ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Abiodunowi Bodunrinowi, Cynthii Shu, Ajitha Cristie-David, Andrew Prantnerowi i Errile Pusod za pomoc w eksperymentach ddPCR, obsłudze komórek rakowych i eksperymentach z izolowaniem komórek rakowych w ramach tego badania.

Oświadczenie etyczne:
Probki krwi zostały uzyskane z autoryzowanych źródeł do badań i pisemna zgoda została uzyskana od wszystkich darczyńców przed pobraniem próbki. Wszystkie protokoły eksperymentalne z użyciem ludzkich próbek krwi zostały przeglądnięte i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Dostawcy Krwi, Discovery Life Sciences (Alabama, USA). Wszystkie procedury związane z ludzkimi próbkami krwi zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi standardami komitetu badawczego instytucjonalnego i z Deklaracją Helsińską.
1. Obogacanie komórek nowotworowych za pomocą półautomatycznego systemu izolacji komórek
Uwaga: W tej sekcji opisano wzbogacanie krążących komórek nowotworowych (CKN) za pomocą półautomatycznej platformy izolacji komórek, z wykrywaniem mutacji EGFR metodą kropelkową techniki PCR cyfrowej. Do prezentacji wyników użyto modelowej próbki CKN, a przed zastosowaniem klinicznym zaleca się walidację testu. Do eksperymentu użyto dwie linie komórek raka płuca niedrobnokomórkowego (NSCLC): NCI-H1975 (mutacje EGFR L858R/T790M) i A549 (EGFR typu dzikiego), które służyły jako negatywna kontrola dla wykrywania mutacji.
<ol>
	<li>Próbka krwi
	<ol>
		<li>Upewnić się, że uzyskano pisemną zgodę od darczyńców/pacjentów przed pobraniem krwi. Uzyskać aprobatę Instytucjonalnej Rady ds. Badań (IRB), gdy jest to wymagane, w przypadku badań z użyciem ludzkich próbek, w tym krwi.</li>
		<li>Do testu wykonalności, uzyskać próbkę krwi od autoryzowanego dostawcy stron trzeciej wyłącznie do badań.</li>
		<li>Pobrać krew obwodową w probówkach z kwasem etilenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przetworzyć próbkę według protokołu Genesis Enrichment w ciągu 48 godzin. 
		Uwaga. Do analizy dalszej i protokołu Genesis Enrichment zalecane są probówki EDTA. Do barwienia na szklanym slajdzie z protokołami Genesis Enumeration (bezpośrednie/pośrednie) można użyć probówki Streck i EDTA.</li>
		<li>Przechowywać próbki krwi pobranych do probówek EDTA w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia. Do izolacji komórek z użyciem Genesis nie jest wymagane żadne wstępne leczenie, a do protokołu wzbogacania można użyć krwi pełnej do 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki modelowej CKN/próbki klinicznej
