Podczas pobierania lizatów białkowych do immunoblottingu gęstość komórek można zwiększyć nawet do 2,5 × 105 komórek na pole.</li>
	<li>Rozcieńcz wymaganą objętość zawiesiny komórek w 2 mL środowiska mammosfer i zasiej w każde pole płytki 6-polowej. Zasiej komórki potrójnie dla każdego warunku.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2  przez 7 dni.</li>
	<li>Po siedmiu dniach w hodowli ręcznie zlicz liczbę mammosfer o średnicy większej niż 50 µm w każdym polu za pomocą mikroskopu wyposażonego w kratkę lub za pomocą siatki kwadrantowej pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Zdjąć mammosfery za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 20x.</li>
	<li>Oblicz wydajność formowania mammosfer (MFE) za pomocą następującego wzoru5 
	 <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
3. Wysiew mammosfer drugiego pokolenia
<ol>
	<li>Zbierz mammosfery utworzone w pierwszym pokoleniu w 15 mL probówce i wyśrodkuj w temperaturze pokojowej z prędkością 300 × g przez 10 min.</li>
	<li>Wysuń nadstan, pozostawiając pellet mammosfer.</li>
	<li>Przepłucz pellet DPBS.</li>
	<li>Dodaj 200 µL 0,05% trypsyny-EDTA do pelletu mammosfer i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2  przez 2-3 min. Przepuść mammosfery w roztworze trypsyny przez igłę 25 G trzykrotnie, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę.</li>
	<li>Dodaj 0,5 mL</li></ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnego potencjalnego konfliktu interesów.

Chociaż kultury monowarstwowe uznanych linii komórek nowotworowych lub komórek pochodzenia guzowego dostarczają informacji na temat różnych szlaków molekularnych regulujących fenotypy nowotworowe, badania skupione na komórkach macierzystych raka nie mogą być prowadzone w dwuwymiarowych kulturach. Ponieważ uważa się, że komórki macierzyste raka są głównym czynnikiem przyczyniającym się do nawrotu po obecnych strategie terapii, konieczne jest ustanowienie solidnych testów do badania tych komórek1<su...

