Name: Ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkołańcuchowych z kału myszy przy użyciu dwuetapowej metody kwas-rozpuszczalnik (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Naucz się ekstrakcji kwasów tłuszczowych krótkołańcuchowych z kału myszy przy użyciu dwuetapowej metody kwas-rozpuszczalnik. Protokół nie wymaga derywatyzacji i jest kompatybilny z rutynową analizą chromatograficzną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z poważaniem przyjmujemy wsparcie finansowe dla tego badania udzielone przez Narodowe Instytuty Zdrowia poprzez R21AG065606 i R21AG08176 przyznane Yiying Zhang, a także wsparcie z Borten Family Foundation i darowizny rodziny Tang dla Yiying Zhang.

Komisja Stała ds. Zwierząt w Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, USA, zatwierdziła poprzedni protokół dotyczący zwierząt, który został zaprojektowany w celu zminimalizowania liczby użytych zwierząt. Protokół ten przestrzega wytycznych i regulacji National Institutes of Health. Niniejszy rękopis został sporządzony zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1, a wymagane materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70082/70082fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70082/70082fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.</a>
1. Pobieranie i przygotowanie próbek kału
<ol>
	<li>Zbierz świeże próbki kału (ok. 30 mg) w osobnych 1,5 mL probówkach mikrowirówkowych. Zarejestruj dokładną masę kału dla każdej próbki, aby umożliwić dokładną normalizację stężeń SCFA. 
	UWAGA: Upewnij się, że pobieranie obejmuje czyste probówki, rękawiczki i szczypce dla każdej próbki. Całe szkło i instrumenty muszą być przed użyciem autoklawowane. Ten protokół został zweryfikowany dla mas kału w wysokości około 20–50 mg na próbkę, przy czym jako reprezentatywną masę wejściową stosuje się ~30 mg. Objętości ekstrakcji są utrzymywane na stałym poziomie w tym zakresie.</li>
	<li>Umieść i oznaczyć wymagany liczby probówek wirówkowych odpowiadających próbkom.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczoną kwas solny (0,5 M; pH 1–2), powoli dodając stężony HCl (12 M, klasy ACS) do ultraczystej wody. 
	​UWAGA: HCl jest żrący; może powodować poważne oparzenia skóry, oczu i dróg oddechowych. Niebezpieczne przy wdychaniu.</li>
	<li>Roztapiaj próbki w temperaturze pokojowej przez 30–45 min, lub aż całkowicie się rozmrozią.</li>
</ol>
2. Homogenizacja i zakwaszenie próbek
<ol>
	<li>Dodaj 255 μL 0,5 M roztworu HCl do każdej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Weź nową probówkę i napełnij ją 70% etanolem do czyszczenia szczypiec. Wyczyść szczypce, zanurzając je w etanolu, a następnie osuszując na czystym ręczniku papierowym. 
	UWAGA: Etanolol jest łatwopalny i może podrażniać skórę i oczy; wdychanie par może powodować zawroty głowy.</li>
	<li>Ustaw kąpiel etanową dla tłuczka, umieszczając tłuczki w pojemniku i wypełniając pojemnik 70% etanolem, aż wszystkie tłuczki będą całkowicie zanurzone.</li>
	<li>Pobierz odpowiednią próbkę z pudełka z próbkami. Zdejmij pokrywkę z probówki i usuń jedną próbkę (~ 30 mg) kału.</li>
	<li>Umieść próbki kału do odpowiednich probówek wirówkowych.</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki zostaną umieszczone we właściwych probówkach wirówkowych, usuń tłuczek z kąpieli etanolu. Osusz tłuczek na czystym ręczniku papierowym. 
	​UWAGA: Użyj nowego tłuczka dla każdej próbki.</li>
	<li>Użyj tłuczków, aby odpowiednio rozdrobić i rozpuścić próbki kału, patrz Rysunek 2. Zmiel próbkę kału, aż uzyskany zostanie wizualnie jednorodny zawiesina, bez widocznych stałych fragmentów.</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70082/70082fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Zmiel próbki kału za pomocą tłuczka. Świeżo zebrany kał jest mielony, aby uzyskać jednolitą konsystencję do analizy SCFA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70082/70082fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.</a>
<ol start="8">
	<li>Umieść użyte tłuczki w pustym pudełku, aby później je umyć.</li>
	<li>Wiruj próbki za pomocą mieszadła wirującego typu impulsowego z maksymalną prędkością przez 10 s, z ciasno zamkniętymi probówkami. 
	UWAGA: Upewnij się, że probówki wirówkowe są ciasno zakryte, aby uniknąć rozlania mieszanki.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja SCFA i separacja faz
<ol>
	<li>Wiruj próbki z prędkością 16 000 × g przez 10 min w 4 °C, upewniając się odpowiedniego zrównoważenia wirówki.</li>
	<li>Po uruchomieniu wirówki oznaczyć nowe probówki wirówkowe odpowiadające próbkom. Usuń próbki z wirówki po zakończeniu wirowania.</li>
	<li>Ustaw pipetę 200 μL na 120 μL. Ostrożnie pobierz 120 μL wodnego nadstanu po wirowaniu, unikając zakłócenia osiadłego dna. Przenieś nadstan do nowo oznaczonych probówek wirówkowych i wyrzuć osad.</li>
	<li>Dodaj równą ilość