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór komórek w stężeniu 100-1000 komórek w 10 μl odpowiedniego pożywka do hodowli komórek lub buforu fosforanowego buforu fosforanowego (PBS). Pominąć ten krok, jeśli używane są próbki kliniczne. 
		UWAGA: Stężenia dodatków użyte w tym badaniu są wyższe niż zazwyczaj obserwowane stężenia CKN w próbkach klinicznych i są przeznaczone wyłącznie do demonstracji metody.</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu komórek do 10 ml krwi całkowitej od zdrowego darczyńcy, aby przygotować modelową próbkę CKN. W przypadku próbek klinicznych, nie dodawać żadnych komórek nowotworowych do krwi całkowitej pacjentów.</li>
		<li>Wymieszać próbkę krwi z równą objętością PBS (1x) i delikatnie mieszać na krętaku krwi w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Jeśli przechowywanie przekracza godzinę, przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie CKN
	<ol>
		<li>Włączyć system izolacji komórek Genesis i odczekać, aż system zostanie zainicjowany. Może to zająć do 5 min.</li>
		<li>Umieścić pojemnik na odpady w pozycji u podstawy stacji i podłączyć przewód pojemnika na odpady do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Wcisnąć przewód do zaciśnięcia zaworu, aż poczujesz, jak się kliknie na miejscu i podłączyć przewód systemu Genesis do wylotu pojemnika na odpady.</li>
		<li>Uruchomić test własny, naciskając "start" z ekranu głównego i dotykając "Self-Test" na ekranie.</li>
		<li>Gdy test własny się zakończy, wybrać "2.0 Kit Enrichment" z opcji protokołu.</li>
		<li>Postępować zgodnie z instrukcjami na ekranie, wypełnić wymagane pola danych i zakończyć procedurę zaciskania i montażu. Skuteczne zaciskanie za pomocą 70% etanolu i 1x PBS daje najlepszą wydajność i odzyskiwanie komórek dla ekstrakcji DNA. Zaciskanie trwa około 20 min.</li>
		<li>Upewnić się, że wybrany jest właściwy program wzbogacania (2.0 Kit Enrichment) i że wszystkie połączenia przewodowe i umieszczenie ślizgów są odpowiednio zabezpieczone przed rozpoczęciem uruchomienia. Unikać wprowadzania bąbelek powietrza podczas ładowania próbki, ponieważ może to wpłynąć na spójność przepływu i wydajność uchwytywania.</li>
		<li>Delikatnie wlać modelową próbkę przygotowaną z kroku 1.2.3 (Modelowa próbka CKN/Próbka kliniczna) do lejka wejściowego i kontynuować protokół wzbogacania, naciskając "Resume" na ekranie systemu.</li>
		<li>Gdy uchwycenie CKN zostanie zakończone, półautomatyczny system izolacji komórek wezmą użytkownikowi, aby usunąć pojemnik na odpady i ponownie podłączyć zbiornik do zaciskania.</li>
		<li>Odłączyć przewód systemu Genesis od pojem

