Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji płynu mózgowo-rdzeniowego do wykrywania patogenów ośrodkowego układu nerwowego

Jest to protokół oparty na badaniach do sekwencjonowania metagenomicznej nowej generacji próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, umożliwiający wykrywanie potencjalnych patogenów w próbce. Istniejące protokoły MNGS nie uwzględniają niskiej wydajności RNA w CSF. Protokół ten optymalizuje kilka kroków, aby uwzględnić niską biomasę w tych próbkach.

Aby rozpocząć rozmrażanie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego na lodzie, należy przenieść 100 mikrolitrów do jednego mililitra każdej próbki do probówki o pojemności 1,5 mililitra i wirować w 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odpipetuj supernatant, pozostawiając granulkę i 100 mikrolitrów supernatantu. Dodaj 100 mikrolitrów osłony RNA DNA do pozostałych 100 mikrolitrów supernatantu i pelletu i dokładnie wymieszaj.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu lizy RNA DNA i mieszaj przez pipetowanie, aż roztwór stanie się jednorodny. Wykonaj protokół ekstrakcji DNA i RNA zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi istotnymi modyfikacjami. Wszystkie etapy wirowania wykonuj przez jedną minutę z maksymalną prędkością, z wyjątkiem ostatniego płukania RNA, które powinno być wirowane przez trzy minuty.

Aby eluować próbkę, należy dodać 22 mikrolitry wody wolnej od nukleazy bezpośrednio na matrycę kolumny. Następnie inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po pipecie Elluciana przepływ z powrotem na matrycę kolumny, ponownie wiruj przez minutę z maksymalną prędkością, po czym przekażę do nowej probówki magazynowej o pojemności 1,5 mililitra.

Pipetować składniki potrzebne do fragmentacji i przyprawy RNA do rurki PCR. Inkubuj tubkę w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 stopni Celsjusza. Pipette miesza fragmentowane i zanieczyszczone RNA z ośmioma mikrolitrami wody wolnej od nukleazy oraz dwoma mikrolitrami mieszanki enzymów do syntezy pierwszej nici.

Inkubuj tubkę w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj pierwszą zsyntetyzowaną nić DNA z 48 mikrolitrami wody wolnej od nukleazy. Osiem mikrolitrów buforu reakcji syntezy drugiej nici oraz cztery mikrolitry mieszanki enzymów do syntezy drugiej nici.

Włóż tubkę do termocyklera i inkubuj przez godzinę w temperaturze 16 stopni Celsjusza z zamkniętą podgrzewaną pokrywką. Następnie wykonaj magnetyczne oczyszczanie kulek z użyciem 1,8-krotnego stosunku odwracalnych magnetycznych kulek unieruchomionych w fazie stałej. Eluluj próbkę do 53 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy.

Przelej 50 mikrolitrów ostatniego supernatantu zawierającego oczyszczone dwuniciowe CDNA do czystej rurki PCR wolnej od nukleazy. W tym momencie próbki można zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Jeśli próbka była przechowywana w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc, rozmrozić ją na lodzie przed ponownym rozpoczęciem.

Pipeta wymiesza 50 mikrolitrów oczyszczonego dwuniciowego CDNA z siedmioma mikrolitrami buforu reakcji końcowego przygotowania oraz trzema mikrolitrami mieszanki enzymów końcowych. Umieść próbki w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut oraz 65 stopni Celsjusza przez 30 minut, z zamkniętą podgrzewaną pokrywką. Następnie wykonaj krok ligacji adaptera na lodzie, najpierw tworząc rozcieńczenie adaptera o stężeniu 1:100 w wodzie wolnej od nukleazy.

Pipetować mieszaninę reakcji końcowej przygotowania do rurki zawierającej 30 mikrolitrów mieszanki głównej ligacji, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i 2,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera. Umieść próbki w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut z zamkniętą podgrzewaną pokrywką. Następnie natychmiast przejść do magnetycznego oczyszczania kulek z użyciem 0,9-krotnego stosunku odwracalnych magnetycznych kulek unieruchomionych w fazie stałej.