<ol><li>Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dietary+fiber+to+host+physiology%3A+short-chain+fatty+acids+as+key+bacterial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites.</a> Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Alzheimer%27s+disease-associated+microbiota+dysbiosis+and+its+impact+on+cognitive+function%3A+evidence+from+mice+and+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients.</a> Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PYY-mediated+appetite+control+and+obesity+alleviation+through+short-chain+fatty+acid-driven+gut-brain+axis+modulation+by+Lacticaseibacillus+rhamnosus+HF01+isolated+from+Qula%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula.</a> J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+and+their+association+with+signalling+pathways+in+inflammation%2C+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism.</a> Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).</li>
<li>Fock, E., Parnova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+blood-brain+barrier+protection+by+microbiota-derived+short-chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids.</a> Cells. 12 (4), 657(2023).</li>
<li>Kachoueiyan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate%3A+a+key+mediator+of+gut-brain+communication+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Brain+Dis%22%5BJournal%5D)">Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease.</a> Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).</li>
<li>Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+quantify+short-chain+fatty+acids+in+biological+samples+using+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Metabolites. 12 (6), 525(2022).</li>
<li>Ueyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-drying+enables+homogeneous+and+stable+sample+preparation+for+determination+of+fecal+short-chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids.</a> Anal Biochem. 589, 113508(2020).</li>
<li>Papanicolas, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+viability+in+faecal+transplants%3A+which+bacteria+survive%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive.</a> EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+short-chain+fatty+acids+in+human+plasma+and+serum+by+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS.</a> Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).</li>
<li>Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatography+detection+protocol+of+short-chain+fatty+acids+in+mice+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces.</a> Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-derived+lysophosphatidylcholine+alleviates+Alzheimer%27s+disease+pathology+via+suppressing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis.</a> Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).</li>
<li>Li, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+double-stranded+DNA+accumulation+induced+by+DNase+II+deficiency+drives+tau+phosphorylation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration.</a> Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-to-neuron+conversion+by+CRISPR-CasRx+alleviates+symptoms+of+neurological+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice.</a> Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).</li>
<li>Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+short-chain+fatty+acids+in+colonic+contents+and+faeces+of+humans+and+rats+by+acidified+water-extraction+and+direct-injection+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography.</a> Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do zadeklarowania.

Ten protokół zawiera kilka kluczowych kroków, które zapewniają wydajne i powtarzalne ekstrakcję KOK z małych objętościowych próbek kału myszy. Protokół wykorzystuje dwuetapowy system ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej z użyciem określonych objętości rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu, który jest dostosowany do właściwości fizykochemicznych KOK jako niskocząsteczkowych, słabych kwasów organicznych. Zakwaszenie przesuwa KOK w ich protonowaną formę, zmniejszając oddziaływania jonowe z matrycą kału i ułatwiając i...

