Name: Badanie fizjologicznych barier przenoszenia wirusa u mszyc za pomocą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-14T16:16:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji wirusa do hemolimfy mszyc, omijającą barierę jelitową w transmisji wirusów roślinnych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów transmisji i funkcji genów w entomologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Aby sprawdzić, czy mszyca jest w stanie przenosić wirusa, karmimy ją zakażoną tkanką przez 2 dni.</li>
<li>Następnie pozwalamy jej żerować na zdrowej roślinie przez 5 dni. Roślinę poddaje się fumigacji, a po 3 tygodniach rozpoczynamy poszukiwanie objawów.</li>
<li>W przypadku znalezienia mszycy, która nie jest w stanie przenosić wirusa, możemy ocenić, która z 2 barier zatrzymuje wirusa, stosując procedurę mikroiniekcji.</li>
<li>Wirus jest wstrzykiwany bezpośrednio do hemocelu, co pozwala ominąć barierę transmisji w jelicie.</li>
</ol>
Aby uzyskać więcej informacji na temat tego protokołu oraz odporności roślin na żerowanie owadów, prosimy o odwiedzenie strony <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.59.032607.092825">Annual Reviews of Plant Biology</a>.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Wirus zwijania liści ziemniaka (PLRV), z rodziny Luteoviridae, infekuje rośliny psiankowate. Jest on przenoszony przez mszyce, przede wszystkim przez mszycę zieloną brzoskwiniową. Gdy niezakażona mszyca żywi się zainfekowaną rośliną, przejmuje wirusa poprzez floem roślinny. Po spożyciu wirus musi przedostać się z jelit owada do hemolimfy (krwi owadziej), a następnie przejść przez gruczoły ślinowe, aby móc zostać przeniesionym na nową roślinę. Mszyca podczas żerowania na roślinie może pobrać różne wirusy, jednak tylko niewielka ich część przenika przez jelita i gruczoły ślinowe, które stanowią dwie główne bariery transmisji umożliwiające infekcję kolejnych roślin. W warunkach laboratoryjnych do badania transmisji PLRV wykorzystujemy rośliny z rodzaju physalis. U tego gospodarza objawy charakteryzują się zahamowaniem wzrostu oraz chlorozą międzyżyłkową (żółknięciem liści pomiędzy żyłkami, przy czym same żyłki pozostają zielone). Prezentowane wideo demonstruje metodę mikroiniekcji u mszyc, które nie są wektorami wirusów PLRV, i sprawdza, czy jelita zapobiegają transmisji wirusa.
Prezentowane wideo demonstruje metodę mikroiniekcji u mszyc, które nie są wektorami wirusów PLRV, i sprawdza, czy jelita lub gruczoły ślinowe zapobiegają transmisji wirusa.

Mszyce są skutecznymi wektorami wirusów roślinnych. Mikroiniekcja wirusa do mszycy, procedura którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocelu mszycy, z pominięciem jelita, które stanowi jedną z dwóch głównych barier w cyrkulacyjnym przekazywaniu wirusa. Ta sama technika jest również stosowana do wstrzykiwania dsRNA w celu wywołania RNAi.

Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Wirus zwijania liści ziemniaka (PLRV), z rodziny Luteoviridae, infekuje rośliny psiankowate. Jest przenoszony przez mszyce, przede wszystkim przez mszycę brzoskwiniową. Gdy ...

