Name: Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:35:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników dextranowych. Technika ta umożliwia ilościową analizę przepuszczalności w badaniach zapalenia dziąseł i gojenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach, Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego i zgodne były z Przewodnikiem po Opiece nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Publikacja NIH nr 85-23, zmieniona w 1996 r.). Podczas procesu eksperymentów na zwierzętach traktowano je ostrożnie, aby zminimalizować ich ból i dyskomfort.
Szczegóły każdego kroku pracy w ocenie in vivo przepuszczalności epitelium dziąseł myszy są opisane poniżej (Rysunek 1A). Tutaj przedstawiono przykład wykrywania funkcji bariery nabłonkowej zarówno w ligacyjnych, jak i Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)-indukowanych modelach periodontitis u myszy. Wszystkie personel otrzymały kompleksowe szkolenie w zakresie opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i techniki aseptycznej.
1. Obsługa zwierząt
<ol>
	<li>Przez cały okres badania, przetrzymuj zwierzęta w warunkach standardowych, wolnych od patogenów specyficznych (SPF), z cyklem 12 h światło/ciemność i zapewnij żywność i wodę ad libitum.</li>
	<li>Przygotowanie i podawanie znieczulenia oraz znaczników
	<ol>
		<li>Utrzymuj sterylne warunki przez cały protokół i używaj narzędzi wyczyszczonych 75% alkoholem etylowym.</li>
		<li>Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku dorosłym w grupie wiekowej 8-10 tygodni do eksperymentu. Podziel myszy na trzy grupy: grupę kontrolną (nieleczoną) i dwie grupy eksperymentalne (modele periodontitis u myszy indukowanego ligacją i P. gingivalis). 
		UWAGA: Przy grupach, myszy o podobnej masie ciała i podobnym wieku tygodniowym powinny być wybierane, aby zmniejszyć wpływ wieku i wagi na przepuszczalność epitelium dziąsłowego. Modele periodontitis u myszy indukowane ligacją i P. gingivalis reprezentują powszechnie używane modele periodontitis u myszy. Szczegółowe protokoły modelowania, patrz w literaturze na temat modeli periodontitis u myszy indukowanego ligacją15 i P. gingivalis-indukowanego16.</li>
		<li>Wybierz znaczniki fluorescencyjne o nienachodzących się spektrach, takich jak znacznik FITC-dekstrany (40 kDa; FD40) i znacznik rodaminą B-dekstrany (70 kDa; RD70), aby zapewnić wyraźne wykrywanie sygnału za pomocą odpowiednich filtrów FITC i rodaminy.</li>
		<li>Rozcieńcz znaczniki. Aby przestrzegać tego protokołu, wymieszaj FD40 (1 g/L) i RD70 (1 g/L) w 2% żelu karboksymetylocelulozy i przechowuj w 4 °C.</li>
		<li>Dożylnie wstrzyknij 1,25% tribromoetanolu (200 mg/kg masy ciała, 15-17 μL/g masy ciała) w celu znieczulenia myszy lub znieczulaj zgodnie z zaleceniami wydanymi przez lokalną instytucję. 
		UWAGA: Roztwory tribromoetanolu są światłoczułe. Tert-amyl alkohol jest palnym, lotnym i drażniącym rozpuszczalnikiem organicznym. Wszystkie procedury związane z przygotowaniem, obsługą i podawanie należy przeprowadzać w komorze chemicznej lub na ekstremalnie dobrze wentylowanym obszarze, ściśle z dala od wszelkich źródeł zapłonu. Personel musi nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym rękawice, gogle chemiczne i fartuch laboratoryjny. Usuwanie odpadów: Zużyty roztwór tribromoetanolu, tert-amyl alkohol i wszystkie zanieczyszczone materiały (np. strzykawki, końcówki pipet, rękawice) muszą być zebrane i usunięte jako odpady chemiczne niebezpieczne zgodnie z przepisami i protokołami ds. bezpieczeństwa i higieny pracy (EHS) Twojej instytucji oraz protokołami dotyczącymi palnych i toksycznych chemikaliów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas znieczulenia utrzymuj temperaturę rdzenia ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą podkładki grzewczej z regulacją zwrotną. Nałoż do oczu środek zmniejszający wysychanie rogówki.</li>
	<li>Utrzymaj otwartą jamę ustną za pomocą zacięcia i nanieś 5 μL do 50 μL mieszanki dwóch lub więcej znaczników przepuszczalności parakomórkowej o różnych masach cząsteczkowych na powierzchnię wargową dziąseł w rejonie zębów trzonowych (Rysunek 1B). Pozostaw na 30 minut. Jeśli zwierzę połknęło mieszankę, nałóż ją ponownie.</li>
	<li>Izolacja zębów i tkanek przyzębnych
	<ol>
		<li>Po 30 minutach stosowania znaczników przepuszczalności, wyłącz myszy poprzez ścięcie szyjne. Ułóż myszy na kartonach, umieszczając je w pozycji leżącej na plecach i przyklej ich kończyny.</li>
		<li>Po fiksacji, otwórz jamę ustną, aby odizolować zęby szczękowe i tkanki przyzębne. Delikatnie usuń otaczające tkanki i dokładnie przepłucz próbkę PBS.</li>
		<li>Umieść zęby i tkanki przyzębne na szklanej szlamie, z ułożeniem glinki modelującej po obu stronach, aby ułatwić zamocowanie szkiełka pokrywającego nad próbką.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu jednofotonowego</