Ten protokół został opracowany w celu umożliwienia ekstrakcji kwasów tłuszczowych o krótkim łańcuchu (SCFA) z małych próbek kału myszy w formacie zgodnym z rutynową analizą opartą na chromatografii gazowej (GC)–. Kwasy SCFA to lotne organiczne kwasy tłuszczowe z mniej niż sześcioma atomami węgla, głównie kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy, które są produkowane przez mikrobiomę jelitową poprzez fermentację niestrawnych włókien pokarmowych1. Ilościowa ocena tych metabolitów u pojedynczych myszy jest często wymagana w badaniach na małych zwierzętach, gdzie materiał kałowy jest ograniczony, a próbki są powiązane z fenotypami behawioralnymi, metabolicznymi lub fizjologicznymi2,3,4,5,6. Dlatego konieczny jest praktyczny, nisko-inputowy proces ekstrakcji, aby wspierać projekty eksperymentalne, które polegają na pomiarach SCFA na poziomie pojedynczych zwierząt.
Obecne metody analizy SCFA w kale mają kilka ograniczeń metodologicznych. Ilościowa ocena SCFA w próbkach kału jest nadal analitycznie wymagająca ze względu na ich lotność, niską obfitość i złożoność matryc biologicznych7. Standardowe metody często wymagają etapów derywatyzacji, dużych objętości próbek i wyspecjalizowanego sprzętu, takiego jak automatyczne manipulowanie płynami, specjalistyczne platformy do homogenizacji lub kolumny do ekstrakcji fazy stałej8,9,10,11. Te wymagania mogą ograniczać dostępność i skalowalność, szczególnie w badaniach na myszach, gdzie wydalanie kału na jedno zwierzę jest minimalne, a longitudinalne lub specyficzne dla genotypu pobieranie próbek jest powszechne12,13,14. W rezultacie istnieje luka metodologiczna w protokołach, które pozwalają na ekstrakcje SCFA z małych ilości kału bez derywatyzacji, a jednocześnie są zgodne ze standardowymi metodami chromatografii gazowej.
Opisany tutaj protokół wypełnia tę lukę, stosując strategię ekstrakcji dwufazowej kwasowo-rozpuszczalnikowej z użyciem rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu. Proces składa się z homogenizacji kału, zakwaszania, podziału rozpuszczalników organicznych i wirowania w niskiej temperaturze, i jest zaprojektowany do pracy z małymi masami wejściowymi kału. W przeciwieństwie do metod opartych na derywatyzacji, które wymagają dodatkowych etapów modyfikacji chemicznej lub specjalistycznych platform do przygotowania próbek, ten protokół umożliwia bezpośrednią ekstrakcję SCFA w formacie zgodnym z rutynową analizą opartą na GC za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego2.
Ta metoda jest przeznaczona do badań, które wymagają ekstrakcji SCFA z ograniczonych ilości kału mysiego, szczególnie gdy potrzebne są pomiary na poziomie pojedynczych osobników lub gdy dostępność próbek ogranicza projekt eksperymentalny. Jest odpowiednia do analizy GC wspólnych SCFA (C2–C6) w próbkach kału, ale nie jest przeznaczona do zastosowań wymagających wykrywania zależnego od derywatyzacji, ultraśladowej ilościowej oceny poza wrażliwością GC lub oceny systemowych stężeń SCFA.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>75003424</td><td>"Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge"</td></tr><tr><td>Centrifuge vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Microtube Rack</td><td>Millipore Sigma</td><td>HS29025F-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>ThermoFisher</td><td>022912.K2</td><td>HPLC Grade, &ge;99.5%</td></tr><tr><td>Green pestles</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-189-9195</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use</td></tr><tr><td>1000 &mu;L pipette</td><td>USA Scientific</td><td>7110-1000</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L pipette tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>Molecular Biology Grade, 70% solution</td></tr><tr><td>200 &mu;L pipette</td><td>USA Scientific</td><td>7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipette tips</td><td>USA Scientific</td><td>1110-1800</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>ThermoFisher</td><td>046638.KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher scientific</td><td>50-136-7909</td><td>"Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup"</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkiego łańcucha z kału myszy za pomocą dwufazowej metody kwasowo-rozpuszczalnikowej

Extraction of Short-chain Fatty Acids from Mouse Feces Using A Two-phase Acid&#8211;Solvent Method

