Profilowanie fenotypowe fenotypów behawioralnych podobnych do parkinsońskiego wywołanych MPTP u larw danio pręgowanego na podstawie eksperymentu behawioralnego
15 maja 2026
Protokół ten ustanawia paradygmat fenotypowania behawioralnego u larw danio objętych zabiegiem MPTP, aby ocenić deficyty ruchowe i niemotoryczne podobne do choroby Parkinsona.
Przedstawiamy wieloparametryczny protokół zachowania umożliwiający kompleksowe profilowanie motorycznych i niemotorycznych fenotypów Parkinsona u larw danio pręgowanych. Protokół ten dotyczy modelowania choroby Parkinsona, badań przesiewowych leków, neurotoksyczności środowiskowej oraz badań z użyciem larw ryb. Na początek załóż odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne.
Rozcieńcz 100x roztwór E3 w proporcji 1 do 100 z wodą ultraczystą, aby przygotować medium o jednej sile. Teraz wybieraj dojrzałego płciowo samca i samicę dorosłego danio pręgowanego. Korzystając z akwariów hodowlanych z odłączanymi przegrodami, przeprowadzaj kontrolowany rozptyl.
O godzinie 20:00 umieszczaj samca i samice danio w oddzielnych sekcjach zbiorników lęgowych w proporcji dwóch samców na trzy samice, używając przegrod, aby je rozdzielić. Następnego ranka o 8:00 zdejmij przegrody, aby umożliwić godowanie. Zbieraj zarodki godzinę później i myj je trzy razy czystą wodą systemową.
Zarodki umieść w 100-milimetrowych szalkach Petriego zawierających 20 mililitrów świeżego medium E3. Następnie inkubuje zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w 14-godzinnym świetle i 10-godzinnym cyklu ciemności. Jeden dzień po zapłodnieniu ostrożnie usuń niezapłodnione, zdeformowane i nieprawidłowe zarodki za pomocą pipety pastwiskowej.
Aspiruj medium powoli od krawędzi szalki Petriego i dodaj świeże medium zarodkowe E3 wzdłuż ściany szalki Petriego, aby zminimalizować zakłócenia dla dzikich zarodków. Dla grupy poddawanej leczeniu MPTP należy użyć roztworu MPTP o stężeniu 50 mikromolów. Cztery dni po zapłodnieniu modyfikuj pipetę pastwiskową o pojemności trzech mililitrów, odcinając 10 milimetrów od końca, aby uzyskać szeroki otwor.
O godzinie 18:00 użyj zmodyfikowanej pipety, aby wybrać larwy danio pręgowanego z każdej grupy i przenieść po jednej larwie na dołek do płytki z 96 dołkami. Obserwuj każdą jamkę pod mikroskopem stereoskopowym, aby potwierdzić, że każda larwa danio jest zdrowa. Sprawdź, czy płetwy są otwarte i regularnie się kołyszą, ciało jest wyprostowane, a drabina pływacka napompowana.
Następnie dokładnie wyczyść dno płyty, aby zapobiec wpływowi brudu na wyniki śledzenia wideo. Następnie przenieś płytkę z 96 dołkami centralnie na dno komory skrzynki zebra. Wybierz tryb kwantyzacji w oprogramowaniu do śledzenia wideo.
Aby monitorować regulację snu i czuwania, ustaw regulację światła tak, aby wyłączyła światło o 22:00 i włączyła się o 8:00. Konfiguruj parametry oprogramowania tak, aby próg wykrywania był ustawiony na 40, burst na 25, freeze na 4, całkowity czas monitorowania na 52 godziny, a następnie rozmiar na 60 sekund. Rozpocznij procedurę śnięcia o 8:00 PM.To monitoruj fotomotoryczne reakcje, umieść larwy po zapłodnieniu pięć dni po zapłodnieniu do płytki z 96 dołkami, po jednej larwie na dołek. Następnie ustaw program przejścia światła na 0 do 60 sekund ciemności, a następnie 60 do 120 sekund stałego światła.
Rozpocznij protokół i zbieraj parametry ruchu co sześć sekund podczas 120-sekundowego testu. Zatrzymaj protokół po 120 sekundach i wyeksportuj plik danych. Następnie umieszczaj larwy w całkowitej ciemności na pięć minut, aby przystosować je do kolejnego badania ciemnego światła stroboskopowego.
