Name: Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj protokół obrazowania superrozdzielczego w mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową. Umożliwia on badanie struktur komórkowych i subkomórkowych w komórkach stałych i żywych z rozdzielczością około 120 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie techniczne ze strony Core Facilities Zhejiang University School of Medicine oraz dziękują Yao Yao Zhongowi za dostarczenie próbki żywych komórek Hep3B na raka wątroby u człowieka. Prace te były wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang (LZ25H060002), Projekt Technologii Eksperymentalnej Uniwersytetu Zhejiang (SYBJS202321), Departament Edukacji Prowincji Zhejiang (Y202351321) oraz otwarty projekt badawczy Kluczowego Laboratorium Wirusologii Zwierząt, Ministerstwa Rolnictwa i Spraw Wiejskich (202201).

<ol><li>Prakash, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+in+super-resolution+microscopy+-+definition%2C+trade-offs+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).</li>
<li>Bond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+advances+in+super-resolution+microscopy+to+study+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes.</a> Mol Cell. 82, 315-332 (2022).</li>
<li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+2D+super-resolution+mode+for+ZEISS+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nat Methods. 14, 1223(2017).</li>
<li>Wu, X., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEISS+Airyscan%3A+Optimizing+Usage+for+Fast+Gentle%2C+Super-Resolution+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging.</a> Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).</li>
<li>Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+strategy+for+fast+super-resolution+imaging+parameters+based+on+LSM+900%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900.</a> Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).</li>
<li>Moore, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cables+and+comet+tails+organize+mitochondrial+networks+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis.</a> Nature. 591, 659-664 (2021).</li>
<li>Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+live+cell+imaging+of+subcellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution live cell imaging of subcellular structures.</a> J Vis Exp. (167), e61563(2021).</li>
<li>Harmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super+resolution+microscopy+to+study+trypanosomatid+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology.</a> Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).</li>
<li>Lin, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+functions+and+management+of+laser+scanning+confocal+microscopy+LSM880+with+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chin+Electron+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan.</a> J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+imaging+characteristics+and+applications+of+LSCM880+with+Airyscan+and+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Innov+Appl%22%5BJournal%5D)">Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy.</a> Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Vasohibin+1+speeds+contraction+and+relaxation+in+failing+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes.</a> Circ Res. 127, 14-27 (2020).</li>
<li>Sandin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+simultaneous+laser+scanning+confocal+and+atomic+force+microscopy+%28conpokal%29+on+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells.</a> J Vis Exp. (162), e61433(2020).</li>
<li>Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Imaging+of+Proteus+mirabilis+biofilm+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy.</a> J Vis Exp. (221), e67932(2025).</li>
<li>Wolf, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+live-cell+super-resolution+imaging+of+mitochondrial+cristae+and+quantification+of+submitochondrial+membrane+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials.</a> Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).</li>
<li>Wu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+perylene+carboximide+fluorophores+for+live-cell+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging.</a> J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).</li>
<li>Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+suppress+the+release+of+vaccinia+virus+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells.</a> J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).</li>
<li>Kolossov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super-resolution+microscopy+of+mitochondrial+morphology+and+dynamics+in+living+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells.</a> Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+macrophages+monitor+and+remove+particles+from+urine+to+prevent+tubule+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction.</a> Immunity. 57, 106-123 (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurujących interesów finansowych ani niefinansowych. Autorzy korzystali z DeepSeek do pomocy w dopracowywaniu języka i formatowaniu podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Przedstawiony tutaj zintegrowany protokół stanowi kompleksową mapę drogową wdrażania zaawansowanych możliwości obrazowania nowoczesnego systemu mikroskopu konfokalnego wyposażonego w multipleksowaną matrycę superrozdzielczości, w ramach zrównoważonego systemu współdzielonych zasobów. Ta sekcja syntetyzuje kluczowe aspekty metody, jej praktyczne zastosowanie oraz jej pozycję w dziedzinie bioobrazowania. Pomyślne wdrożenie tego protokołu zależy od kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, skrupulatne przygotowanie próbek jest ...