<ol><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+protection+of+gingival+epithelial+barrier+by+interleukin-22+through+regulating+microbiota+and+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Kou+Qiang+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Study on the protection of gingival epithelial barrier by interleukin-22 through regulating microbiota and E-cadherin expression.</a> Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 59 (7), 653-662 (2024).</li>
<li>Presland, R. B., Jurevic, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+the+epithelial+barrier%3A+what+molecular+biology+and+genetics+tell+us+about+the+functions+of+oral+mucosal+and+epidermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Educ%22%5BJournal%5D)">Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues.</a> J Dent Educ. 66 (4), 564-574 (2002).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).</li>
<li>Meyle, J., Chapple, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol+2000%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the pathogenesis of periodontitis.</a> Periodontol 2000. 69 (1), 7-17 (2015).</li>
<li>Oriuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+lipopolysaccharide+damages+mucosal+barrier+to+promote+gastritis-associated+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide damages mucosal barrier to promote gastritis-associated carcinogenesis.</a> Dig Dis Sci. 69 (1), 95-111 (2024).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakamura, E., Yamaga, S., Amano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+infection+induces+lipopolysaccharide+and+peptidoglycan+penetration+through+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Health%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis infection induces lipopolysaccharide and peptidoglycan penetration through gingival epithelium.</a> Front Oral Health. 3, 845002(2022).</li>
<li>Abe, T., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+ligature-induced+periodontitis+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice.</a> J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).</li>
<li>Chatterjee, A., Bhattacharya, H., Kandwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Soc+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Probiotics in periodontal health and disease.</a> J Indian Soc Periodontol. 15 (1), 23-28 (2011).</li>
<li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon-efficient+imaging+with+a+single-photon+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Photon-efficient imaging with a single-photon camera.</a> Nat Commun. 7, 12046(2016).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+endothelial+tight+junctions+to+predict+and+protect+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Targeting endothelial tight junctions to predict and protect thoracic aortic aneurysm and dissection.</a> Eur Heart J. 44 (14), 1248-1261 (2023).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxf1+maintains+endothelial+barrier+function+and+prevents+edema+after+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Foxf1 maintains endothelial barrier function and prevents edema after lung injury.</a> Sci Signal. 9 (424), ra40(2016).</li>
<li>Hou, A., Mohamed Ali, S., Png, E., Hunziker, W., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase-2+is+critical+for+corneal+epithelial+barrier+function+via+positive+regulation+of+claudin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase-2 is critical for corneal epithelial barrier function via positive regulation of claudin-1.</a> Ocul Surf. 28, 155-164 (2023).</li>
<li>Kitsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+junctional+epithelial+permeability+in+trpv4-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced junctional epithelial permeability in trpv4-deficient mice.</a> J Periodontal Res. 55 (1), 51-60 (2020).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+impairs+oral+epithelial+barrier+through+targeting+grhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis impairs oral epithelial barrier through targeting grhl2.</a> J Dent Res. 98 (10), 1150-1158 (2019).</li>
<li>Lemaitre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+regeneration+using+syngeneic+adipose-derived+stromal+cells+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue regeneration using syngeneic adipose-derived stromal cells in a mouse model.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (2), 656-665 (2017).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gingival+epithelial+barrier%3A+regulation+by+beneficial+and+harmful+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Gingival epithelial barrier: regulation by beneficial and harmful microbes.</a> Tissue Barriers. 7 (3), e1651158(2019).</li>
<li>Ye, P., Chapple, C. C., Kumar, R. K., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+E-cadherin%2C+involucrin%2C+and+connexin+gap+junction+proteins+in+the+lining+epithelia+of+inflamed+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of E-cadherin, involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva.</a> J Pathol. 192 (1), 58-66 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów.