<ol><li>Bidard, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+camizestrant+for+emerging+ESR1-mutated+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">First-line camizestrant for emerging ESR1-mutated advanced breast cancer.</a> N Engl J Med. 393 (6), 569-580 (2025).</li>
<li>Pawlikowska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+for+the+noninvasive+monitoring+and+personalization+of+non-small+cell+lung+cancer+%28NSCLC%29+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells (CTCs) for the noninvasive monitoring and personalization of non-small cell lung cancer (NSCLC) therapies.</a> J Thorac Dis. 11, Suppl 1. S45-S56 (2019).</li>
<li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutations+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+Classification%2C+characteristics+and+resistance+to+third-generation+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">EGFR mutations in non-small cell lung cancer: Classification, characteristics and resistance to third-generation EGFR-tyrosine kinase inhibitors (Review).</a> Oncol Lett. 30 (2), 375(2025).</li>
<li>Riely, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiely%2C+GJ+%22NCCN+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology%3A+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%22">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Non-Small Cell Lung Cancer</a>. , Version 5.2026, National Comprehensive Cancer Network. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nccn.org">https://www.nccn.org</a> (2026).</li>
<li>Gogoi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+and+sensitive+microfluidic+device+for+capturing+and+characterizing+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+from+clinical+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an automated and sensitive microfluidic device for capturing and characterizing circulating tumor cells (CTCs) from clinical blood samples.</a> PLoS One. 11 (1), e0147400(2016).</li>
<li>Kang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+rapid+viable+enrichment+of+circulating+tumor+cell+by+photosensitive+polymer-based+microfilter+device%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Label-free rapid viable enrichment of circulating tumor cell by photosensitive polymer-based microfilter device.</a> Theranostics. 7 (13), 3179-3191 (2017).</li>
<li>Alexander, R. F., Spriggs, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+diagnosis+of+tumour+cells+in+circulating+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The differential diagnosis of tumour cells in circulating blood.</a> J Clin Pathol. 13 (5), 414-424 (1960).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabières, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+in+cancer+patients%3A+Challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells in cancer patients: Challenges and perspectives.</a> Trends Mol Med. 16 (9), 398-406 (2010).</li>
<li>Allard, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li>
<li>Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+technologies+for+CTC+isolation%3A+A+review+of+10+years+of+intense+efforts+towards+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based technologies for CTC isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 1981(2022).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers (Basel). 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Fehm, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+leukapheresis+for+CTC+analysis+in+breast+cancer+patients%3A+CTC+frequency%2C+clinical+experiences+and+recommendations+for+standardized+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Diagnostic leukapheresis for CTC analysis in breast cancer patients: CTC frequency, clinical experiences and recommendations for standardized reporting.</a> Cytometry A. 93 (12), 1213-1219 (2018).</li>
<li>Markou, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preoperative+mutational+analysis+of+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+and+plasma-cfDNA+provides+complementary+information+for+early+prediction+of+relapse%3A+A+pilot+study+in+early-stage+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preoperative mutational analysis of circulating tumor cells (CTCs) and plasma-cfDNA provides complementary information for early prediction of relapse: A pilot study in early-stage non-small cell lung cancer.</a> Cancers (Basel). 15 (6), 1877(2023).</li>
<li>Smilkou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+rate+for+ESR1+mutations+is+higher+in+circulating-tumor-cell-derived+genomic+DNA+than+in+paired+plasma+cell-free+DNA+samples+as+revealed+by+ddPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Detection rate for ESR1 mutations is higher in circulating-tumor-cell-derived genomic DNA than in paired plasma cell-free DNA samples as revealed by ddPCR.</a> Mol Oncol. 19 (7), 2109-2119 (2025).</li>
<li>Schmid, S., Li, J. J. N., Leighl, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+osimertinib+resistance+and+emerging+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of osimertinib resistance and emerging treatment options.</a> Lung Cancer. 147, 123-129 (2020).</li>
</ol>