Ustaw program przejścia światła tak, aby światło stroboskopowe było na 10 Hz przez 60 sekund. Aby ocenić thigmotaksę, wybierz dwie płytki z sześcioma dołkami. Napełnij każdy dołek czterema mililitrami podłoża E3.
Pięć dni po zapłodnieniu zbieraj larwy danio pręgowanego z grupy dzikiej oraz grupy objętej MPTP i umieszczaj je w osobnych płytkach sześciu dołków. Przed oceną thigmotaksji umieść płytki w pudełku zebra na 15 minut, aby umożliwić aklimatyzację. Następnie użyj funkcji obszaru rysowania, aby narysować dwa koncentryczne koła w każdej studni o promieniu wewnętrznego koła równego połowie promienia studni i rozpocznij ocenę.
Do oceny lokomotorycznej przenieś pięciodniowe larwy danio pręgowanego z grupy typu dzikiego oraz grupy z MPTP do dwóch oddzielnych płytek z 12 dołkami. Po 15-minutowej aklimatyzacji wybierz tryb analizy online śledzenia i rejestruj aktywność lokomotoryczną przez pięć minut za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Do testu reakcji na przestraszenie przenieś pięciodniowe larwy indywidualnie do dwóch płytek z 12 dołkami, po jednej larwie na dołek i dwoma mililitrami podłoża E3.
Włóż płytki do pudełka dla zebra na pięciominutowy okres przyzwyczajenia się do światła. Uruchom oprogramowanie ZebraLab i aktywuj tryb analizy online do śledzenia. Otwórz interfejs wyzwalania światła, następnie wybierz, użyj jednej z trzech poniższych metod wyzwalania i włącz wzmocnione bodźce.
Następnie ustaw metodę startową na moment rozpoczęcia sesji. W harmonogramie przejściowym zdefiniuj rytm ciemnego błysku. Ustaw program na wyzwalanie po 21 sekundach, potem ustaw przejście od jednej do pięciu milisekund przy 100% natężeniu światła.
Przejdź z 2 do 2, 890 milisekund przy 100% natężeniu światła. Przejdź od trzech do pięciu milisekund przy natężeniu światła 0%, a od czterech do 100 milisekund przy 0% natężenia światła. Zaznacz pole powtarzania listy przejść, aby zapewnić okresowe miganie, a następnie rozpocznij protokół.
Do testu wyzwania w ciemnym świetle przełóż larwy danio pręgowanego na dwie płytki z 24 dołkami, po jednej larwie na dołek i jednym mililitrem E3 medium. Po pięciominutowej aklimatyzacji w skrzynce włącz tryb analizy śledzenia online. Następnie skonfigurować program oświetlenia na sześć minut stałego światła, a potem cztery minuty całkowitej ciemności.
W dziesiątej minucie zatrzymaj rejestrowanie zachowań i zapisz dane. Ostrożnie wyjmij talerz z pudełka zebra. Po każdym eksperymencie behawioralnym spryskać i wytrzywać wszystkie powierzchnie kontaktowane z MPTP świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu.
Zbieraj ciekłe i stałe odpady zawierające MPTP i wyraźnie oznaczaj je jako niebezpieczne odpady neurotoksyczne. Wszystkie zanieczyszczone materiały należy traktować świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu. Larwy danio pokrytego traktowanym wykazały zaburzenia snu i aktywności czuwaniowej w porównaniu do grupy typu dzikiego.
Całkowity czas snu również został istotnie wydłużony w grupie leczonej. Liczba wysypianych noc została istotnie zmniejszona w grupie leczonej, podczas gdy średnia długość spania wzrosła. Aktywność czuwaniowa i średnia aktywność były istotnie upośledzone w grupie leczonej.
Pod stałym światłem wskaźnik zamrożenia grupy objętej zabiegiem został znacząco zwiększony. Znacząco wzrastała także pod wpływem stymulacji światłem stroboskopowym o częstotliwości 10 herców. Krzywe odpowiedzi motorycznej w fotografii wykazały zmniejszoną reaktywność w grupie leczonej.
Wyniki śledzenia wskazywały na zmniejszone zachowania lokomotoryczne i eksploracyjne w grupie leczonej. Całkowite pływanie i średnia prędkość pływania również zostały istotnie obniżone w grupie leczonej. Stosunek czasu zamrożenia był istotnie wyższy w grupie leczonej, ale współczynnik szybkiego ruchu był istotnie niższy.