Wzrost raka piersi opornego na chemioterapię doprowadził do zwiększenia nacisk na identyfikowanie i kierowanie się na przyczynę lekooporności i nawrotu terapii, populację komórek nowotworowych znaną jako komórki macierzyste raka. Komórki te charakteryzują się zdolnością do uniknięcia różnicowania i pozostania w stanie spoczynku, co umożliwia im opór na różne metody leczenia raka1,2. Kilka metod może być zastosowanych do identyfikacji komórek macierzystych raka piersi, w tym test tworzenia mammosfer3,4,5, sortowanie komórek na podstawie markerów na powierzchni komórki6,7, izolację opartą na właściwościach wydzielania, testy tumorygeniczności in vivo7 oraz ocenę modulatorów jądrowych komórek macierzystych, takich jak Oct48, Nanog9, Sox210 i Bmi11. Zazwyczaj identyfikacja i izolowanie komórek macierzystych raka wymaga kombinacji jednej lub więcej z tych metod.
Inhibitor apoptozy 5 (Api5) to białko przeciw śmierci, które zostało znalezione w podwyższonym stężeniu w wielu rakach, w tym w raku piersi12,13,14, raku szyjki macicy15,16,17, przewlekłej białaczce limfocytów B18 oraz raku płuca o niewielkich komórkach19. Wysokie poziomy Api5 zostały związane z opornością na chemioterapię w raku szyjki macicy16 i potrójnie ujemnym raku piersi12. Istnieją coraz więcej dowodów na to, że oporność na leczenie i nawroty są często napędzane przez komórki macierzyste raka20,21. Interesujące badanie przeprowadzone przez Song i wsp.22 ujawniło, że nadmierna ekspresja Api5 w komórkach raka szyjki macicy prowadzi do podwyższonego poziomu Nanog, co przyczynia się do zwiększonej macierzystości raka. Poprzednie badania z naszego laboratorium wykazały, że nadmierna ekspresja Api5 prowadzi do transformacji nie-tumorogenicznych komórek nabłonkowych piersi hodowanych w 3D kulturach wspieranych przez Matrigel. Te przetransformowane komórki wykazują zakłóconą polaryzację, zwiększoną proliferację, wzrost niezależny od podłoża i częściowy przejściowy fenotyp epitelialno-mezenchymalny (EMT). Zmiany fenotypowe obserwowane po nadmiernej ekspresji Api5 w 3D kulturach były zachowane po rozdzieleniu sferoidów na kultury jednowarstwowe14. Biorąc pod uwagę, że Api5 jest podwyższone w chemiorezystentnych potrójnie ujemnych rakie piersi, spekulujemy, że Api5 może również regulować właściwości komórek macierzystych raka w komórkach nabłonkowych piersi.
W tym kontekście opisujemy test tworzenia mammosfer do identyfikacji komórek macierzystych raka z 3D dysocjowanych, nie-tumorogenicznych komórek nabłonkowych piersi przetransformowanych przez nadmierną ekspresję Api5, po czym wykonujemy przeciwciała do wykrywania markerów komórek macierzystych, aby potwierdzić tożsamość tych komórek. Test mammosfer polega na hodowlanom komórek nabłonkowych piersi w warunkach nie-adhezyjnych, nie-różnicujących, co umożliwia wzbogacenie komórek podobnych do macierzystych/przodków w trójwymiarowych strukturach zwanych mammosferami. Komórki nabłonkowe piersi, które nie posiadają właściwości podobnych do macierzystych, zwykle ulegają anoikisie; jednak komórki o charakterystycznych cechach macierzystych dają początek mammosferom4,5. Ta metoda została pierwotnie opracowana przez Dontu i wsp.3 i jest inspirowana testem neurosfer, który jest stosowany do badania i identyfikacji komórek macierzystych i przodków neuronów23. Opisany tutaj test mammosfer umożliwia ocenę aktywności komórek macierzystych i zdolności do samoodnawania w minimalnym pożywce uzupełnionej B27 bez witaminy A i rekombinantnym ludzkim czynnikiem wzrostu naskórka (EGF). Komórki 3D dysocjowane, nadmiernie ekspresujące Api5, są wysiewane rzadko na pokrytych płytkach poli(2-hydroksyetylometakrylan) (pHEMA). Umożliwia to komórkom wzrost w warunkach nie-adhezyjnych, tak że każda następna mammosfera jest pochodzenia klonalnego. Mammosferom pozwala się rosnąć do dnia siódmego, po czym oblicza się efektywność tworzenia mammosfer. Aby odróżnić prawdziwe komórki macierzyste od komórek nie-macierzystych, które tracą zdolność proliferacji z czasem, wykonuje się kolejne generacje tworzenia mammosfer. Seriowe przemieszczanie mammosfer polega na rozdzieleniu sferoidów zebranych z pierwszej generacji i ponownym przesiewaniu pojedynczych komórek w celu utworzenia mammosfer drugorzędowych (i kolejnych) generacji. Określa to, czy komórki mogą inicjować tworzenie sfery wielokrotnie i jest mierzone jako zdolność do samoodnawania komórek<sup class="