Nabłonek dziąseł pełni funkcję istotnej fizycznej bariery przed inwazją bakterii, podczas gdy mikroorganizmy jamy ustnej wykazują podwójną zdolność regulacyjną poprzez albo zakłócanie integralności bariery za pomocą czynników wirulencji albo promocję jej utrzymania. Te interakcje biologiczne ostatecznie decydują o homeostazie tkanki lub postępie choroby17,18. Budując na tej podstawie, opracowałeśmy innowacyjne podejście metodologiczne w celu dalszego zbadania tyc...

Bariera nabłonkowa dziąseł stanowi krytyczną obronną powierzchnię w jamie ustnej, zachowując integralność tkanki poprzez selektywne regulowanie transportu substancji, jednocześnie zapobiegając inwazji mikroorganizmów1. Składająca się z wielowarstwowego nabłonka łuszczącego się, połączonego zespołami szczelnych złączy, ta dynamiczna struktura precyzyjnie kontroluje przepuszczalność międzykomórkową, aby ograniczyć niewybiórcze przenikanie mikroorganizmów, makrocząsteczek i rozpuszczalników2. Wiele czynników może osłabić integralność bariery dziąsłowej. Jama ustna mieści drugą pod względem różnorodności społeczność mikrobiologiczną w ludzkim ciele, z ponad 700 gatunkami bakterii kolonizujących powierzchnie zębów, szczeliny dziąsłowe i błonę śluzową jamy ustnej3,4. Komórki nabłonkowe wyściełające tkanki dziąsłowe są stale narażone na to gęste środowisko mikrobiologiczne5.
Czynniki wirulencji wydzielane przez patogeny przyzębia (np. Porphyromonas gingivalis), w tym lipopolisacharydy, wykazują zdolność do zakłócania funkcji bariery nabłonkowej, wywołując w ten sposób reakcje zapalne w tkankach dziąseł i prowadząc do postępu patologicznego6,7. Mediatory zapalne i czynniki stresujące mechanicznie dalece nasilają dysfunkcję bariery, zwiększając podatność na choroby jamy ustnej8. Probiotyki jamy ustnej mogą pomóc zapobiegać chorobom przyzębia poprzez promowanie stabilności nabłonkowej bariery dziąsłowej. Niemniej jednak biologiczne interakcje między mikroorganizmami a komórkami nabłonka dziąsłowego w modulacjach funkcji bariery pozostają w dużej mierze niewyjaśnione9. Stąd rozwój niezawodnych metod oceny funkcji bariery nabłonkowej ma ogromne znaczenie.
Mikroskopia laserowa skanująca pojedynczy foton, znana z wysokiej rozdzielczości i uznanego systemu wykrywania, okazała się szczególnie przydatna do badania próbek tkankowych ex vivo10. Zaawansowane metody obrazowania znacznie poprawiają ocenę właściwości bariery dziąsłowej. Powierzchowny charakter tkanek dziąseł, z komórkami nabłonkowymi położonymi około 100 μm od powierzchni, sprawia, że są one idealnie przystosowane do takich podejść obrazowania. Nasze badania ustanowiły technikę oceny ex vivo wykorzystującą fluorescencyjnie oznakowane dekstrany o różnych masach cząsteczkowych jako śladowce przepuszczalności międzykomórkowej. W połączeniu z mikroskopia laserową skanującą pojedynczy foton, ta metoda umożliwia dokładne określenie funkcji bariery nabłonkowej dziąseł, zapewniając wgląd w mechanizmy choroby przyzębia i potencjalne interwencje terapeutyczne.
Protokół ustalony w niniejszym badaniu, łączący zlokalizowany dostarczanie śladowców w żelu z trójwymiarowym obrazowaniem ex vivo, jest specjalnie zoptymalizowany, aby sprostać wyjątkowym wyzwaniom związanym z oceną bariery nabłonkowej dziąseł. Po pierwsze, istniejące metody wstrzyknięć śladowców dożylnych (Tabela 1) nie są w stanie precyzyjnie ocenić przepuszczalności zlokalizowanych drobnych miejsc nabłonkowych dla czynników zewnętrznych11. Po drugie, tradycyjne metody histologiczne wymagają dekalcyfikacji i przekrojów, które niszczą strukturę tkanki i są pracochłonne oraz czasochłonne12,13,14. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół wykorzystuje wysoce klejący żel, aby osiągnąć skuteczne utrzymanie śladowców na złożonej powierzchni lokalnej. Co więcej, poprzez 3D obraz, zapewnia precyzyjne, nieniszczące określenie głębokości przenikania śladowca i jego rozkładu w nabłonku dziąsłowym, zachowując w ten sposób pełną przestrzenną architekturę tkanki. W konsekwencji, ta metoda jest szczególnie odpowiednia dla wysokiej rozdzielczości oceny czasoprzestrzennej funkcji bariery nabłonkowej dziąseł w złożonym i ograniczonym środowisku jamy ustnej.