Wizualizacja dynamicznych struktur podkomórkowych jest fundamentalna dla rozwoju badań w naukach przyrodniczych. Jednak rozdzielczość tradycyjnej mikroskopii optycznej jest ograniczona dyfrakcją do około 200 nm bocznie, co ogranicza jej zdolność do rozróżniania dynamicznych procesów podkomórkowych. Aby pokonać tę barierę, opracowano różne techniki superrozdzielczości. Jednak techniki takie jak mikroskopia STED, PALM/STORM i SIM często stanowią bariery dla szerokiego przyjęcia w środowiskach wieloużytkownikowych, w tym wysoką fototoksyczność, potrzebę specjalistycznych fluoroforów lub przygotowania próbek, złożone procedury wyrównania czy intensywne przetwarzanie obliczeniowe 1,2,3.
W tym kontekście systemy mikroskopu konfokalnego wyposażone w multipleksowany detektor matrycowy stanowią atrakcyjną alternatywę, umożliwiając obrazowanie w superrozdzielczości poprzez wykrywanie wielopikselowe i reassignment obliczeniowe, co znacząco obniża próg techniczny4. Podejście to wykorzystuje 32-elementową matrycę detektorów z foszenikiem arsenku galu (GaAsP) do zbierania większej liczby fotonów z każdego punktu skanowania. Kolejne inteligentne algorytmy dekonwolucyjne przydzielają te informacje, skutecznie zmniejszając objętość detekcji. Proces ten osiąga rozdzielczość przestrzenną około 120 nm bocznie i 350 nm osiowo, co reprezentuje około 2x poprawę w stosunku do limitu dyfrakcyjnego mikroskopii szerokopolnej i daje 4-8-krotny wzrost stosunku sygnału do szumu w porównaniu ze standardowym trybem konognistycznym tego samego instrumentu 4,5,6. To unikalne połączenie zwiększonej rozdzielczości, lepszej jakości sygnału oraz kompatybilności z powszechnymi fluorescencyjnymi etykietami i protokołami stanowi jego główną zaletę w szerokim zastosowaniu.
W konsekwencji ta forma dostępnej mikroskopii superrozdzielczej znalazła szerokie zastosowanie w badaniach nauk przyrodniczych, umożliwiając szczegółowe badania morfologii organelli, dynamiki cytoszkieletu, interakcji wirus-gospodarz oraz współlokalizacji molekularnej zarówno w komórkach stałych, jak i żywych 7,8. Jego względna łagodność sprawia, że jest szczególnie odpowiedni do długich obserwacji próbek żywych w czasie poklatkowym.
Integracja tak zaawansowanych systemów z kluczowymi obiektami jest kluczowa dla demokratyzacji dostępu, ale ich trwała i skuteczna eksploatacja stawia przed sobą szczególne wyzwania. W instytucjach podstawowych, takich jak Szkoła Medyczna Uniwersytetu Zhejiang, optymalna wydajność i wpływ w kluczowym stopniu zależą od trzech filarów: (1) ustandaryzowanych i powtarzalnych protokołów obrazowania, (2) rygorystycznej rutynowej konserwacji oraz (3) skutecznych ram zarządzania zapewniających współdzielony dostęp. Chociaż istnieją cenne zasoby dotyczące konkretnych aspektów, takich jak metody obrazowania dla wcześniejszych systemów9czy ogólne zasady zarządzania obiektami10,11, obecnie brakuje kompleksowego przewodnika integrującego szczegółowe, powtarzalne protokoły dla nowoczesnych multipleksowanych platform detektorów z sprawdzonym modelem zarządzania współzasobami. Ten artykuł protokołu ma na celu zniwelowanie tej luki.