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Rak piersi pozostaje najczęstszym rakiem wśród kobiet na całym świecie, z najwyższymi standaryzowanymi wiekowo wskaźnikami zachorowań i umieralności. Mimo postępów w terapiach ukierunkowanych na raka piersi, 20% pacjentów wykazuje nawrót choroby, co można przypisać populacji komórek macierzystych raka odpornych na terapię (CSCs). Te komórki CSC mogą przetrwać konwencjonalne terapie, pozostając w stanie spoczynku lub przetrwały z powodu niekompletnej resekcji masy guza, co prowadzi do nawrotu w późniejszym etapie. Dlatego ostatnie badania skupiają się na identyfikacji, izolowaniu i ukierunkowywaniu tej odpornej populacji komórek. In vitro, test tworzenia mamokul serwuje jako mocny trójwymiarowy system hodowli w zawiesinie do wzbogacania i rozmnażania komórek przypominających macierzyste w populacjach nabłonkowych piersi. Przedstawiamy tu podejście wykorzystujące test mamokul do oceny fenotypu przypominającego komórki macierzyste raka, który jest umożliwiony w nienowotworzących nabłonkowych komórkach piersi przez nadmierną ekspresję inhibitora apoptozy 5 (Api5). Protokół obejmuje rozmnażanie mamokul przez kolejne przelewania w celu oceny wydajności tworzenia mamokul i zdolności do samoodnawania. Dodatkowo, lizaty białkowe pobrane z mamokul są badane pod kątem uznanych markerów macierzystości poprzez immunoblotting. Test ten umożliwia badanie nowych regulatorów, takich jak Api5, właściwości przypominających komórki macierzyste raka w populacjach nabłonkowych komórek piersi. Opisany podejście może być przystosowany do porównawczych badań interwencji molekularnych lub do przesiewowych badań środków terapeutycznych ukierunkowanych na CSC in vitro.

Aby ocenić wydajność tworzenia mammosfer w warunkach nieadherencyjnych, kontrolne i Api5-nadekspresujące komórki MCF10A w 3D były sadzone na platelkach pokrytych poliHEMA zgodnie z protokołem. Komórki z nadekspresją Api5 wykazywały 1,58-krotny wzrost średniej wydajności tworzenia mammosfer niż komórki kontrolne (Rysunek 1B,C). Ten wzrost pokazuje, że wyższa ekspresja Api5 zwiększa udział progenitorów przypominających komórki macierzyste, które przeżywają i proliferują w waru...