<table><tbody><tr><td>40 kDa FITC-labeled dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78331</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa rhodamine B-labeled dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Blunt tissue separation nickel</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>NZW28</td><td></td></tr><tr><td>carboxymethylcellulose</td><td>MREDA</td><td>M049898</td><td></td></tr><tr><td>Disposable sterile syringe</td><td>Zhiyu Company</td><td></td><td>1 mL</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Image Software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Single photon microscope Nikon A1 MP+</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue scissors</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>M286-05</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Functional Assessment of Mouse Gingival Epithelial Barrier Using Fluorescent Tracers

Śluzowa bariera nabłonkowa dziąseł pełni kluczową rolę jako pierwsza linia obrony w odporności i homeostazie jamy ustnej. Całotliwość bariery nabłonkowej skutecznie zapobiega przenikaniu szkodliwych substancji z środowiska jamy ustnej, podczas gdy jej uszkodzenie jest ściśle związane z patogenezą chorób takich jak periodontitis i liszaj ropny śluzówki jamy ustnej. W tym miejscu, opisaliśmy metodę opartą na aplikacji topikalnej do oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy. Po pierwsze, mieszanina fluorescencyjnie oznaczonych dekstrań o różnych masach cząsteczkowych (40 lub 70 kDa) w 2% karboksymetylocelulozie sodowej została zastosowana topikalnie na powierzchnię dziąseł wargowym regionu trzonów zębów. Po 30-minutowej inkubacji szczęka była sekcjonowana i fiksowana w specjalnym uchwycie dla natychmiastowego obrazowania za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego. Takie podejście umożliwia wizualizację i ilościową ocenę różnych śledzików w warstwach nabłonka, zapewniając funkcjonalne odczyty integralności bariery nabłonkowej dziąseł, które mogą być stosowane w badaniach nad zapaleniem jamy ustnej, gojeniem ran i modelowaniu chorób.

Zgodnie ze standaryzowanym protokołem, zamontuj zęby szczękowe i tkanki przyzębne (w tym dziąsło, więzadło przyzębne, kość zębodołową i cement) myszy na specjalnie wykonanym uchwycie (Rysunek 1C). Badanie mikroskopowe ujawniło zielone (FD40) i czerwone (FD70) sygnały fluorescencji w dziąśle, wykazując przenikanie znaczników przez barierę nabłonkową. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania pod lunetą obrazów, dane były gromadzone za pomocą oprogramowania. W grupie kontrolnej oba fluoresce...

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

The gingival epithelial barrier serves as a critical frontline defense in oral immunity and homeostasis. An intact epithelial barrier effectively prevents ...