Naprzemienne przejścia światła i ciemności powodowały wyraźne szczyty prędkości u larw typu dzikiego. Dystans przepłynięcia po stymulacji oraz maksymalna prędkość po stymulacji były istotnie zmniejszone w grupie leczonej. Opóźnienie do momentu szczytowej prędkości ruchu również było istotnie opóźnione w grupie leczonej.
Kluczowym wyzwaniem jest minimalizacja wewnętrznych determinantów przy jednoczesnym uwzględnieniu indywidualnej zmienności, aby zapewnić dokładną i powtarzalną analizę zachowań na poziomie danio danio. Klasteryzacja behawioralna i profilowanie fenomenologiczne mogą być stosowane, aby odkryć subtelne neurotoksyczne efekty i uzyskać głębsze wglądy magnetyczne. Przyszłe badania mogą zastosować tę platformę do testów leków zatwierdzonych dla zagrożeń oraz oceny farmakologicznej w modelach choroby Parkinsona.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy, multiparametryczny protokół fenotypowania behawioralnego służący do oceny fenotypów parkinsonowskich, zarówno motorycznych, jak i niemotorycznych, u larw zebrafish w modelach indukowanych MPTP. Dzięki integracji sześciu komplementarnych testów behawioralnych, protokół ten umożliwia wysokoprzepustową, szczegółową analizę objawów przypominających chorobę Parkinsona (PD), obejmując szersze spektrum dysfunkcji niż tradycyjne testy lokomocyjne. Podejście to zwiększa relewancję translacyjną w badaniach nad PD, przesiewaniu leków oraz badaniach nad neurotoksycznością środowiskową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fenotypowanie behawioralne
- Modelowanie choroby Parkinsona
- Toksykologia
Wstęp
- Larwy danio pręgowanego są coraz częściej wykorzystywane jako modele PD ze względu na łatwość manipulacji genetycznych i przydatność do badań wysokoprzepustowych.
- Większość istniejących protokołów koncentruje się na podstawowych testach lokomocyjnych lub przejściach światło-ciemność, które nie oddają pełnego zakresu dysfunkcji związanych z PD.
- PD objawia się zarówno symptomami motorycznymi (np. bradykinezą), jak i niemotorycznymi (np. lękiem, zaburzeniami snu).
- Istnieje potrzeba opracowania zintegrowanych zestawów testów behawioralnych, aby lepiej modelować złożoność ludzkiego PD u danio pręgowanego.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja multiparametrycznego protokołu behawioralnego do profilowania fenotypów motorycznych i niemotorycznych PD u larw zebrafish.
- Wykrycie wcześniej niezidentyfikowanych zmian przypominających PD, w tym objawów niemotorycznych.
- Zapewnienie solidnej platformy do przesiewania leków i oceny neurotoksyczności środowiskowej w modelach PD.
Zastosowane metody
- Hodowla i selekcja zdrowych embrionów oraz larw danio pręgowanego.
- Ekspozycja larw na 50 µM MPTP od 1. do 5. dnia po zapłodnieniu (dpf).
- Oceny behawioralne od 4. do 6. dpf z wykorzystaniem sześciu testów: aktywności lokomocyjnej, tygmotaksji, reakcji na bodziec gwałtowny, próby światło-ciemność, odpowiedzi fotomotorycznej (w tym na światło stroboskopowe) oraz regulacji cyklu sen-czuwanie.
- Zautomatyzowane śledzenie wideo o wysokiej rozdzielczości i kwantyfikacja wielu punktów końcowych behawioralnych w każdym teście.
Główne wyniki
- Larwy traktowane MPTP wykazywały zaburzenia aktywności w cyklu sen-czuwanie, wydłużony całkowity czas snu oraz zmienioną architekturę snu.
- W grupach traktowanych zaobserwowano istotne zmniejszenie aktywności lokomotorycznej i eksploracyjnej, spadek prędkości pływania oraz zwiększoną tendencję do zamierania (freezing).
- Wykryto upośledzenie reakcji sensoromotorycznych i odruchowych, w tym opóźnione i osłabione reakcje na bodźce alarmowe oraz reakcje fotomotoryczne.
- Zidentyfikowano objawy pozaruchowe, takie jak zachowania przypominające lęk oraz upośledzone uczenie się przez habituację, co odzwierciedla wczesną patologię PD.
Wnioski
- Protokół multiparametryczny umożliwia kompleksowe profilowanie fenotypów ruchowych i niemotorycznych PD u larw zebrafish.