Głównym celem jest zapewnienie kompleksowego, krok po kroku przewodnika po skutecznym wdrożeniu i wykorzystaniu systemu konfokalnego z detektorem multipleksowanym matrycowym do obrazowania o nadrozdzielczości w środowisku współdzielonych zasobów. Jest przeznaczony dla dwóch głównych odbiorców: badaczy wymagających rozdzielczości przekraczającej konwencjonalne limity konfokalne (~250-300 nm), ale dla których kluczowa jest kompatybilność z żywymi komórkami, łatwość obsługi i przepustowość; oraz menedżerowie obiektów tworzący lub optymalizujący taką usługę. Systematycznie szczegółowo przedstawiamy konfigurację systemu, protokoły obrazowania multimodalnego (obejmujące tryby wielokolorowe, 3D, live-cell, tiling i super-resolution) oraz sprawdzony model współdzielonego zarządzania. Ten zintegrowany przewodnik służy jako źródło maksymalizacji potencjału i dostępności tej potężnej metody obrazowania.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Komórki COS7</td><td>ATCC (lub podobny)</td><td>CRL-1651</td><td>Linia komórek fibroblastu nerek afrykańskiej małpy zielonej. Wykorzystywany do przygotowywania próbek z komórkami stałymi do wielokolorowego obrazowania w superrozdzielczości&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; IgG przeciwmyszy osioł, sprzężony Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen (lub podobny)</td><td>A10037</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia mikrotubul. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Dulbecco' Zmodyfikowane medium orła (DMEM), wysoka zawartość glukozy</td><td>Gibco (lub podobny)</td><td>11965092</td><td>Standardowe pożywki hodowlane dla komórek COS7, uzupełnione 10% FBS.</td></tr><tr><td>&nbsp; Serum bydlęce płodu (FBS), nieaktywowane na gorąco</td><td>Gibco (lub podobny)</td><td>10082147</td><td>Suplement surowicy stosowany w stężeniu 10% (v/v) we wszystkich pożywkach hodowlanych komórek.</td></tr><tr><td>&nbsp; Obrazownik z szklanym dnem (35 mm, &mikro; -Talerz, #1,5 polimerowa pokrywa, grubość 0,17 mm)</td><td>Ibidi (lub podobne)</td><td>81156</td><td>Podłoże do płytowania komórek i obrazowania. Kluczowe dla kompatybilności z obiektywami immersyjnymi o wysokiej zawartości oleju azotowego.</td></tr><tr><td>&nbsp; Przetwarzanie obrazu i obróbka obrazu Oprogramowanie analityczne (moduły ZEN)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (niebieski)</td><td>Wykorzystywany do rekonstrukcji 3D, przetwarzania superrozdzielczości (np. Airyscan Processing), pomiarów PSF oraz analizy SNR.</td></tr><tr><td>&nbsp; ImageJ / Fidżi</td><td>Open Source</td><td>Nie ma</td><td>Wykorzystywane do dodatkowej rekonstrukcji 3D, generowania widoków ortogonalnych oraz ogólnej analizy obrazów.</td></tr><tr><td>&nbsp; Olej immersyjny (współczynnik załamania = 1,518)</td><td>Carl Zeiss (lub podobny)</td><td>444960-0000-000</td><td>Do użycia z obiektywami immersyjnymi olejowymi (np. 63x/1.4 NA).</td></tr><tr><td>&nbsp; Laserowy skanujący system mikroskopu konfokalnego z detektorem multipleksowym (np. ZEISS LSM 900 z Airyscan 2)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 900 (Airyscan 2)</td><td>Główna platforma obrazowania używana dla wszystkich trybów konfokalnych i superrozdzielczych opisanych w protokole.</td></tr><tr><td>&nbsp; Minimalne Niezbędne Medium (MEM) z Earlem' s Salts</td><td>Gibco (lub podobny)</td><td>11095080</td><td>Standardowa pożywka hodowla dla komórek Hep3B, uzupełniona 10% FBS.</td></tr><tr><td>&nbsp; Mysze przeciwciało monoklonalne przeciwciało anty-&alfa;-tubulinowe (klon DM1A)</td><td>Sigma-Aldrich (lub podobny)</td><td>T6199</td><td>Główne przeciwciało do znakowania mikrotubul. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Paraformaldehyd (PFA), 4% w PBS</td><td>&nbsp; Jinpan &nbsp; (lub podobne)</td><td>TBS5083</td><td>Utrwalacz dla komórek. Używaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Postępuj z odpowiednią ostrożnością.</td></tr><tr><td>&nbsp; Medium obrazujące wolne od fenolu</td><td>Gibco (lub podobny)</td><td>21063029</td><td>Ośrodek o niskiej autofluorescencji stosowany do obrazowania w komórkach żywych. Wstępnie wyważony z 5% CO2 przy 37 stopiach i stopień; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>&nbsp; Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>CellWorld (lub podobny)</td><td>C0162-311</td><td>Używany jako bufor do mycia i rozcieńczania przez cały protokół.</td></tr><tr><td>&nbsp; ProLong złoty montaż antyfady</td><td>Invitrogen (lub podobny)</td><td>P36930</td><td>Utwardzone medium montażowe do zachowania fluorescencji w próbkach stałych.</td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (lub podobny)</td><td>T8787</td><td>Stosowany w stężeniu 0,1% (v/v) do permeabilizacji komórek</td></tr><tr><td>&nbsp; Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich (lub podobny)</td><td>P9416</td><td>Stosowany w stężeniu 0,05% (v/v) w PBS (PBST) do fazy mycia po inkubacji przeciwciał.