To jest standaryzowany protokół do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł. Ten protokół jest przydatny do badania chorób dysfunkcji bariery i testowania leków przywracających barierę w dziąsłach. Na początek należy podzielić samce myszy typu dzikiego C57BL/6J na trzy grupy składające się z grupy kontrolnej niepoddawanej leczeniu, grupy z periodonitą wywołaną ligaturą oraz grupy z periodonitą wywołaną przez Porphyromonas gingivalis.Wybierz fluorescencyjne znaczniki o nienakładających się widmach, takie jak dekstranu oznaczonego FITC i dekstranu oznaczonego rodaminą B. Aby rozcieńczyć znaczniki, wymieszaj po jednym gramie na litr FD40 i RD70 w żelu 2% karboksymetylocelulozy. Przechowuj przygotowaną mieszaninę na lodzie.Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez odruch szczypania palca, użyj rozwarcia jamy ustnej, aby utrzymać otwartą jamę ustną znieczulonego mysza. Nałożyć 50 mikrolitrów przygotowanej mieszanki znaczników miejscowo na powierzchnię wargową dziąsła w okolicy trzonowców. Pozostawić mieszaninę na miejscu przez 30 minut i ponownie nałożyć, jeśli została połknięta.Po 30 minutach stosowania znaczników ułożyć mysz w pozycji leżącej na plecach na kartonie i zabezpieczyć kończyny taśmą, aby unieruchomić zwierzę. Następnie otworzyć jamę ustną eutanalizowanej myszy i odizolować żuchwę górną. Delikatnie oczyścić otaczające tkanki i dokładnie przepłukać próbkę buforem PBS.Umieścić odizolowaną żuchwę górną na szklanej szlamie. Następnie umieścić glinę modelarską po obu stronach, aby ustabilizować i zabezpieczyć szkielet pokrywy nad próbką. Ostrożnie umieścić żuchwę górną na specjalnie zaprojektowanym uchwycie próbki, aby zapewnić stabilne umiejscowienie do obrazowania.Używając mikroskopii jednofotonowej pionowej z obiektywem zanurzeniowym wodnym 25X. Skoncentrować się na obszarze podtrzymującym pod żuchwą górną i wykonać zdjęcia. Wybrać obszar zainteresowania na powierzchni policzkowej drugiego trzonowca w żuchwie górnej i niezwłocznie rozpocząć obrazowanie.Wykonać obrazy Z-stack z wielkością kroku jednego mikrometra, zaczynając od powierzchni dziąsła do głębokości 100 do 200 mikrometrów w celu rekonstrukcji trójwymiarowej. W oprogramowaniu kliknąć plik i wybrać nowy folder, aby utworzyć nowy folder dla zestawu danych i nadać mu opisową nazwę. W zakładce nabycia ustawić format XY na 512 na 512 z rozdzielczością 0,99 mikrometrów na piksel.Następnie ustawić czynnik zoomu na jeden. Następnie ustawić długości fal wzbudzenia na 488 nanometrów i 561 nanometrów. Skonfigurować okna emisji na 500 do 550 nanometrów i 570 do 620 nanometrów odpowiednio.W przypadku serii Z i obrazowania trójwymiarowego wybrać tryb akwizycji ND. Ustawić krok Z na jeden mikrometr i dostosować w razie potrzeby. Po skonfigurowaniu parametrów wybrać tryb na żywo, aby wizualizować obszar dziąseł w pojedynczych i połączonych kanałach fluorescencji.Następnie kliknąć uruchom teraz, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Aby zmierzyć przepuszczalność, oddzielić intensywność fluorescencji FD40 i RD70 na różne kanały. Połączyć warstwy osi Z bez odejmowania tła.Następnie użyć oprogramowania ImageJ do ilościowej oceny intensywności fluorescencji w celu oceny przepuszczalności bariery nabłonkowej. Kliknij plik i wybierz otwórz, aby otworzyć obraz żuchwy w ImageJ. Następnie naciśnij obraz i zmień typ obrazu na format 8-bitowy dla analizy.Kliknij analizuj, wybierz ustal pomiary. Następnie zaznacz polecenie obszar, średnia i gęstość zintegrowana oraz kliknij ok, aby potwierdzić. Następnie wybierz żądany kanał i dostosuj próg, klikając obraz, wybierając ustaw i wybierając próg.Włączyć opcję ciemnego tła, aby uwzględnić czarne tło. Kliknij analizuj i wybierz ustal pomiary. Następnie zaznacz polecenie średnia wartość szarości i ogranicz do progu oraz potwierdź klikając ok.Używając narzędzia do dowolnego rysowania, ręcznie narysuj kontur obszaru sygnału fluorescencyjnego po stronie tkanki dziąsłowej. Kliknij analizuj i wybierz pomiar, aby uzyskać wartości intensywności fluorescencji, gdzie gęstość zintegrowana reprezentuje intensywność fluorescencji. Skopiuj wyniki pomiarów do arkusza kalkulacyjnego w celu wykonania obliczeń i wykresów.Oblicz średnią intensywność fluorescencji grupy kontrolnej w arkuszu kalkulacyjnym. Podziel każdą wartość intensywności fluorescencji grupy doświadczalnej przez średnią grupy kontrolnej, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji. W grupie kontrolnej oba znaczniki fluorescencyjne były w dużej mierze ograniczone do powierzchni dziąsła.W obu grupach leczonych ligaturą i Porphyromonas gingivalis zaobserwowano istotne wycieki zarówno FD40 jak i RD70 do nabłonka dziąsła. Analiza półilościowa wykazała istotne wzrost intensywności fluorescencji zarówno FD40 jak i RD70 w grupach leczonych ligaturą i Porphyromonas gingivalis. Obrazowanie 3D ujawniło bardziej rozległą i rozproszoną dystrybucję fluorescencji znaczników wokół naczyń dziąsłowych w grupach

functional-assessment-mouse-gingival-epithelial-barrier-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Opisujemy niezawodną metodę immunolokalizacji w obrębie naskórka, zmodyfikowaną zarówno dla przekrojów mrożonych, jak i parafiniowych, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium.

Immunohistochemia na skrawkach parafiny naskórka mysiego z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

Poznaj metodę oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników dextranowych. Technika ta umożliwia ilościową analizę przepuszczalności w badaniach zapalenia dziąseł i gojenia.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Przeglądaj więcej filmów