Obecność komórek nowotworowych krążących we krwi pacjentów z guzami litym przedmiotem badań od ponad 60 lat7 i jest rozpoznawana jako pierwotna biopsja płynna od czasu ich pierwszego włączenia do zbiorczego terminu w 2010 roku8. Jednakże, CTC są rzadkie i trudne do selektywnego izolowywania z pełnej krwi9. Istnieją jednak liczne metody przechwytywania i wzbogacania CTC, jak to ilustrują poniższe przeglądy10,11, obejmujące podejścia fizyczne/mikrofluidyczne, jak również metody selekcji markerów powierzchniowych komórek. Wiele z tych metod jest czasochłonnych, wymagających dużo pracy i często obejmuje wiele etapów/systemów, aby osiągnąć wymaganą selektywność.
Przechwytywanie CTC z pełnej krwi w tym protokole opiera się na ich wielkości (> 8 µm) i braku deformacji na tle fenotypowo normalnych czerwonych i białych krwinek, które przechodzą przez mikrofluidyczne pory w mikrofluidycznych ślizgach do przechwytywania komórek. Dlatego prawidłowe ładowanie próbki, właściwe przygotowanie ślizgu i zapobieganie zatykaniu są kluczowymi krokami dla utrzymania efektywności przechwytywania i odzyskiwania próbki.
Aby przepływ pracy był udany, zarządzanie próbkami krwi jest kluczowym czynnikiem; upewnienie się, że świeża krew jest wykorzystywana do przetwarzania próbek i utrzymanie właściwych warunków transportu i przechowywania, aby zapobiec hemolizie. Degradacja czerwonych krwinek lub białych krwinek spowoduje wpływ na jakość przechwytywania CTC i czułość wykrywania rzadkich wariantów genomowych, odpowiednio. Jeśli zaobserwuje się hemolizę, skrzepowanie lub widoczne zniszczenie próbki, próbka nie powinna być przetwarzana, ponieważ te warunki mogą zmniejszyć odzyskiwanie CTC i czułość wykrywania mutacji w dalszym biegu.
Ponieważ CTC mogą być obecne na poziomie poniżej 1 CTC na 10 milionów białych krwinek w pełnej krwi, konieczne jest przechwytywanie tak dużej objętości, jak to jest dozwolone dla wzbogacenia. Mikrofluidyczne ślizgi do przechwytywania komórek mogą pomieścić 10 ml krwi zgodnie ze standardowymi rurką do pobierania krwi takimi jak Streck i EDTA, które zazwyczaj zawierają ~7,5–10 ml krwi. Zmniejszenie pobranej objętości krwi wpłynie bezpośrednio na wrażliwość przechwytywania CTC i późniejsze wykrywanie wariantów genomowych. Uzyskanie objętości poza tym rutynowym od pacjentów leczonych może być wyzwaniem zarówno klinicznie, jak i etycznie. Poza zwiększeniem objętości ponad 10 ml lub wykorzystaniem próbek diagnostycznych leukaferezy, aby zwiększyć populacje WBC/CTC12, zwiększenie czułości z większymi objętościami wykracza poza zakres platformy Genesis obecnie.
Protokół został przeprowadzony zgodnie ze standardowym SOP, ale ze szczególną troską o zapewnienie świeżego pobierania krwi, kompleksowe mieszanie EDTA z krwią przy pobieraniu i staranne przechowywanie pobranej krwi przed użyciem, ilustrując potencjał tego protokołu do zastosowania w środowisku klinicznym, gdzie rutynowe standardowe procedury operacyjne są cenione. Jednakże, ponieważ ten protokół został pokazany za pomocą sztucznych próbek, potwierdzenie z klinicznymi próbkami pacjentów jest wymagane przed rutynową implementacją kliniczną.
Czułość wykrywania mutacji w populacji CTC zależy zarówno od obecności CTC w standardowej próbce pełnej krwi, jak i od wykrycia mutacji somatycznych w tej populacji CTC, co zależy od częstości mutacji w podpopulacji CTC. Te dwa czynniki zakłócające ostatecznie ograniczają ogólną czułość wykrywania mutacji w przechwyconej populacji CTC; mając większy wpływ na wczesne próbki wykrywania, w porównaniu z późnymi próbkami, które prawdopodobnie mają wyższe liczby CTC i wyższe populacje CTC noszące mutacje.
Obecne badania nad biopsją płynną opartą na krwi są mocno skoncentrowane na krążącym DNA nowotworowym obecnym w osoczu jako wskaźnik obecności guza. Zazwyczaj wykrycie ctDNA opiera się na obecności markerów genomowych specyficznych dla nowotworu np. SNVs, warianty strukturalne, MSI-H, TMB i CGP. CTC jako mniej wykorzystywany, ale równie dopuszczalny biomarker w biopsji płynnej są znane z przedostawania się do krwioobiegu z rosnących i potencjalnie metastazujących guzów8. Analiza CTC koncentruje się głównie na markerach powierzchniowych komórek stosowanych do ich przechwytywania lub do potwierdzenia po przechwytywaniu za pomocą ustanowionych lub niestandardowych paneli przeciwciał np. pan-Cytokeratin, Wimentyna, PD-L1, EpCAM itp. Natomiast analiza molekularna CTC jest ograniczona w przyjęciu ze względu na wyzwania związane z selektywnym wzbogacaniem i przechwytywaniem CTC z pełnej krwi, a następnie precyzyjną analizą podpopulacji CTC. Obecna metoda wykorzystuje standaryzowany przepływ pracy obejmujący ustanowione protokoły przechwytywania CTC, następnie analizę molekularną za pomocą ddPCR z gotowymi zestawami dla znanych patologicznie istotnych mutacji genomowych w sztucznych próbkach pełnej krwi. Takie podejście jest znaczące, poniewa