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła (BSA), Frakcja V</td><td>Sigma-Aldrich (lub podobny)</td><td>A7906</td><td>Stosowany w stężeniu 1% (w/v) w PBS do blokowania oraz jako składnik buforu rozcieńczania przeciwciał.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol)</td><td>Sigma-Aldrich (lub podobny)</td><td>D9542</td><td>Nuklearna barwa do kontrastu. Stosowany w końcowym stężeniu 1 & mikro; g/mL.</td></tr><tr><td>IgG antykrólikowy osioł, Alexa Fluor 488 sprzężony</td><td>Invitrogen (lub podobny)</td><td>A21206</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia mitochondrialnego. Stosowany w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne mikrosfery (kulki), średnica 100 nm</td><td>Invitrogen (np. TetraSpeck&trade;) lub podobny</td><td>T7279</td><td>Wykorzystywane do pomiaru empirycznego układu' funkcji rozrzutu punktowego (PSF) oraz rozdzielczości.</td></tr><tr><td>Komórki Hep3B stabilnie wyrażające mitochondria EGFP</td><td>IMMOCELL</td><td>IM-H367</td><td>Linia komórkowa ludzkiego wątroby zaprojektowana tak, aby stabilnie ekspresowała EGFP skierowany do matrycy mitochondrialnej. Wykorzystywane do obrazowania czasowego na żywej komórki.</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES, 1 M</td><td>Gibco (lub podobny)</td><td>15630080</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 25 mM w medium obrazującym do stabilizacji pH podczas obrazowania na żywo, poza inkubatorem CO2.</td></tr><tr><td>Wysokoprecyzyjne szkło osłonowe (#1,5, grubość 0,17 mm)</td><td>Marienfeld (lub podobne)</td><td>107052</td><td>Używany do montażu stałych próbek.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie operacyjne mikroskopu (np. edycja ZEN blue)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (niebieski)</td><td>Wykorzystywane do sterowania systemem, akwizycji obrazu oraz podstawowego przetwarzania obrazów.</td></tr><tr><td>Obiektyw: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>421462-9900-000</td><td>Główny cel używany do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.</td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało królika anty-TOMM20</td><td>Abcam (lub podobny)</td><td>ab186735</td><td>Główne przeciwciało do znakowania mitochondriów. Stosowany w rozcieńczeniu 1:1000 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Super-Resolution Imaging and Shared Management: A Protocol for Confocal Microscopy with Multiplex Detection

Mikroskopia superrozdzielcza (SRM) pokonuje ograniczenie dyfrakcyjne konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, umożliwiając wizualizację struktur podkomórkowych na skalę nano. Jednak powszechne stosowanie technik takich jak mikroskopia stymulowanego redukcji emisji (STED), fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna (PALM) / stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcji (STORM) oraz mikroskopia iluminacji strukturalnej (SIM) może być utrudnione przez czynniki takie jak wysoka fototoksyczność, specjalistyczne przygotowanie próbek czy złożone operacje. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół wykorzystujący laserową platformę konfokalną zintegrowaną z multipleksowanym detektorem superrozdzielczości. System ten, w połączeniu z przetwarzaniem obliczeniowym, umożliwia proste przejście między obrazowaniem konfokalnym a superrozdzielczym w ramach tego samego workflow. Protokół zapewnia przyjazne dla użytkownika podejście do szybkiego, wysokorozdzielczego i niskofototoksycznego obrazowania. Szczegółowa metoda obejmuje możliwości obrazowania multimodalnego, w tym fluorescencję wielokolorową, różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), trójwymiarową rekonstrukcję stosu Z, obrazowanie w żywych komórkach poklatkowych w czasie poklatkowym, płytkowanie dużych obszarów oraz różne tryby superrozdzielczości oferowane przez detektor multipleksowany matrycą. Systematyczne porównania pokazują, że tryby superrozdzielczości osiągają rozdzielczość boczną około 120 nm, co stanowi około dwukrotną poprawę względem limitu dyfrakcyjnego konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej oraz znaczącą poprawę zarówno rozdzielczości, jak i stosunku sygnału do szumu (4-8 razy) w porównaniu ze standardową pracą konfokalną na tej samej platformie. Dyskusja obejmuje również kluczowe kwestie modelu wspólnego zarządzania zasobami, niezbędnego do wspierania zrównoważonego funkcjonowania tej technologii. Ten zintegrowany przewodnik stanowi cenne źródło zarówno dla nowych, jak i doświadczonych badaczy oraz kierowników obiektów, dążących do przyjęcia i maksymalizacji potencjału tej dostępnej formy zaawansowanego obrazowania w badaniach nauk przyrodniczych.

