Ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkiego łańcucha z kału myszy za pomocą dwufazowej metody kwasowo-rozpuszczalnikowej
17 lipca 2026
Ten protokół opisuje dwufazowy metod ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej do izolowania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych z próbek kału myszy o niskiej mocy bez pochodnych.
Ten protokół umożliwia ekstrakcję kwasów krótkołańcuchowych lub SCFA z małych próbek kałowych myszy do rutynowej analizy opartej na chromatografii gazowej. SCFA, w tym octan, propionian i masło, są produkowane przez mikroflorę jelitową poprzez fermentację błonnika pokarmowego. Są one szeroko badane, ponieważ są związane z zachowaniami, metabolizmem i fizjologicznymi fenotypami.
Jednak ilościowa analiza SCFA w próbkach kałowych nadal stanowi wyzwanie. Metabolity te są lotne, często występują w niskich poziomach i są mierzone w złożonych macierzach biologicznych. W badaniach na myszach ilość materiału kałowego zebranego od każdego zwierzęcia jest również często ograniczona.
Standardowe metody mogą wymagać pochodzenia, stosunkowo dużych objętości próbek lub specjalistycznego sprzętu. Tutaj przedstawiono dwufazowy proces ekstrakcji rozpuszczalnikami kwasowymi za pomocą rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu do ekstrakcji SCFA z małych próbek kałowych myszy w formacie zgodnym z rutynową analizą GC. Zaczynamy więc od odpowiedniego układu, aby kontynuować resztę naszego protokołu.
Następnie mamy pudełko próbek z zamarzonymi próbkami kałowymi poprawnie oznakowanych. Następnie ustawiamy naszą pipetę 1000 mikrolitrową na 255. Teraz mamy naszą oznakowaną rozcieńczaną HCl.
Kontynuujemy alokację HCl do każdej z naszych próbek. Teraz wkładamy etanol do naszego otworu do czyszczenia na nasze szczypce. Teraz używamy tego samego etanolu do stworzenia kąpieli dla naszych tłuczków.
Teraz chwytamy nasze próbki kałowe i wkładamy je do probówek wirówkowych. Teraz używamy czystych tłuczków, aby zmielić każdą próbkę kałową wewnątrz ich odpowiednich probówek wirówkowych. Bierzemy nasze próbki i stosujemy je do wirowania przez co najmniej 10 sekund lub do całkowitego wymieszania.
Przenosimy wymieszane próbki do wirówki i ustawiamy. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio zbalansowana. Ustaw wirówkę na 16 000 razy g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po upływie 10 minut, usuń próbki z wirówki. Oznakuj ponownie nowe probówki wirówkowe odpowiadające twoim próbkom. Ustaw swoją pipetę 200 mikrolitrową na 120.
Ostrożnie usuń nadstan, upewniając się, że nie dotykasz pelletu. Przenieś nadstan do odpowiednich nowych probówek. Możesz wyrzucić pellet.
Dodaj równą ilość octanu etylu do nowych probówek. Przynieś te próbki z powrotem do wirówki. Ustaw wirówkę na 2 374 razy g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po upływie 20 minut, usuń swoje próbki. Oznakuj ponownie nowe probówki wirówkowe odpowiadające twoim próbkom. Ustaw swoją pipetę z powrotem na 120 mikrolitrów.
Uważaj, aby nie dotykać dolnej warstwy, usuwając tylko górną warstwę. Przenieś nadstan do nowo poprawnie oznaczonych probówek. Przenieś te próbki do pudełka próbek na przechowywanie do dalszej analizy.
Na koniec umieść pudełko próbek w mroźniku o temperaturze -80 stopni Celsjusza. Wyciągnięte alikwoty SCFA, po 120 mikrolitrów każda, były przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza przed ilościową analizą za pomocą chromatografii gazowej. Analiza ilościowa zidentyfikowała osiem SCFA, w tym kluczowe metabolity: kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy, jak pokazano na rysunku.
Aby zweryfikować izolację SCFA, dane z chromatografii gazowej zostały przeanalizowane poprzez testy odzysku i powtarzalności. Odzysku dokonano poprzez dodanie do kontrolnych próbek znanych stężeń standardu wewnętrznego, podczas gdy powtarzalność została zweryfikowana poprzez wielokrotne analizy w ciągu dnia i między dniami. Podsumowując, ten protokół zapewnia proces ekstrakcji SCFA z małych próbek kałowych myszy.
Nie wymaga pochodzenia i jest zgodny z rutynową analizą opartą na GC. Ta metoda może wspierać pomiar SCFA w kale w różnych modelach mysich.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół ekstrakcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) z próbek kału myszy o niskiej zawartości materiału, z wykorzystaniem dwufazowej metody ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej. Podejście to zostało zoptymalizowane dla małych objętości próbek i jest kompatybilne ze standardowym wyposażeniem laboratoryjnym, co umożliwia efektywne przygotowanie próbek do analizy za pomocą chromatografii gazowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia analityczna
- Metabolomika
- Badania nad mikrobiomem
Wprowadzenie
- Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) są ważnymi metabolitami mikrobiologicznymi w jelitach, pełniącymi istotne role biologiczne.
