Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Opracowaliśmy metodę interakcji chromatyny DNA z RNA, czyli metodę RDD, która mapuje kontakt z chromatyną zorganizowaną według konkretnych cząsteczek RNA. RDD solidnie mapuje pasmowanie chromatyny specyficzne dla RNA oraz interakcje długodystansowe między endogennymi i egzogennymi RNA. Na początek należy ponownie zawiesić permeabilizowane jądro pochodzące z komórek dualnie sieciowanych Drosophila S2 w 15 mililitrach buforu lizyzującego 0,1% FA zawierającego Triton X-100.

Zachowaj 1,5 mililitra zawiesiny jądrowej do probówki o okrągłym dnie 14 mililitrów, unikając jednocześnie powstawania pęcherzyków. Sonikuj zawieszenie z amplitudą 38% przez 4,5 minuty, stosując 30-sekundowe włączenie i 30-sekundowe wyłączenie. Zbierz sonikowaną chromatynę do probówki o średnicy 15 mililitrów i wiruj w 3,200g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Przelej około 13 mililitrów supernatantu do nowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych kulek streptawidyny C1 do rurki zawierającej sonikowaną chromatynę i obracaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczaj lampę na magnetycznym stojaku na minutę i przelej supernatant zawierający wstępnie oczyszczoną chromatynę do nowej rurki 50-mililitrowej.

Przechowuj aliquot 10-mikrolitrowy w minus 20 stopniach Celsjusza do analizy. Inkubuj 26 mililitrów świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego z 13 mililitrami wcześniej oczyszczonej chromatyny na rotatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie aliquotuj mieszaninę hybrydyzacyjną do trzech probówek o pojemności 15 mililitrów i dodaj sześć mikrolitrów sond biotinylowanych o pojemności 100 mikromolów do każdej próbki.

Po uszczelnieniu pokrywek rurek folią, obróć je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po zablokowaniu kulek streptawidyny C1 usuń bufor blokujący i ponownie zawiesij kulki w 400 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego. Teraz dodaj kulki streptawidyny C1 objęte buforem blokującym do wcześniej przygotowanej chromatyny hybrydyzowej.

Rotuj mieszankę przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po wyrzuceniu supernatantu i przeniesieniu kulek do rurki o pojemności 1,5 mililitra, przepłucz kulki pięć razy 800 mikrolitrami buforu do mycia, a następnie dwa razy buforem TE. Po końcowym myciu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 1 000 mikrolitrach buforu TE zawierającego inhibitor proteazy 1X w temperaturze pokojowej.

Aby zablokować niezajęte miejsca na kulkach streptawidyny C1 związanych z kompleksem sond-chromatyna, należy dodać 220 mikrolitrów zdenaturowanego IPB do kulek i obracać rurkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji przemyj kulki streptawidyny C1 pięć razy, używając buforu TE. Następnie dodaj 693 mikrolitry mieszanki naprawczej do chromatyny na kulkach streptawidyny C1 i dobrze wymieszaj.

Następnie dodaj siedem mikrolitrów polimerazy DNA T4. Inkubuj mieszankę na termomieszarce z prędkością 800 obrotów na minutę i 12 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie inkubuj próbkę na mikserze w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Umyj kulki trzy razy 800 mikrolitrami lodowatego bufora ChIA-PET, a następnie raz buforem TE. Następnie dodaj 693 mikrolitry mieszanki A-tailing do chromatyny na kulkach streptawidyny C1 i dobrze wymieszaj. Następnie dodaj siedem mikrolitrów fragmentu Klenowa od trzech do pięciu pierwszych egzonukleazy minus.

Inkubuj rurkę na mikserze z prędkością 12 obrotów na minutę i 37 stopni Celsjusza przez 50 minut. Umyć kulki trzy razy 800 mikrolitrami lodowatego bufora ChIA-PET, a następnie raz delikatnie pipetować buforem elucijnym. Następnie dodaj 1 390 mikrolitrów mieszanki zbliżeniowej do chromatyny na kulkach streptawidyny C1 i inkubuj w mikserze w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Dodaj do mieszaniny 10 mikrolitrów ligazy DNA T4 i inkubuj z rotacją z prędkością 20 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez pięć minut, następnie przejdź do 12 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez 50 minut i kontynuuj inkubację w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez całą noc. Następnie umyj kulki trzy razy 800 mikrolitrami zimnego bufora ChIA-PET, a następnie dwa razy buforem TE. Aby uwolnić chromatynę, dodaj 480 mikrolitrów buforu elucijnego LC ChIP do chromatyny na kulkach streptawidyny C1 i dobrze wymieszaj.