Dzięki ciągłym badaniom translacyjnym nad wartością biopsji płynowych, a ostatnio także publikacjom szczególnie ilustrującym kliniczną wartość monitorowania ctDNA w wyborze terapii1, biopsje płynowe osiągają dojrzałość. Biopsje płynowe zapewniają alternatywną, mniej inwazyjną metodę monitorowania i prognozowania raka w porównaniu z konwencjonalnymi metodami biopsji tkankowych. Intensywne badania skupiły się na fragmentowanym DNA znajdującym się we krwi (wolny od komórek DNA, cfDNA), a zwłaszcza podzespole pochodzącym z guza, znanym jako krążący DNA nowotworowy (ctDNA). ctDNA było intensywnie badane przez ostatnie dwie dekady i wykazano, że zawiera specyficzne dla guza mutacje genów, np. SNVs i warianty strukturalne, a także markery metylacji i charakterystyczny wzór fragmentów w porównaniu z nie-nowotworowym cfDNA. Te specyficzne cechy ctDNA są obecnie wykorzystywane do monitorowania statusu molekularnego pacjentów z rakiem na poziomie wczesnego wykrycia, reakcji na terapię, choroby resztkowej minimalnej (MRD) i statusu oporu na terapię. Podobnie krążące komórki nowotworowe (CTC), oddzielone od pierwotnego miejsca guza do naczyń krwionośnych, ostatnio ewoluowały jako obiecujące biomarkery, których istnienie i ilość we krwi wykazują ścisłą korelację z postępem choroby i potencjalnym nawrotami. Podczas gdy bardzo wczesne wstępne badania nad CTC opierały się głównie na ich ekspresji markerów białkowych i liczeniu2, w badaniach CTC na poziomie molekularnym, w tym wykrywaniu mutacji genomowych w receptorze estrogenu 1 (ESR1) w przypadku raka piersi i genu czynnika wzrostu naskórka (EGFR) dla różnych nowotworów, osiągnięto znaczący postęp.
Mutacje EGFR są kluczowe zarówno dla określenia patogenezy i rokowania, jak i decydowania o najskuteczniejszych leczenach dla pacjentów z rakiem płuc3. Rutynowe testowanie na mutacje EGFR może przyjąć formę biopsji twardego guza w momencie rozpoznania lub progresji lub, coraz częściej, pobierania ctDNA z osocza pacjentów z nawracającym/opornym rakiem płuc4. Jednak, w przeciwieństwie do podejść opartych na ctDNA, analiza materiału genomowego pochodzącego z CTC umożliwia bezpośrednią ocenę całych komórek nowotworowych i ich profili mutacyjnych. Wraz z badaniami MRD ctDNA, wykrywanie mutacji w genie EGFR rzadkich CTC może zapewnić dodatkowe zrozumienie potencjalnej skuteczności schematów leczenia i poza tym, rokowania pacjenta, szczególnie w przypadku raka płuc niedrobnokomórkowego (NSCLC). Rzadkość CTC i brak ustalonych protokołów wykorzystujących przyjazne dla użytkownika narzędzia dla klinik stanowią poważną przeszkodę w szerszym przyjęciu. Ta ograniczona dostępność podkreśla potrzebę stworzenia znormalizowanego i przystępnego przepływu pracy, który umożliwia zarówno efektywne izolację CTC, jak i dalszą analizę molekularną. Dlatego celem niniejszego badania jest przedstawienie powtarzalnego przepływu pracy do wzbogacania krążących komórek nowotworowych i kolejnego wykrywania mutacji EGFR przy użyciu połączonego podejścia do izolacji komórek i cyfrowej analizy PCR.
System izolacji komórek Genesis z mikrofluidycznymi ślizgami do chwytania komórek może chwytać CTC w półautomatycznym procesie z wysoką żywotnością i wysoką efektywnością chwytania, w oparciu o ich większą wielkość i mniejszą deformowalność w porównaniu z podstawową populacją białymi i czerwonymi krwinkami krwi5,6. Uchwycone CTC mogą następnie być odzyskiwane z mikrofluidycznych ślizgów do chwytania komórek przez odpływ wsteczny z ślizgu do dalszej analizy genomowej. Aby określić obecność określonych mutacji EGFR w genomowym DNA uchwyconych komórek, wykonano ddPCR na genomowym DNA pochodzącym od CTC przy użyciu testów na mutacje EGFR T790M i L858R.
Ten protokół, wykorzystujący modelową próbkę CTC i komercyjnie dostępne testy ddPCR, jest zaprojektowany tak, aby stanowić punkt wejścia do ukierunkowanego wykrywania mutacji związanych z rakiem w CTC. Ten protokół zapewnia praktyczne podejście do wykrywania mutacji związanych z rakiem w krążących komórkach nowotworowych i może wspierać dalsze badania nad zastosowaniami biopsji płynowych.