Jeśli są one skutecznymi transmiterami wirusów roślinnych, a w przypadku mikroiniekcji wirusa, procedura, którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocytów AFib, z pominięciem jelita, które jest jedną z dwóch głównych barier dla transmisji wirusa w sposób cyrkulacyjny. Cześć, jestem Cecilia Tamrin Dehi, postdoc w katedrze patologii roślin na Uniwersytecie Cornella. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wstrzyknąć wirusa do hemocytów AFI, co umożliwi jego późniejszą transmisję na różne gatunki roślin.Na przykład, ta roślina FE jest zainfekowana wirusem PLRV (wirusa zwijania liści ziemniaka). Można zauważyć różnicę między rośliną zdrową a zainfekowaną. Najbardziej charakterystycznym objawem jest stwardnienie tkanki.PLRV jest wirusem luteowym przenoszonym przez mszyce w ich hemolimfie, która jest odpowiednikiem krwi ssaków u owadów. Gdy niezarażona mszyca żywi się zainfekowaną rośliną, zaraża się wirusem poprzez soki roślinne, co można zobaczyć tutaj. Po połknięciu wirus musi przedostać się z jelita owada do hemolimfy, a następnie przejść przez gruczoły ślinowe, aby zostać ponownie przeniesionym na roślinę ESE.Nawet jeśli podczas żerowania na roślinie ESE wirusy mogą zostać pobrane w dużej ilości, tylko część z nich przedostanie się przez jelita i gruczoły ślinowe. Są to dwie główne bariery utrudniające transmisję i infekowanie kolejnych roślin testowych. Jeśli mszyca jest niezdolna do przenoszenia wirusa, karmimy ją zainfekowaną tkanką przez dwa dni, a następnie pozwalamy jej żerować na zdrowej roślinie przez pięć dni.Następnie roślinę poddaje się fumigacji, a po trzech tygodniach rozpoczynamy poszukiwanie objawów. Gdy znajdziemy osobnika AFib, który nie jest w stanie przenieść wirusa, możemy ocenić, która z dwóch barier powstrzymuje wirusa, stosując procedurę mikroiniekcji, którą zaprezentuję dzisiaj. W tej procedurze wirus jest wstrzykiwany bezpośrednio do hemocytów, z pominięciem bariery transmisji jelitowej.Zacznijmy zatem; pokażę Państwu, jak przeprowadzić mikroiniekcję wierzchołków. Oto szklane igły, których używamy. Przygotowujemy je, wyciągając z tych szklanych kapilar przy użyciu urządzenia APU.Oto mikroinjektor służący do mikroiniekcji wirusa. Rozpocznę od umieszczenia igły w uchwycie na igłę.Wkładam igłę i umieszczam ją na miejscu. Teraz załaduję wirusa do igły, aż do górnej części tego elementu. Teraz musimy ustawić AFI do mikroiniekcji.Więc wezmę mszyce za pomocą zapodawacza i umieszczę ją w uchwycie do mszyc. Idealnie byłoby spróbować przycisnąć grzbiet mszycy do uchwytu, aby mieć dostęp do części brzusznej owada. Dobrze, świetnie.Teraz możemy przystąpić do mikroiniekcji. Dobrze, teraz ustawię igłę i przybliżę ją do AFib. Następnie dotknę igłą AFib; aby przebić egzoszkielet, najlepiej spróbować wbić ją pomiędzy segmenty u podstawy odnóży.Przystępuję do iniekcji. Pobieram teraz AFI za pomocą pędzelka i przenoszę do papieru regeneracyjnego, gdzie pozostawię go na chwilę. Musimy również wykonać mikroiniekcję kontrolnego AFI.Ta kontrolna mikroiniekcja jest wykonywana wyłącznie z użyciem buforu, bez wirusa. Stosowany przez nas bufor to 0.1 M bufor fosforanowy o pH 7. Umieszczę agrifiltr w zdrowej roślinie, w której pozostawię go na pięć dni; następnie zasilę roślinę i będę oczekiwać na rozwój objawów. Po mikroiniekcji jednoniciowego RNA, każdego dnia przez tydzień, mierzy się poziom ekspresji genu docelowego w agrifiltracie.Właśnie przeprowadziliśmy mikroiniekcję u mszycy, która nie była w stanie przenosić wirusa. Jeśli po mikroiniekcji mszyca ta będzie mogła przenosić wirusa, będzie to oznaczać, że posiada ona barierę jelitową, która blokowała wirusa. Jeśli natomiast nie rozwiną się żadne objawy, będzie to oznaczać, że mszyca ta posiada silną barierę w gruczołach ślinowych.W ten sposób pokazaliśmy, jak mikroiniekcyjnie wprowadzać wirusa do mszyc. Ta sama procedura jest wykorzystywana do mikroiniekcji dwuniciowego RNA do mszyc w celu przeprowadzenia interferencji RNA (RNAi), która jest interesującą techniką pomagającą w badaniu funkcji genów u mszyc. To wszystko w kwestii mikroiniekcji.Mam nadzieję, że materiał okaże się przydatny i pomoże Państwu w prowadzeniu eksperymentów. Dziękuję.

testing-physiological-barriers-to-viral-transmission-aphids-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie fizjologicznych barier przenoszenia wirusa u mszyc za pomocą mikroiniekcji

W niniejszym filmie zaprezentowano test sprawdzający tolerancję na nikotynę u dwóch rodzajów mszyc: jednej, która żeruje na roślinach tytoniu w polu, oraz drugiej, która tego nie robi.

Badanie tolerancji nikotyny u mszyc z wykorzystaniem eksperymentu z dietą sztuczną

W niniejszym filmie prezentujemy dwie techniki z użyciem mikroaplikatora do zakażania larw motyli z rzędu Lepidoptera baculowirusem w celu określenia efektywności owadobójczej.

Protokoły zakażania larw motyli (Lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora

W tym filmie opisujemy procedurę polegającą na wykonaniu nano-iniekcji jednoniciowego wirusa RNA o pozytywnym sensie do dorosłego samca muszki Drosophila, a następnie badaniu odpowiedzi przeciwwirusowych zainicjowanych w wyniku infekcji. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy identyfikuje regulację w górę określonych genów u zakażonych muszek, które wskazują na aktywację szlaków odpowiedzi immunologicznej, w tym interferencji RNA i sygnalizacji JAK/STAT.

Nanoiniekcja wirusa do klatki piersiowej w celu zbadania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych much

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi do oceny skuteczności grzybów entomopatogenicznych (EPF) przeciwko mszycy musztardowej (Lipaphis erysimi (Kalt.)), owadowi partenogenetycznemu. Metoda ta przedstawia w zarysie proces gromadzenia danych podczas eksperymentów na szalce Petriego, umożliwiając naukowcom konsekwentne mierzenie zjadliwości EPF wobec mszyc musztardowych i innych owadów partenogenetycznych.

Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Poznaj technikę mikroiniekcji wirusa do hemolimfy mszyc, omijającą barierę jelitową w transmisji wirusów roślinnych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów transmisji i funkcji genów w entomologii.

Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Przeglądaj więcej filmów