Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników
27 lutego 2026
Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.
To jest standaryzowany protokół do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł. Ten protokół jest przydatny do badania chorób dysfunkcji bariery i testowania leków przywracających barierę w dziąsłach. Na początek należy podzielić samce myszy typu dzikiego C57BL/6J na trzy grupy składające się z grupy kontrolnej niepoddawanej leczeniu, grupy z periodonitą wywołaną ligaturą oraz grupy z periodonitą wywołaną przez Porphyromonas gingivalis.
Wybierz fluorescencyjne znaczniki o nienakładających się widmach, takie jak dekstranu oznaczonego FITC i dekstranu oznaczonego rodaminą B. Aby rozcieńczyć znaczniki, wymieszaj po jednym gramie na litr FD40 i RD70 w żelu 2% karboksymetylocelulozy. Przechowuj przygotowaną mieszaninę na lodzie.
Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez odruch szczypania palca, użyj rozwarcia jamy ustnej, aby utrzymać otwartą jamę ustną znieczulonego mysza. Nałożyć 50 mikrolitrów przygotowanej mieszanki znaczników miejscowo na powierzchnię wargową dziąsła w okolicy trzonowców. Pozostawić mieszaninę na miejscu przez 30 minut i ponownie nałożyć, jeśli została połknięta.
Po 30 minutach stosowania znaczników ułożyć mysz w pozycji leżącej na plecach na kartonie i zabezpieczyć kończyny taśmą, aby unieruchomić zwierzę. Następnie otworzyć jamę ustną eutanalizowanej myszy i odizolować żuchwę górną. Delikatnie oczyścić otaczające tkanki i dokładnie przepłukać próbkę buforem PBS.
Umieścić odizolowaną żuchwę górną na szklanej szlamie. Następnie umieścić glinę modelarską po obu stronach, aby ustabilizować i zabezpieczyć szkielet pokrywy nad próbką. Ostrożnie umieścić żuchwę górną na specjalnie zaprojektowanym uchwycie próbki, aby zapewnić stabilne umiejscowienie do obrazowania.
Używając mikroskopii jednofotonowej pionowej z obiektywem zanurzeniowym wodnym 25X. Skoncentrować się na obszarze podtrzymującym pod żuchwą górną i wykonać zdjęcia. Wybrać obszar zainteresowania na powierzchni policzkowej drugiego trzonowca w żuchwie górnej i niezwłocznie rozpocząć obrazowanie.
Wykonać obrazy Z-stack z wielkością kroku jednego mikrometra, zaczynając od powierzchni dziąsła do głębokości 100 do 200 mikrometrów w celu rekonstrukcji trójwymiarowej. W oprogramowaniu kliknąć plik i wybrać nowy folder, aby utworzyć nowy folder dla zestawu danych i nadać mu opisową nazwę. W zakładce nabycia ustawić format XY na 512 na 512 z rozdzielczością 0,99 mikrometrów na piksel.
Następnie ustawić czynnik zoomu na jeden. Następnie ustawić długości fal wzbudzenia na 488 nanometrów i 561 nanometrów. Skonfigurować okna emisji na 500 do 550 nanometrów i 570 do 620 nanometrów odpowiednio.
W przypadku serii Z i obrazowania trójwymiarowego wybrać tryb akwizycji ND. Ustawić krok Z na jeden mikrometr i dostosować w razie potrzeby. Po skonfigurowaniu parametrów wybrać tryb na żywo, aby wizualizować obszar dziąseł w pojedynczych i połączonych kanałach fluorescencji.
Następnie kliknąć uruchom teraz, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Aby zmierzyć przepuszczalność, oddzielić intensywność fluorescencji FD40 i RD70 na różne kanały. Połączyć warstwy osi Z bez odejmowania tła.
Następnie użyć oprogramowania ImageJ do ilościowej oceny intensywności fluorescencji w celu oceny przepuszczalności bariery nabłonkowej. Kliknij plik i wybierz otwórz, aby otworzyć obraz żuchwy w ImageJ. Następnie naciśnij obraz i zmień typ obrazu na format 8-bitowy dla analizy.
Kliknij analizuj, wybierz ustal pomiary. Następnie zaznacz polecenie obszar, średnia i gęstość zintegrowana oraz kliknij ok, aby potwierdzić. Następnie wybierz żądany kanał i dostosuj próg, klikając obraz, wybierając ustaw i wybierając próg.
Włączyć opcję ciemnego tła, aby uwzględnić czarne tło. Kliknij analizuj i wybierz ustal pomiary. Następnie zaznacz polecenie średnia wartość szarości i ogranicz do progu oraz potwierdź klikając ok.