<table><tbody><tr><td>Genesis Cell Isolation System</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>12019822</td><td>Instrument (Określany jako „półautomatyczny system izolacji komórek”)</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864002</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader lub QX600 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864003 lub 12013328</td><td>Instrument (Określany jako „instrument Droplet Reader”)</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1814000</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler with 96&ndash;Deep Well Reaction Module</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851197</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>Q33226</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Celselect Slides</td><td></td><td></td><td>Materiał eksploatacyjny (Określany jako mikrofluidyczne slajdy do kapsułowania komórek)</td></tr><tr><td>Celselect Slides Enrichment Kit 2.0</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>17009455</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>DNAzol BD</td><td>Molecular Research Center, Inc.</td><td>DN129</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>MseI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Assay ID dHsaMDV2010019</td><td>Test</td></tr><tr><td>ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Assay ID dHsaMDV2010021</td><td>Test</td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>Zestaw testowy</td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864008</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Droplet Generation Oil for Probes</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1863005</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Automated Droplet Generation Oil for Probes</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1864110</td><td>Materiał eksploatacyjny (opcjonalny)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1863023</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1814040</td><td>Odtwarzalna folia</td></tr><tr><td>DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>12001925</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr></tbody></table>

profilowanie mutacji dna receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej pcr

Profiling Epidermal Growth Factor Receptor DNA Mutations in Circulating Rare Cells Using a Cell Isolation System and Droplet Digital PCR

Mutacje występujące w genie czynnika wzrostu naskórka (EGFR) są kluczowe dla określenia najskuteczniejszych terapii dla pacjentów z rakiem płuc. Rutynowe testowanie na mutacje EGFR może mieć postać biopsji guza lub analizy ctDNA z osocza pacjentów z rakiem płuc. Chociaż testowanie próbek krwi pacjentów z rakiem płuc jest rutynowo wykonywane, aby uzyskać informacje o obecności lub nawrocie raka płuc, poprzez wykrywanie ctDNA lub CTC, zazwyczaj nie obejmuje późniejszej analizy molekularnej schwytanych komórek. Wykrywanie pojedynczych mutacji w genie EGFR obecnych w rzadkich krążących komórkach nowotworowych (CTC) może dać dodatkowe informacje na temat potencjalnej skuteczności terapii ukierunkowanej i, co więcej, rokowania pacjenta, szczególnie w przypadku niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Niestety, rzadkość takich krążących komórek nowotworowych i brak uproszczonych procedur do badania ich informacje genomowych stanowią znaczące wyzwanie wykrywcze.
Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie realistycznego potencjału wychwytywania CTC z pełnej krwi i oceny ich zawartości molekularnej za pomocą ddPCR. Do wychwytywania krążących komórek nowotworowych zastosowano półautomatyczną platformę izolację komórek opartą na wielkości, które następnie odzyskiwano do dalszej analizy molekularnej. Aby określić obecność określonych mutacji EGFR w genomowym DNA schwytanych komórek, wykonano ddPCR przy użyciu testów na EGFR pT790M i EGFR pL858R.
Dwie oddzielne linie komórek raka płuca (A549 i H1975) były aktywnie wzbogacane z pełnej krwi, a dokładne ilości mutacji występujące w liniach komórek H1975 były wykonywane za pomocą ddPCR.