Obrazowanie fluorescencji wielokolorowej Wykonano wielokolorowe obrazowanie fluorescencji stałych komórek COS7 zgodnie z opisem w Sekcji 3. Przeciwciała przeciwko α-tubulinie (mikrotubule) oraz TOMM20 (mitochondria) były stosowane z jądrowym przeciwbarwieniem DAPI. Jak pokazano na Rysunku 1, jądra (niebieskie), mitochondria (zielone, Alexa Fluor 488) oraz mikrotubule (czerwone, Alexa Fluor 568) zostały wyraźnie wyodrębnione z wysoką swoistością i minimalnym przesłuchem ...

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Super-resolution microscopy (SRM) overcomes the diffraction limit of conventional light microscopy, enabling nanoscale visualization of subcellular ...

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu dostępnych metod obrazowania superrozdzielczego, które pozwalają wizualizować dynamiczne struktury podkomórkowe, przezwyciężając ograniczenie dyfrakcyjne konwencjonalnej mikroskopii. Metoda superrozdzielczości mierzy się z fototoksycznością, złożoną operacją oraz specjalistycznym przygotowaniem. Protokół ten redukuje te bariery dzięki detekcji wielokątnej opartej na konfokalach.Na początek włącz główną jednostkę mikroskopu, moduł wystrzelenia lasera, źródło światła LED oraz komputer sterujący. Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu. Z głównego interfejsu wybierz GFP, a następnie wyłącz światło odbite.Przejdź do panelu Akwizycji. W rozwijanym menu obiektywu obiektywu wybierz odpowiedni obiektyw. W przypadku obrazowania żywych komórek, 45 do 60 minut przed obrazowaniem, aktywuj komorę środowiskową oraz aktywny system stabilizacji ogniskowej.Po ustabilizowaniu systemu zweryfikować stabilność za pomocą czujników komorowych. Nałóż olej immersyjny na przednią soczewkę obiektywu, nie powodując przy tym pęcherzyków. Umieść przygotowaną próbkę na scenie mikroskopu.Delikatnie go podnieś, aż slip styka się z olejem immersyjnym. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji. Przejdź do zakładki Akwizycja i wybierz utwórz nowy eksperyment.Teraz dodaj ścieżki obrazowania dla użytych fluoroforów. Dla każdego toru ustaw średnicę otworu konfokalnego na jedną jednostkę powietrza. Aby zoptymalizować moc lasera, wybierz pierwszy kanał i przełącz się na tryb skanowania na żywo.Ustaw początkową moc lasera na niską wartość, a następnie wzmocnienie detektora na umiarkowany poziom w jego zakresie liniowym. Następnie stopniowo zwiększ moc lasera, aż struktury docelowe będą wyraźnie widoczne ponad tłem na obrazie na żywo. Ustaw rozmiar piksela za pomocą przycisku Nyquist w oprogramowaniu, aby automatycznie go obliczyć.Następnie ustaw czas pikseli. Teraz wybierz tryb sekwencyjnego skanowania między ścieżkami, aby zminimalizować przesłuchy. Kliknij Snap, aby uzyskać pojedyncze zdjęcie.Zapisz obraz z odpowiednimi metadanymi. Aby uzyskać spójne ustawienia w różnych przekrojach optycznych, potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są skonfigurowane na jednej optymalnej płaszczyźnie ogniskowej przed zdefiniowaniem stosu Z. Otwórz zakładkę Akwizycja i wybierz tryb Z-stack.Zdefiniuj objętość, używając szybkiego skanowania na żywo, aby najpierw skupić się na najniższej strukturze, a następnie kliknąć Ustaw ostatni lub dolny. Ostrożnie dostosuj ostrość do najwyższej interesującej struktury i kliknij Najpierw lub Góra. Oprogramowanie wtedy wyświetli całkowitą głębokość.Rozmiar stosu Z jest ustawiony tak, aby spełniał kryterium próbkowania Nyquista. Użyj przycisku Optimalny, aby obliczyć to automatycznie. Po skonfigurowaniu parametrów obrazowania dla każdego kanału