Używając narzędzia do dowolnego rysowania, ręcznie narysuj kontur obszaru sygnału fluorescencyjnego po stronie tkanki dziąsłowej. Kliknij analizuj i wybierz pomiar, aby uzyskać wartości intensywności fluorescencji, gdzie gęstość zintegrowana reprezentuje intensywność fluorescencji. Skopiuj wyniki pomiarów do arkusza kalkulacyjnego w celu wykonania obliczeń i wykresów.
Oblicz średnią intensywność fluorescencji grupy kontrolnej w arkuszu kalkulacyjnym. Podziel każdą wartość intensywności fluorescencji grupy doświadczalnej przez średnią grupy kontrolnej, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji. W grupie kontrolnej oba znaczniki fluorescencyjne były w dużej mierze ograniczone do powierzchni dziąsła.
W obu grupach leczonych ligaturą i Porphyromonas gingivalis zaobserwowano istotne wycieki zarówno FD40 jak i RD70 do nabłonka dziąsła. Analiza półilościowa wykazała istotne wzrost intensywności fluorescencji zarówno FD40 jak i RD70 w grupach leczonych ligaturą i Porphyromonas gingivalis. Obrazowanie 3D ujawniło bardziej rozległą i rozproszoną dystrybucję fluorescencji znaczników wokół naczyń dziąsłowych w grupach
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Bariera nabłonka dziąsłowego stanowi kluczową pierwszą linię obrony w zakresie odporności i homeostazy jamy ustnej. Nienaruszona bariera nabłonkowa skutecznie zapobiega przenikaniu szkodliwych substancji z środowiska jamy ustnej, natomiast jej uszkodzenie jest ściśle powiązane z patogenezą takich schorzeń, jak zapalenie przyzębia oraz płaskowstr подъpodstępny błony śluzowej jamy ustnej. W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę opartą na aplikacji miejscowej w celu oceny szczelności bariery nabłonka dziąsłowego u myszy. W pierwszej kolejności na powierzchnię dziąsła przedsionkowego w obszarze trzonowców aplikowano miejscowo mieszaninę dekstranów znakowanych fluorescencyjnie o różnych masach cząsteczkowych (40 lub 70 kDa) zawieszoną w 2% karboksymetylocelulozie sodowej. Po 30 min inkubacji szczęka została wypreparowana i unieruchomiona w specjalnym uchwycie do natychmiastowego obrazowania z wykorzystaniem systemu mikroskopii jednofotonowej. Podejście to umożliwia wizualizację i kwantyfikację markerów o różnych rozmiarach w obrębie warstw nabłonka, zapewniając funkcjonalny odczyt szczelności bariery nabłonka dziąsłowego, który można zastosować w badaniach nad stanami zapalnymi jamy ustnej, gojeniem ran oraz modelowaniem chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia jamy ustnej
- Immunologia
- Funkcja bariery nabłonkowej
Wprowadzenie
- Bariera nabłonka dziąseł stanowi kluczową pierwszą linię obrony w obrębie odporności i homeostazy jamy ustnej.
- Nienaruszona bariera nabłonkowa zapobiega przenikaniu szkodliwych substancji z środowiska jamy ustnej.
- Zaburzenie bariery nabłonka dziąseł wiąże się z zapaleniem przyzębia oraz płaskoidalnym liszajem ustnym.
- Funkcjonalna ocena szczelności bariery jest niezbędna do badania stanów zapalnych jamy ustnej, gojenia ran oraz modelowania chorób.
Cel badania
- Opracowanie metody opartej na aplikacji miejscowej do oceny integralności bariery nabłonka dziąsła u myszy.
- Umożliwienie wizualizacji i kwantyfikacji znaczników o różnych masach cząsteczkowych w warstwach nabłonkowych.
- Zapewnienie funkcjonalnego odczytu integralności bariery, który można zastosować w modelach chorób jamy ustnej.
Zastosowane Metody
- Miejscowe zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie dekstranów (40 lub 70 kDa) w 2% roztworze karboksymetylocelulozy sodu na powierzchni dziąsła przedsionkowego.
- 30-minutowy okres inkubacji w celu umożliwienia przenikania znacznika.
- Disekcja i unieruchomienie szczęki w specjalistycznym uchwycie.
- Obrazowanie z wykorzystaniem systemu mikroskopii jednofotonowej.
- Ilościowe określenie przenikania znacznika przez warstwy nabłonka w celu oceny integralności bariery.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia wizualizację i kwantyfikację fluorescencyjnych dekstranów o różnych rozmiarach w warstwach nabłonka dziąseł.
- Przenikanie znacznika pozwala na funkcjonalną ocenę szczelności bariery nabłonka dziąseł.