System izolacji komórek Genesis z zastosowaniem mikrofluidycznych slajdów do wychwytywania komórek wyizolował średnio 84% dodanych komórek nowotworowych w próbkach krwi o stężeniu 25–250 cells·mL-1 (Rycina 3A). Ta wysoka wydajność wychwytywania wykazuje skuteczność etapu wzbogacania w izolacji rzadkich krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pełnej. Opcjonalne barwienie immunocytochemiczne komórek wychwyconych na mikrofluidycznych slajdach do wychwytywania komórek, przeprowadzone zgodnie z protokołem Enumeration, wykazało identyfikację rzadkich komórek przy użyciu dwóch przeciwciał dodatnich przeciwko cytokeratynie, DAPI do identyfikacji komórek jądrzastych oraz jednego przeciwciała ujemnego przeciwko CD45, które jest ekspresjonowane w większości białych krwinek, ale zazwyczaj nie w CTC&#160;(Rycina 3B). Taki wzór barwienia potwierdza pomyślną identyfikację krążących komórek nowotworowych przy jednoczesnym wykluczeniu białych krwinek z tła.
Testy wykrywania mutacji metodą ddPCR umożliwiły identyfikację i profilowanie mutacji EGFR w wzbogaconych komórkach nowotworowych. Badanie to wykazało możliwość wykrycia mutacji gDNA w komórkach, wstępnie wzbogaconych za pomocą platformy Genesis, z wykorzystaniem ddPCR oraz testów wykrywania mutacji. Wykresy ddPCR (Rysunek 4) dla linii komórkowych nowotworowych A549 (EGFR typu dzikiego) i H1975 (L858R/T790M) w odniesieniu do dwóch badanych mutacji EGFR wykazały, że ddPCR może czule wykrywać mutacje obecne w linii komórkowej H1975 po dodaniu jej do krwi pełnej i późniejszym wzbogaceniu za pomocą platformy Genesis. Pozytywne sygnały mutacji zaobserwowano w komórkach H1975, natomiast w komórkach A549 nie wykryto sygnałów mutacji, co potwierdza specyficzność testu. Próbki wzbogacone kontrolną linią komórkową A549 nie wykazały kropli zawierających mutację, co potwierdza, że wykrycie mutacji L858R i T790M jest ściśle związane z linią komórkową H1975. Ta demonstracja izolacji CTC na platformie Genesis, a następnie analizy molekularnej z wykorzystaniem ddPCR, może stanowić potężne narzędzie diagnostyki molekularnej w badaniach nad biopsją płynną oraz w badaniach przedklinicznych z użyciem próbek klinicznych w celu monitorowania progresji choroby i personalizacji leczenia. Podsumowując, wyniki te dowodzą, że połączony proces wzbogacania i analiza ddPCR mogą niezawodnie wykrywać i kwantyfikować mutacje EGFR w krążących komórkach nowotworowych.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat płynnej biopsji w celu profilowania mutacji DNA EGFR w raku płuca. (A) Ilustracja heterogenności guza pokazująca różne profile mutacji EGFR wykryte za pomocą konwencjonalnej biopsji tkankowej oraz krążących komórek nowotworowych (CTCs) z płynnej biopsji. (B) Schematyczny przebieg profilowania mutacji DNA EGFR w krążących komórkach nowotworowych z wykorzystaniem płynnej biopsji.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Demonstracja profilowania mutacji DNA EGFR z wykorzystaniem próbek syntetycznych. (A) Przygotowanie modelowej próbki CTC poprzez dodanie linii komórkowych raka płuca o określonym statusie mutacji EGFR do krwi pełnej od zdrowego dawcy. (B) Schemat procedury wykrywania mutacji DNA EGFR w krążących komórkach nowotworowych z wykorzystaniem dostępnych komercyjnie platform.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig3v1.jpg" /> 
Rycina 3: Bezetykietowa izolacja i identyfikacja krążących komórek nowotworowych. (A) Wydajność wychwytu linii komórkowych raka płuca (A549 i H1975) dodanych do próbek krwi pełnej od zdrowych dawców przy użyciu półautomatycznej platformy do izolacji rzadkich komórek.&#160;(B) Immunobarwienie wychwyconych komórek wykazujące obecność cytokeratyna-dodatnich komórek nowotworowych. Pasek skali = 10 µm.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70016/70016fig4.jpg" /> 