- Podejście to ujawnia subtelne i wczesne zmiany przypominające PD, których nie wykazują tradycyjne testy.
- Protokół wspiera zaawansowany screening leków oraz ocenę ryzyka środowiskowego, zwiększając wartość translacyjną modeli PD u zebrafish.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kompleksowe profilowanie fenotypowe w modelach danio pręgowanego indukowanych MPTP odpowiada na zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe systemy o znaczeniu translacyjnym, służące do badania fenotypów parkinsonowskich, zarówno motorycznych, jak i niemotorycznych. Ta multiparametryczna platforma behawioralna zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wczesnej walidacji celów terapeutycznych i wspiera rzetelną przedkliniczną selekcję potencjalnych leków. Dzięki uchwyceniu szerszego spektrum dysfunkcji istotnych dla przebiegu choroby, umożliwia ona podejmowanie bardziej świadomych decyzji dotyczących portfolio oraz optymalizację ryzyka w procesie odkrywania leków na schorzenia neurodegeneracyjne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w odniesieniu do motorowych i niemotorowych fenotypów PD.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez ujawnianie subtelnych zmian neurobehawioralnych, których nie wykrywają podejścia oparte na pojedynczym teście.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie angażowania celu i walidacji funkcjonalnej w modelach genetycznie podatnych.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczenie wielowymiarowych punktów końcowych fenotypowych dla wczesnych decyzji go/no-go.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, multiparametryczne systemy behawioralne do dalszych etapów przepływu pracy w badaniach przesiewowych związków.
- Standaryzuje warunki testów i ilościowe punkty końcowe w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności wyników między badaniami.
- Umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe badania przesiewowe kandydatów na leki oraz modulatorów środowiskowych w modelach PD.
- Zapewnia solidne, zautomatyzowane odczyty wspierające wiarygodną ocenę związków i ograniczanie ryzyka w analizie mechanistycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zestawia fenotypy behawioralne danio pręgowanego z symptomatyką PD u ludzi w celu zwiększenia relewantności translacyjnej.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez rejestrację punktów końcowych ruchowych i nieruchowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o kompleksowe dane fenotypowe.
- Ułatwia identyfikację translacyjnych biomarkerów do późniejszej walidacji w modelach ssaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten multiparametryczny protokół behawioralny integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną w potokach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację różnorodnych punktów końcowych zachowania w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów do wysokoprzepustowej oceny związków z wykorzystaniem zautomatyzowanego śledzenia wideo i ustandaryzowanych protokołów.
- Analityka: Dostarcza ilościowych, multiparametrycznych pomiarów behawioralnych, umożliwiając obiektywne porównanie warunków eksperymentalnych i potencjalnych interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy etapy odkrywcze z przedklinicznymi poprzez modelowanie objawów ruchowych i niemotorycznych PD istotnych dla choroby u ludzi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną, skalowalną platformę do ciągłego przesiewania leków i badań nad neurotoksycznością środowiskową w badaniach nad neurodegeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w chorobie Parkinsona.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność przepływów pracy w fenotypowaniu behawioralnym.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepiej uzasadnionych decyzji typu go/no-go oraz efektywniejsze zarządzanie kapitałem w portfelu projektów odkrywania leków na choroby neurodegeneracyjne.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydackich terapii w oparciu o wielowymiarowe dane fenotypowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli danio pręgowanych, neuronauce behawioralnej oraz zautomatyzowanej analityce śledzenia wideo.
- Wymaga dostępu do instrumentacji do śledzenia o wysokiej rozdzielczości oraz solidnej infrastruktury analizy danych.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów testowych oraz kryteriów interpretacji danych.
- Może wymagać adaptacji do zastosowania w innych modelach chorobowych lub z alternatywnymi neurotoksynami.
- Staranna kontrola determinantów wewnętrznych oraz zmienności osobniczej jest niezbędna dla powtarzalnej analizy behawioralnej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Zebrafish Embryo Preparation for Behavioral Assessment
1:44
Sleep‑Wake Behavioral Analysis of Zebrafish Larvae Using Zebrabox System
3:39
Assessment of Photomotor Response
4:35
Assessment of Thigmotaxis
5:23
Evaluation of Locomotor Activity
5:52
Startle Response Test
7:18
Light‑Dark Challenge Assay
8:24
Results
9:54
Conclusion