- Podejście to jest możliwe do zastosowania w badaniach nad stanami zapalnymi jamy ustnej, gojeniem ran oraz modelowaniem chorób.
- Zaburzenie bariery można wykryć poprzez zwiększone przenikanie znacznika.
Wnioski
- Metoda oparta na aplikacji miejscowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych dekstranów umożliwia funkcjonalną ocenę szczelności bariery nabłonka dziąseł u myszy.
- Podejście to stanowi wartościowe narzędzie do badania odporności jamy ustnej, dysfunkcji bariery oraz powiązanych z nimi patologii.
- Metoda ta nadaje się do zastosowań w badaniach nad stanami zapalnymi jamy ustnej, gojeniem ran oraz modelowaniem chorób.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bariera nabłonka dziąsłowego stanowi krytyczną pierwszą linię obrony w odporności jamy ustnej, a jej naruszenie jest powiązane ze stanami zapalnymi chorób jamy ustnej, takimi jak paradontoza. Niniejsza metoda umożliwia funkcjonalny, ilościowy pomiar integralności bariery z wykorzystaniem penetracji znaczników zależnej od ich wielkości, co pozwala na mechanistyczną ocenę ryzyka w modelach chorób jamy ustnej. Wspiera ona walidację celów oraz opracowywanie testów dla terapii ukierunkowanych na odporność śluzówkową i gojenie ran.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących funkcji bariery nabłonkowej w odporności jamy ustnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowy, selektywny względem rozmiaru odczyt przepuszczalności w celu funkcjonalnej walidacji celów zaangażowanych w regulację bariery.
- Wartość prognostyczna: Wspiera wstępną selekcję przedkliniczną poprzez rozróżnienie związków, które zachowują lub przywracają integralność bariery, od tych, które zwiększają jej przepuszczalność.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Dostarcza funkcjonalnego testu do oceny selektywności bariery z wykorzystaniem fluorescencyjnych dekstranów o określonych masach cząsteczkowych (40 lub 70 kDa).
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne ilościowe określenie przenikania znacznika przez warstwy nabłonka w celu przesiewania związków.
- Gotowość testu: Wspiera opracowanie wiarygodnych, ilościowych wyników dla badań przenikania i retencji w błonie śluzowej jamy ustnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy oceny funkcji barierowe na etapie odkryć z przedklinicznymi modelami stanów zapalnych jamy ustnej i gojenia ran.
- Znaczenie chorobowe: Bezpośrednio stosowane w modelowaniu paradontoz oraz płaskiego porostu jamy ustnej, w których zaburzenie bariery jest kluczowym mechanizmem patogenicznym.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podłużne monitorowanie gojenia lub naprawy bariery w odpowiedzi na interwencje terapeutyczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesną ocenę funkcji bariery śluzówkowej przed przejściem do badań skuteczności i bezpieczeństwa w modelach chorób jamy ustnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji bariery nabłonkowej i homeostazy immunologicznej w jamie ustnej.
- Opracowywanie testów: Generuje ilościowe wyniki oparte na obrazowaniu w zakresie przenikania znaczników, co ułatwia analizę relacji struktura-aktywność.
- Analityka: Dostarcza mierzalne dane o przepuszczalności zależnej od wielkości, co pozwala na porównanie warunków testowych i efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Łączy funkcjonalną ocenę bariery z walidacją przedkliniczną w modelach uszkodzenia i regeneracji błony śluzowej jamy ustnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do oceny dostarczania przez błony śluzowe, retencji oraz czynników modulujących barierę w ramach programów B+R dotyczących jamy ustnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w powiązaniach mechanistycznych między funkcją barierową a patologią jamy ustnej.
- Wartość operacyjna: zapewnia zestandaryzowany, kompatybilny z obrazowaniem przepływ pracy z mierzalnymi wynikami dla zespołów interdyscyplinarnych.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając wczesne wykrycie związków, które naruszają lub przywracają integralność bariery dziąsłowej.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację terapii stomatologicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne wyniki bariery.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie obsługi tkanek jamy ustnej, przygotowania znaczników fluorescencyjnych oraz obrazowania za pomocą mikroskopii jednofotonowej.
- Metoda zależy od dostępu do systemów mikroskopowych zdolnych do rozdzielczości obrazowania przenikania znacznika przez warstwy nabłonka.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników niezbędna jest standaryzacja stężenia znacznika, czasu inkubacji oraz fiksacji tkanek.
- Adaptacja do modeli ex vivo lub innych gatunków może wymagać optymalizacji nośnika dostarczającego oraz parametrów inkubacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują żywotność tkanek po sekcji oraz potencjalną zmienność dostępności powierzchni dziąseł.