Rycina 4Profilowanie mutacji EGFR z wykorzystaniem cyfrowego PCR w kroplach. Dwuwymiarowe wykresy amplitudy przedstawiające detekcję mutacji EGFR w wzbogaconych komórkach nowotworowych po lizie komórek i ekstrakcji DNA. Komórki A549 (typ dziki) nie wykazują sygnałów specyficznych dla mutacji, podczas gdy komórki H1975 wykazują sygnały dodatnie dla mutacji EGFR L858R oraz T790M. Analiza ta umożliwia czułą detekcję i kwantyfikację populacji DNA zmutowanego i typu dzikiego.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70016/70016fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość na reakcję (µl)</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2x ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >10</td>
			<td >1x</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >20x primery/sonda dla celu (FAM) i typu dzikiego (HEX)</td>
			<td >1</td>
			<td >1x</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Enzym restrykcyjny, rozcieńczony (Msel)</td>
			<td >1</td>
			<td >2-5 U/reakcję</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka docelowa i/lub woda wolna od DNaz (NTA)</td>
			<td >Zmienna</td>
			<td >Zmienna</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość całkowita</td>
			<td >20</td>
			<td >-</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Konfiguracja reakcji dla detekcji mutacji metodą cyfrowego PCR w kropelkach.&#160;Skład i stężenia końcowe odczynników użytych do wykrywania rzadkich mutacji EGFR w próbkach DNA pochodzących z komórek nowotworowych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Etap cyklicznej zmiany temperatury</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td rowspan="2">Czas</td>
			<td>Szybkość narastania temperatury</td>
			<td rowspan="2">Liczba cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(&#186;C)</td>
			<td>(&#186;C/s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktywacja enzymu</td>
			<td>95</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>2</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przyłączanie/elongacja</td>
			<td>55</td>
			<td>1 min</td>
			<td>2</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dezaktywacja enzymu</td>
			<td>98</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chłodzenie</td>
			<td>4</td>
			<td>30 min</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przytrzymać (opcjonalnie)</td>
			<td>4</td>
			<td>&#8734; (nieskończoność)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Użyć podgrzewanej pokrywy ustawionej na 105°C&#186;C i ustaw objętość próbki na 40&#956;l dla termocyklera C1000 Touch 
			z modułem reakcyjnym z 96 głębokimi dołkami.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki cykli termicznych dla amplifikacji w cyfrowym PCR.&#160;Parametry cykli termicznych zastosowane do amplifikacji celów mutacji EGFR przy użyciu termocyklera z modułem reakcyjnym na 96 dołków.

Przedstawiamy protokół ilustrujący izolację rzadkich komórek rakowych z przygotowanej próbki zawierającej pełną krew i wzbogaconą w komórki raka płuca. Protokół wykorzystuje półautomatyczną platformę do izolacji komórek bez znaków. Wzbogacone komórki są następnie analizowane pod kątem mutacji receptora czynnika wzrostu naskórka za pomocą kroplowej cyfrowej PCR.

Profilowanie mutacji DNA receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej PCR

Mutations found within the epidermal growth factor gene (EGFR) are critical for determining the most effective treatments for patients with lung cancer. ...

profiling-epidermal-growth-factor-receptor-dna-mutations-circulating

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Bio-Rad Laboratories.  Here we present a protocol to illustrate the isolation of rare cancer cells from a contrived sample containing whole blood and spiked in lung cancer cells. The protocol utilizes a semi-automated, label-free cell isolation platform. Enriched cells are subsequently analyzed for epidermal growth factor receptor mutations using droplet digital PCR.

Profilowanie mutacji DNA receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej PCR

Przeglądaj więcej filmów