Następnie eluuj do 17 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy. Przelej 15 mikrolitrów ostatniego supernatantu do czystej rurki PCR wolnej od nukleazy. Teraz adapter oczyszczony pipetą ligował CDNA do rurki z trzema mikrolitrami enzymu użytkownika, 25 mikrolitrami mieszanki Q pięć głównych oraz 10 mikrolitrami unikalnych zapalników z kodami kreskowymi.

Włóż tubę do termocyklera z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 stopni Celsjusza i inkubuj w zadanych warunkach. Wykonaj końcowe oczyszczenie kulek magnetycznych, używając 0,8-krotnego stosunku kulek magnetycznych. Następnie eluuj próbkę do 23 mikrolitrów wody wolnej od nukleazy.

Przelej 20 mikrolitrów ostatniego supernatantu do czystej rurki PCR wolnej od nukleazy. Ilościowo określ stężenie bibliotek próbek za pomocą zestawu do ilościowania DNA oraz odpowiadającego fluorimetru. Sprawdź, czy kontrola wody ma znacznie niższe lub niemierzalne stężenia w porównaniu z innymi próbkami.

Oceń rozmiar biblioteki próbek, uruchamiając je na zautomatyzowanej maszynie do elektroforezy kapilarnej. Wykorzystaj otwartoźródłową platformę internetową Chan Zuckerberg ID, aby przeprowadzić analizy metagenomowe w celu wykrywania patogenów. Zaloguj się na Chan Zuckerberg ID i kliknij upload.

Wybierz metagenomikę jako typ analizy i wybierz wejściowe pliki FASTQ z uruchomienia sekwencjonowania. Wprowadź wymagane informacje o próbce, w tym nazwę próbki, typ próbki CSF oraz typ nukleotydu, RNA lub DNA. Po zakończeniu przetwarzania kliknij folder projektu zawierający próbki i przejdź do pulpitu podsumowań.

Przewiń w dół, aby sprawdzić liczbę odczytów na próbkę. Przeanalizuj procent odczytów przechodzących przez filtrowanie kontroli jakości oraz duplikatowy współczynnik kompresji, aby ocenić przewyższenie amplifikacji PCR z uprzedzeniem. Aby określić wszelkie obce zanieczyszczenia DNA w folderze projektu, wybierz każdą próbkę kontroli wody i kliknij model tła, aby wygenerować model.

Podczas analizy zastosuj model i użyj filtrów progowych, aby ustalić wynik NTZ wyższy niż jeden, aby usunąć prawdopodobne zanieczyszczenia. Następnie przeanalizuj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Dane z elektroforezy kapilarnej i elektroferograficznej wykazały bibliotekę próbek CDNA nadmiernie fragmentowaną i zawierającą dimery adapterów nieprzeznaczone do sekwencjonowania.

Biblioteka CDNA bez poważnych zanieczyszczeń dimerów z adaptera była gotowa do łączenia i sekwencjonowania. Sekwencjonowanie metagenomiczne rdzenia mózgowo-rdzeniowego wykryło różnorodne patogeny w kohorcie A i B, przy czym co najmniej jeden patogen był w 73,5% próbek kohorty A oraz 51,2% próbek kohorty B. Kluczowym wyzwaniem jest precyzyjne pipetowanie ze względu na niskie ilości oraz czasowo zależne suszenie typu B, gdzie niedosuszenie lub nadmierne wysychanie może wpłynąć na efekty.

Chociaż ten konkretny protokół koncentruje się na wykrywaniu patogenów, transkrypcje RNA gospodarza generowane przez ten protokół mogą być wykorzystywane do dalszych analiz. Dlatego ważne jest, aby przyszłe badania porównywały wyniki tego konkretnego protokołu przygotowania i sekwencjonowania biblioteki z nowymi metodami zaprojektowanymi także dla próbek rzadkich, aby zobaczyć, jak się to sprawdza nie tylko pod kątem wykrywania patogenów, ale także analiz transkryptomicznych.