zwiększ moc lasera lub nieznacznie wzmocnienie dla słabych sygnałów w porównaniu do pojedynczego dwuwymiarowego obrazu.Rozpocznij akwizycję, aby zebrać cały stos obrazów. Do wizualizacji użyj natywnego modułu przetwarzania mikroskopu. Generuj projekcje maksymalnej intensywności, aby zobaczyć wszystkie sygnały ostrości w jednym dwuwymiarowym obrazie.Następnie wykonuję renderowanie objętościowe za pomocą wbudowanych algorytmów oprogramowania, aby wygenerować trójwymiarową reprezentację. Dostosowuj jasność, krycie i oświetlenie w razie potrzeby. Następnie generować ortogonalne przekroje XZ i YZ, aby sprawdzić zasięg osiowy i rejestrację.Wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne stałych komórek COS-7 wykazało, że jądra, mitochondria i mikrotubule były wyraźnie oznaczone z minimalnym nakładaniem się, co potwierdzało skuteczne sekwencyjne skanowanie i optymalną detekcję. Projekcja maksymalnej intensywności integruje sygnały ze wszystkich sekcji optycznych, podkreślając przestrzenny rozkład struktur oznaczonych fluorescencjo. Rekonstrukcja trójwymiarowa zapewnia świadomy głęboki widok architektury próbki.Obrazowanie poklatkowe żywych komórek MEP 3B z mitochondriami tagowanymi EGFP jest porównywane między trybami. Klatki konfokalne w punktach czasowych pokazują wyraźne struktury, ale stopniową utratę sygnału. Standardowe klatki superrozdzielczości lub SR pokazują wyższą rozdzielczość, ale z czasem zwiększone wybielanie zdjęć.Obrazy o wysokiej rozdzielczości lub SR-4Y zachowują stabilną fluorescencję nawet w późniejszych momentach. Wykres średniej intensywności fluorescencji EGFP w 100 punktach czasowych pokazuje, że tryb SR-4Y utrzymywał najbardziej stabilny sygnał. Wydajność obrazowania w ogniwach stałych COS-7 porównywano między trybami, a tryby superrozdzielczości zapewniały wyraźniejsze szczegóły strukturalne niż konfokalne.Pomiar funkcji rozproszenia punktowego za pomocą 100-nanometrowych fluorescencyjnych kulek wykazał, że Airyscan SR wraz z późniejszą dekonwolucją stawów poprawił rozdzielczość zarówno boczną, jak i osiową w porównaniu z samym Airyscan SR. Protokół ten pozwala badaczom badać morfologię organelli, dynamikę cytoszkieletu oraz kolokalizację cząsteczek zarówno w komórkach stałych, jak i żywych z rozdzielczością około 120 nanometrów. Najważniejszym aspektem tego protokołu jest skrupulatne przygotowanie próbki przy użyciu wysokiej jakości szkła pokrywowego oraz zoptymalizowane barwienie zapewniające integralność sygnału dla przetwarzania superrozdzielczego.Zgodnie z tą procedurą badacze mogą przeprowadzić ilościową analizę obrazów, taką jak pomiar stosunku sygnału do szumu lub kolokalizację, korzystając z dedykowanego oprogramowania, takiego jak ImageJ.

super-resolution-imaging-shared-management-protocol-for-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Ten manuskrypt opisuje konstrukcję i działanie mikrotensjometru/mikroskopu konfokalnego do wykonywania jednoczesnych pomiarów napięcia międzyfazowego i reologii dylatacyjnej powierzchni przy jednoczesnej wizualizacji morfologii międzyfazowej. Zapewnia to konstruowanie w czasie rzeczywistym relacji struktura-właściwości interfejsów ważnych w technologii i fizjologii.

Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Poznaj protokół obrazowania superrozdzielczego w mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową. Umożliwia on badanie struktur komórkowych i subkomórkowych w komórkach stałych i żywych z rozdzielczością około 120 nm.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Przeglądaj więcej filmów