Dodaj 20 mikrolitrów 20 miligramów białazy K na mililitr w celu odłączenia krzyżowego. Inkubuj probówkę na termomikserze z prędkością 950 obrotów na minutę i 65 stopni Celsjusza przez noc, a następnie oczyszcz DNA podwiązywane w pobliżu za pomocą odczynnika alkoholu fenol:chloroform:izoamyl. Dodaj wszystkie wymagane składniki do testu tagmentacyjnego Tn5 w całkowitej objętości reakcji 50 mikrolitrów w probówce PCR na lodzie.

Inkubuj reakcję tagmentacji w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 minut w termocyklerze z pokrywką ustawioną na 70 stopni Celsjusza, a następnie utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów buforu elucijnego ChIP oraz jeden mikrolitr proteinazy K do oznaczonego DNA. Wymieszaj roztwór i inkubuj na termomieszarce w temperaturze 65 stopni Celsjusza i 900 obrotach na minutę przez 30 minut.

Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA oraz ilościowo określić za pomocą automatycznego systemu elektroforezy kapilarnej. Dodaj całe fragmentowane, ligowane DNA do kulek M280 zablokowanych buforem blokującym i DNA genomowym i wymieszaj zawiesinę. Obróć rurkę na mikserze w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Po krótkim obrócie umieść lampę na magnetycznym stojaku i wyrzuć supernatant. Po krokach mycia dodaj 30 mikrolitrów buforu elucijnego do kulek bez mieszania. Przygotuj mieszankę PCR zgodnie z zestawem do przygotowania biblioteki DNA.

Przenieś lampy PCR do maszyny PCR i ustaw program wzmacniający. Na koniec, po oczyszczeniu produktu PCR za pomocą kulek magnetycznych, zmierz od 10 do 30 nanogramów DNA bibliotecznego za pomocą kwantyfikatora kwasów nukleinowych, aby przygotować próbkę do sekwencjonowania. Fragmenty chromatyny sonikowanej miały od około 1 000 do 3 000 par zasad, co wskazuje na udaną fragmentację.

Chromatyna związana z RNA wykazywała rozmiar fragmentów w zakresie od około 1 000 do 3 000 par zasad. Chromatyna oznaczona Tn5 wykazała rozkład fragmentów wskazujący na efektywność tagmentacji chromatyny. Biblioteka sekwencjonowania po amplifikacji wykazała rozkład wielkości fragmentów w zakresie od około 180 do 1 000 par zasad.

Po wyborze rozmiaru fragmenty biblioteki sekwencjonowania były głównie wzbogacone w zakresie około 250 do 600 par zasad. Interakcja chromatyny DNA-DNA powiązanej z RNA, czyli metoda RDD, wykrywała genomowe lokalizacje wiązania NC RNA roX2 i 7SK wraz z odpowiadającymi odległymi pętlami interakcji chromatyny. Dane z polimerazy RNA II ChIA-PET ujawniają wyraźną zależność regulacyjną między tymi RNA NC a ekspresją genów, z pikami wskazującymi na siłę interakcji.

Analizę wielowymiarową przeprowadzono poprzez integrację interakcji zakotwiczonych w RDD z mapami konformacji chromatyny o całym genomie Hi-C oraz znakami epigenomicznymi, początkującą transkrypcją oraz danymi z polimerazy RNA II ChIA-PET. W tych regionach topologicznie widoczne były domeny skojarzenia, a pętle chromatynowe kierowane przez RNA często znajdowały się na ich granicach lub obejmowały wiele takich domen. Dodatkowo wyznaczono RNA-centryczne ośrodki regulacyjne.

Metoda RDD oraz zakotwiczone interakcje chromatyny ujawniające miejsca wiązania RNA oraz powiązane interakcje DNA-DNA w organizacji genomu 3D. Kluczowe nauki to utrzymywanie właściwych proporcji sond, linkera i chromatyny oraz blokowanie nieograniczonych miejsc streptawidyny naturalną biotyną przed podwiązaniem polimerazy. Przyszłe badania mogą zbadać, jak RNA dynamicznie nakręca interakcje chromatyny w rozwoju, zaburzeniach i infekcjach.