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji kwasów tłuszczowych krótkołańcuchowych (SCFA) z małych próbek kału myszy przy użyciu strategii ekstrakcji dwuetapowej z kwasem i rozpuszczalnikiem. Metoda jest zaprojektowana dla pojedynczych próbek kału o masie około 20-50 mg i wykorzystuje rozcieńczony kwas chlorowodorowy oraz octan etylu, aby umożliwić separację faz bez konieczności pochodzenia. Protokół składa się z homogenizacji kału, zakwaszenia, podziału na fazę organiczną i niskotemperaturowej wirowania i może być przeprowadzony przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, powszechnie dostępnego w laboratoriach badawczych. Po ekstrakcji SCFA nadają się do dalszej analizy na platformach opartych na chromatografii gazowej. Pomyślne wykonanie protokołu jest wskazane przez wykrycie wyraźnie rozdzielonych szczytów SCFA w charakterystycznych czasach retencji powyżej poziomu szumu, jak pokazano dla głównych SCFA z kału, w tym octanu, propionianu i masła, pochodzących z pojedynczych próbek myszy. Ten protokół rozwiązuje powszechne wyzwanie proceduralne w badaniach na małych zwierzętach, zapewniając standaryzowany proces ekstrakcji SCFA z ograniczonej ilości materiału próbkowego, przy zachowaniu zgodności z rutynowymi przepływami analitycznymi.

Powyższy protokół wynikł w wyekstrahowanych alikwotach SCFA o objętości 120 μL odpowiadającej liczbie próbek kału, z których zostały wyprowadzenie. Pomyślne wykonanie protokołu ekstrakcji jest wskazane przez obecność wyraźnie rozdzielonych szczytów SCFA w charakterystycznych czasach retencji z intensywnością sygnału powyżej poziomu szumów tła. Przy wykonaniu, jak opisano, protokół daje profile SCFA z kału nadające się do porównania ilościowego w dalszej kolejności pomiędzy próbkami. Zmierzyliśmy osiem SCFA: kwas octowy, ...

Ten protokół opisuje dwufazowy metod ekstrakcji kwasowo-rozpuszczalnikowej do izolowania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych z próbek kału myszy o niskiej mocy bez pochodnych.

Ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkiego łańcucha z kału myszy za pomocą dwufazowej metody kwasowo-rozpuszczalnikowej

This article describes a protocol for extracting short-chain fatty acids (SCFAs) from low-input mouse fecal samples using a two-phase acid&#8211;solvent ...