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

Badanie mechanizmu, w jaki nadekspresja białka w linii komórkowej nieimmunogennej prowadzi do nabycia właściwości komórek macierzystych raka. Ten protokół wykorzystuje minimalne medium uzupełnione o B-27 i EGF, co czyni go bardziej opłacalnym. Aby rozpocząć, powlecz każde pole standardowej sześciopolowej płytki tkankowej jednym mililitritem 1,2% roztworu poli 2-hydroksyetylometakrylanu i umieść płytkę w piekarniku ustawionym na 40 stopni Celsjusza do wyschnięcia w warunkach sterylnych.Wystaw wysuszoną płytkę na działanie światła ultrafioletowego przez 15 minut. Następnie, przepłucz każde pole trzykrotnie buforem Dulbecco's PBS przed użyciem płytki do ustawienia assayu tworzenia mammosfer. Uzyskaj uprzednio hodowany 3D rozdzielony pojemnik komórek MCF-10A i usuń wykorzystany medium.Przepłucz komórki jednym mililitritem buforu Dulbecco's PBS. Następnie, dodaj 500 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA i inkubatoruj w 37 stopniach Celsjusza w wilgotnym inkubatorze 5% dwutlenku węgla przez 12 do 15 minut, aż komórki zostaną trypsynizacji. Gdy komórki się oderwą, dodaj dwa mililitry medium do resuspensji, aby zneutralizować aktywność trypsyny.Odwiruj zawiesinę komórkową w 112 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odsącz nadstan i ponownie zawieś pellet komórkowy w jednym mililitrcie medium mammosferowego. Przepuść zawiesinę komórkową przez igłę 25-gauge, aby uzyskać pojedynczą suspensję komórkową.Następnie, używając hemocytometru, zlicz liczbę komórek. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórkowej, aby zasiewać 2000 komórek na pole. Rozcieńcz obliczoną objętość zawiesiny komórkowej w dwóch mililitrach medium mammosferowego na pole i zasiejcień rozcieńczony do każdego pola sześciopolowej płytki, przygotowując trzy powtórzenia dla każdej warunku.Inkubatoruj płytkę w 37 stopniach Celsjusza w wilgotnym inkubatorze 5% dwutlenku węgla przez siedem dni. Po siedmiu dniach, ręcznie zlicz liczbę mammosfer o średnicy większej niż 50 mikrometrów w każdym polu. Zdjąć obraz mammosfer za pomocą kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 20 x i oblicz efektywność tworzenia mammosfer za pomocą podanego wzoru.Zbierz mammosfery pierwszej generacji w 15-mililitrowej probówce i odwiruj w 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odsącz nadstan, pozostawiając pellet mammosferowy na dnie probówki. Przepłucz pellet za pomocą buforu Dulbecco's PBS.Odwiruj zawiesinę komórkową, aby uzyskać pellet mammosferowy, a następnie odpipetuj bufor Dulbecco's PBS bez zakłócania pelletu. Teraz, dodaj 200 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA do przepłukanego pelletu i inkubatoruj w 37 stopniach Celsjusza w wilgotnym inkubatorze 5% dwutlenku węgla przez dwie do trzech minut. Następnie, przepuść mammosfery w roztworze trypsyny przez igłę 25-gauge trzykrotnie, aby uzyskać pojedynczą suspensję komórkową.Następnie, dodaj 0,5 mililitra medium do resuspensji, aby zneutralizować aktywność trypsyny. Odwiruj zawiesinę komórkową w 112 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odsącz nadstan i ponownie zawieś pellet komórkowy w 0,5 mililitra medium mammosferowego.Używając hemocytometru, zlicz liczbę komórek i oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórkowej, aby zasiewać 2000 komórek na pole. Rozcieńcz wymaganą objętość zawiesiny komórkowej w dwóch mililitrach medium mammosferowego na pole i zasiejcień do każdego pola sześciopolowej płytki, przygotowując trzy powtórzenia dla każdej warunku. Inkubatoruj płytkę w 37 stopniach Celsjusza w wilgotnym inkubatorze 5% dwutlenku węgla przez siedem dni.Po siedmiu dniach, zlicz liczbę mammosfer o średnicy większej niż 50 mikrometrów w każdym polu. Zdjąć obraz mammosfer pod powiększeniem 20 x i oblicz zdolność do samoodnawianiu za pomocą podanego wzoru. Zbierz mammosfery pierwszej generacji do 15-mililitrowej probówki i odwiruj w 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odsącz nadstan, upewniając się, że pellet mammosferowy pozostaje niezakłócony na dnie probówki. Delikatnie przepłucz pellet za pomocą buforu Dulbecco's PBS. Po usunięciu PBS, zbierz przepłukany pellet w zimnym buforze RIPA, aby uzyskać lizat białkowy i przeprowadzić immunoblotting zgodnie ze standardowym protokołem.Wreszcie, ilościowo określ poziomy białka za pomocą analizy densytometrycznej w image J. Wybierz obszar zainteresowania na obrazie western blot i wygeneruj profil gęstości dla każdego pasa i markera pluripotencji. Normalizuj względne gęstości białka interesującego do tych GAPDH dla każdego pasa, a następnie oblicz zmianę wielokrotności dla każdego białka. Komórki MCF-10A nadekspresujące API5 wykazały 1,58-krotny wzrost średniej efektywności tworzenia mammosfer w porównaniu do komórek kontrolnych w warunkach nieadherentnych, pozbawionych surowicy.Te komórki utworzyły mammosfery drugiej generacji z zdolnością do samoodnawianiu prawie 2,5 razy wyższą niż komórki kontrolne. Immuno

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje izolowanie komórek macierzystych raka piersi od linii komórkowych raka piersi. Hodujemy te nowotworowe komórki macierzyste w celu wygenerowania pierwotnych mammosfer do oceny samoodnawiania się i obliczania wydajności formowania kul, co pozwala na porównanie różnych gęstości wysiewu.

Wytwarzanie mammosfer pierwotnych: technika określania siły działania komórek

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę badania mammosfer w celu oceny właściwości komórek macierzystych raka piersi indukowanych przez Api5 w liniach MCF-10A. Protokół umożliwia analizę samoodnawiania i ekspresji markerów pluripotencji.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Przeglądaj więcej filmów