- Dokładne oznaczanie ilościowe SCFA z niewielkich próbek kału stanowi wyzwanie w badaniach na małych zwierzętach.
- Istniejące metody ekstrakcji mogą wymagać pochodnowania lub zastosowania dużych ilości materiału próbnego.
- Istnieje potrzeba opracowania znormalizowanych, wydajnych protokołów kompatybilnych z rutynowymi procesami analitycznymi.
Cel badania
- Opracowanie protokołu ekstrakcji SCFA z pojedynczych próbek kału myszy o masie 20–50 mg.
- Umożliwienie rozdziału faz bez derywatyzacji przy użyciu rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu.
- Zapewnienie zgodności z analizą opartą na chromatografii gazowej.
Zastosowane metody
- Homogenizacja kału
- Zakwaszanie rozcieńczonym kwasem solnym
- Rozdział rozpuszczalnikiem organicznym z użyciem octanu etylu
- Wirowanie w niskiej temperaturze
- Wykorzystanie standardowego sprzętu laboratoryjnego
Główne wyniki
- Pomyślna ekstrakcja głównych SCFA (octanu, propionianu, maślanu) z pojedynczych próbek kału myszy.
- Wyraźna rozdzielczość pików SCFA w charakterystycznych czasach retencji powyżej poziomu szumu tła.
- Protokół jest skuteczny dla próbek o niskiej zawartości materiału i zachowuje kompatybilność ze standardowymi platformami chromatografii gazowej.
Wnioski
- Protokół zapewnia zestandaryzowany schemat ekstrakcji SCFA z ograniczonej ilości materiału kałowego.
- Adresuje on wyzwania proceduralne występujące w badaniach na małych zwierzętach.
- Metoda ta umożliwia wiarygodną analizę SCFA z wykorzystaniem powszechnego wyposażenia laboratoryjnego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znormalizowana ekstrakcja krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) z próbek kału myszy o niskiej zawartości materiału pozwala rozwiązać krytyczny problem wąskiego gardła w badaniach nad odkrywaniem mikrobiomu oraz w przedklinicznej metabolomice. Niniejszy protokół umożliwia wiarygodną kwantyfikację SCFA przy użyciu rutynowej chromatografii gazowej, wspierając badania translacyjne łączące metabolity mikrobioty jelitowej z biologią gospodarza. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć i ułatwia porównywalność wyników między badaniami w ramach portfolio badawczo-rozwojowych przedsiębiorstw.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjny pomiar pochodzących z jelit SCFA na potrzeby badań nad mikrobiomem opartych na sformułowanych hipotezach.
- Wspiera funkcjonalną walidację mikrobiologicznych szlaków metabolicznych w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez dostarczanie ilościowych odczytów poziomu metabolitów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje standaryzowane ekstrakty biologiczne kompatybilne z wysokoprzepustowymi procedurami chromatografii gazowej.
- Poprawia powtarzalność i porównywalność analiz w przypadku przedklinicznych próbek o niskiej zawartości materiału.
- Umożliwia wiarygodny screening interwencji modulujących produkcję SCFA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica ilościowe oznaczanie metabolitów ze strategiami biomarkerów translacyjnych w modelach zwierzęcych (małych zwierząt).
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji ukierunkowanych na mikrobiom.
- Zmniejsza ryzyko zmienności analitycznej w badaniach prowadzonych w wielu ośrodkach i w ramach różnych projektów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół ekstrakcji wpisuje się w continuum od wczesnego etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościową analizę SCFA z ograniczonej ilości materiału biologicznego oraz wspierając późniejsze badania nad biomarkerami i mechanizmami.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia standaryzowany schemat postępowania dla testowania hipotez i analizy szlaków w badaniach nad mikrobiomem.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalne, ilościowe pomiary SCFA, odpowiednie do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Generuje wyraźne piki chromatograficzne do analizy porównawczej warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie przedklinicznych danych o metabolitach do celów związanych z biomarkerami translacyjnymi.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowaną metodę ekstrakcji dla zróżnicowanych badań mikrobiomu i metabolomiki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie relacji między mikrobiomem a metabolitami oraz walidację celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ekstrakcję i analizę w różnych badaniach, poprawiając odtwarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów ukierunkowanych na mikrobiom i zmniejsza ryzyko analityczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów badawczych opartych na mikrobiomie i metabolitach z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w homogenizacji próbek oraz analizie metodą chromatografii gazowej.
- Wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i rutynową infrastrukturę analityczną.
- Wymaga ścisłego przestrzegania zstandaryzowanych protokołów ekstrakcji i analizy przez wszystkie zespoły.
- Metoda jest dostosowana do różnych modeli małych zwierząt oraz ograniczonej ilości materiału wejściowego.
- Wydajność ekstrakcji i granice wykrywalności powinny zostać zwalidowane dla każdego kontekstu eksperymentalnego.