Ten protokół umożliwia ekstrakcję kwasów krótkołańcuchowych lub SCFA z małych próbek kałowych myszy do rutynowej analizy opartej na chromatografii gazowej. SCFA, w tym octan, propionian i masło, są produkowane przez mikroflorę jelitową poprzez fermentację błonnika pokarmowego. Są one szeroko badane, ponieważ są związane z zachowaniami, metabolizmem i fizjologicznymi fenotypami.Jednak ilościowa analiza SCFA w próbkach kałowych nadal stanowi wyzwanie. Metabolity te są lotne, często występują w niskich poziomach i są mierzone w złożonych macierzach biologicznych. W badaniach na myszach ilość materiału kałowego zebranego od każdego zwierzęcia jest również często ograniczona.Standardowe metody mogą wymagać pochodzenia, stosunkowo dużych objętości próbek lub specjalistycznego sprzętu. Tutaj przedstawiono dwufazowy proces ekstrakcji rozpuszczalnikami kwasowymi za pomocą rozcieńczonego kwasu solnego i octanu etylu do ekstrakcji SCFA z małych próbek kałowych myszy w formacie zgodnym z rutynową analizą GC. Zaczynamy więc od odpowiedniego układu, aby kontynuować resztę naszego protokołu.Następnie mamy pudełko próbek z zamarzonymi próbkami kałowymi poprawnie oznakowanych. Następnie ustawiamy naszą pipetę 1000 mikrolitrową na 255. Teraz mamy naszą oznakowaną rozcieńczaną HCl.Kontynuujemy alokację HCl do każdej z naszych próbek. Teraz wkładamy etanol do naszego otworu do czyszczenia na nasze szczypce. Teraz używamy tego samego etanolu do stworzenia kąpieli dla naszych tłuczków.Teraz chwytamy nasze próbki kałowe i wkładamy je do probówek wirówkowych. Teraz używamy czystych tłuczków, aby zmielić każdą próbkę kałową wewnątrz ich odpowiednich probówek wirówkowych. Bierzemy nasze próbki i stosujemy je do wirowania przez co najmniej 10 sekund lub do całkowitego wymieszania.Przenosimy wymieszane próbki do wirówki i ustawiamy. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio zbalansowana. Ustaw wirówkę na 16 000 razy g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Po upływie 10 minut, usuń próbki z wirówki. Oznakuj ponownie nowe probówki wirówkowe odpowiadające twoim próbkom. Ustaw swoją pipetę 200 mikrolitrową na 120.Ostrożnie usuń nadstan, upewniając się, że nie dotykasz pelletu. Przenieś nadstan do odpowiednich nowych probówek. Możesz wyrzucić pellet.Dodaj równą ilość octanu etylu do nowych probówek. Przynieś te próbki z powrotem do wirówki. Ustaw wirówkę na 2 374 razy g przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza.Po upływie 20 minut, usuń swoje próbki. Oznakuj ponownie nowe probówki wirówkowe odpowiadające twoim próbkom. Ustaw swoją pipetę z powrotem na 120 mikrolitrów.Uważaj, aby nie dotykać dolnej warstwy, usuwając tylko górną warstwę. Przenieś nadstan do nowo poprawnie oznaczonych probówek. Przenieś te próbki do pudełka próbek na przechowywanie do dalszej analizy.Na koniec umieść pudełko próbek w mroźniku o temperaturze -80 stopni Celsjusza. Wyciągnięte alikwoty SCFA, po 120 mikrolitrów każda, były przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza przed ilościową analizą za pomocą chromatografii gazowej. Analiza ilościowa zidentyfikowała osiem SCFA, w tym kluczowe metabolity: kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy, jak pokazano na rysunku.Aby zweryfikować izolację SCFA, dane z chromatografii gazowej zostały przeanalizowane poprzez testy odzysku i powtarzalności. Odzysku dokonano poprzez dodanie do kontrolnych próbek znanych stężeń standardu wewnętrznego, podczas gdy powtarzalność została zweryfikowana poprzez wielokrotne analizy w ciągu dnia i między dniami. Podsumowując, ten protokół zapewnia proces ekstrakcji SCFA z małych próbek kałowych myszy.Nie wymaga pochodzenia i jest zgodny z rutynową analizą opartą na GC. Ta metoda może wspierać pomiar SCFA w kale w różnych modelach mysich.

extraction-short-chain-fatty-acids-from-mouse-feces-using-two-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Organoidy kryptowe jelita cienkiego hodowane ex vivo dostarczają system hodowli tkankowej, który podsumowuje wzrost krypt zależny od komórek macierzystych i ich niszy. Opracowaliśmy metodę oznaczania profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w pierwotnych organoidach krypt myszy. Odkryliśmy, że organoidy zachowują właściwości fizjologiczne określone przez ich źródło.

Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Metoda ekstrakcji kofaktora F420 z czystych kultur została zoptymalizowana do separacji metodą chromatografii cieczowej i analizy długości ogona F420 w czystych kulturach i próbkach środowiskowych.

Ekstrakcja kofaktora F420 do analizy długości ogona poliglutaminianu z czystych kultur metanogennych i próbek środowiskowych

System ekstrakcji ciecz-ciecz (LLE) z membranami kapilarnymi został opracowany do ciągłego i selektywnego wydobywania średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych (MCFA) z bulionu fermentacyjnego. System LLE osiąga wysoką specyficzność MCFA z bulionów zawierających krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe i alkohole. Ponadto MCFA są skoncentrowane w roztworze do usuwania powłok, aby ułatwić odzyskiwanie produktu.

Ciągła ekstrakcja ciecz-ciecz średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych z bulionu fermentacyjnego przy użyciu membran z pustych włókien

Naucz się ekstrakcji kwasów tłuszczowych krótkołańcuchowych z kału myszy przy użyciu dwuetapowej metody kwas-rozpuszczalnik. Protokół nie wymaga derywatyzacji i jest kompatybilny z rutynową analizą chromatograficzną.

Ekstrakcja kwasów tłuszczowych krótkiego łańcucha z kału myszy za pomocą dwufazowej metody kwasowo-rozpuszczalnikowej

Przeglądaj więcej filmów