Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową
February 24th, 2026
Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.
Nasze badania koncentrują się na opracowaniu dostępnych metod obrazowania superrozdzielczego, które pozwalają wizualizować dynamiczne struktury podkomórkowe, przezwyciężając ograniczenie dyfrakcyjne konwencjonalnej mikroskopii. Metoda superrozdzielczości mierzy się z fototoksycznością, złożoną operacją oraz specjalistycznym przygotowaniem. Protokół ten redukuje te bariery dzięki detekcji wielokątnej opartej na konfokalach.
Na początek włącz główną jednostkę mikroskopu, moduł wystrzelenia lasera, źródło światła LED oraz komputer sterujący. Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu. Z głównego interfejsu wybierz GFP, a następnie wyłącz światło odbite.
Przejdź do panelu Akwizycji. W rozwijanym menu obiektywu obiektywu wybierz odpowiedni obiektyw. W przypadku obrazowania żywych komórek, 45 do 60 minut przed obrazowaniem, aktywuj komorę środowiskową oraz aktywny system stabilizacji ogniskowej.
Po ustabilizowaniu systemu zweryfikować stabilność za pomocą czujników komorowych. Nałóż olej immersyjny na przednią soczewkę obiektywu, nie powodując przy tym pęcherzyków. Umieść przygotowaną próbkę na scenie mikroskopu.
Delikatnie go podnieś, aż slip styka się z olejem immersyjnym. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji. Przejdź do zakładki Akwizycja i wybierz utwórz nowy eksperyment.
Teraz dodaj ścieżki obrazowania dla użytych fluoroforów. Dla każdego toru ustaw średnicę otworu konfokalnego na jedną jednostkę powietrza. Aby zoptymalizować moc lasera, wybierz pierwszy kanał i przełącz się na tryb skanowania na żywo.
Ustaw początkową moc lasera na niską wartość, a następnie wzmocnienie detektora na umiarkowany poziom w jego zakresie liniowym. Następnie stopniowo zwiększ moc lasera, aż struktury docelowe będą wyraźnie widoczne ponad tłem na obrazie na żywo. Ustaw rozmiar piksela za pomocą przycisku Nyquist w oprogramowaniu, aby automatycznie go obliczyć.
Następnie ustaw czas pikseli. Teraz wybierz tryb sekwencyjnego skanowania między ścieżkami, aby zminimalizować przesłuchy. Kliknij Snap, aby uzyskać pojedyncze zdjęcie.
Zapisz obraz z odpowiednimi metadanymi. Aby uzyskać spójne ustawienia w różnych przekrojach optycznych, potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są skonfigurowane na jednej optymalnej płaszczyźnie ogniskowej przed zdefiniowaniem stosu Z. Otwórz zakładkę Akwizycja i wybierz tryb Z-stack.
Zdefiniuj objętość, używając szybkiego skanowania na żywo, aby najpierw skupić się na najniższej strukturze, a następnie kliknąć Ustaw ostatni lub dolny. Ostrożnie dostosuj ostrość do najwyższej interesującej struktury i kliknij Najpierw lub Góra. Oprogramowanie wtedy wyświetli całkowitą głębokość.
Rozmiar stosu Z jest ustawiony tak, aby spełniał kryterium próbkowania Nyquista. Użyj przycisku Optimalny, aby obliczyć to automatycznie. Po skonfigurowaniu parametrów obrazowania dla każdego kanału zwiększ moc lasera lub nieznacznie wzmocnienie dla słabych sygnałów w porównaniu do pojedynczego dwuwymiarowego obrazu.
Rozpocznij akwizycję, aby zebrać cały stos obrazów. Do wizualizacji użyj natywnego modułu przetwarzania mikroskopu. Generuj projekcje maksymalnej intensywności, aby zobaczyć wszystkie sygnały ostrości w jednym dwuwymiarowym obrazie.
Następnie wykonuję renderowanie objętościowe za pomocą wbudowanych algorytmów oprogramowania, aby wygenerować trójwymiarową reprezentację. Dostosowuj jasność, krycie i oświetlenie w razie potrzeby. Następnie generować ortogonalne przekroje XZ i YZ, aby sprawdzić zasięg osiowy i rejestrację.
Wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne stałych komórek COS-7 wykazało, że jądra, mitochondria i mikrotubule były wyraźnie oznaczone z minimalnym nakładaniem się, co potwierdzało skuteczne sekwencyjne skanowanie i optymalną detekcję. Projekcja maksymalnej intensywności integruje sygnały ze wszystkich sekcji optycznych, podkreślając przestrzenny rozkład struktur oznaczonych fluorescencjo. Rekonstrukcja trójwymiarowa zapewnia świadomy głęboki widok architektury próbki.
Obrazowanie poklatkowe żywych komórek MEP 3B z mitochondriami tagowanymi EGFP jest porównywane między trybami. Klatki konfokalne w punktach czasowych pokazują wyraźne struktury, ale stopniową utratę sygnału. Standardowe klatki superrozdzielczości lub SR pokazują wyższą rozdzielczość, ale z czasem zwiększone wybielanie zdjęć.
Obrazy o wysokiej rozdzielczości lub SR-4Y zachowują stabilną fluorescencję nawet w późniejszych momentach. Wykres średniej intensywności fluorescencji EGFP w 100 punktach czasowych pokazuje, że tryb SR-4Y utrzymywał najbardziej stabilny sygnał. Wydajność obrazowania w ogniwach stałych COS-7 porównywano między trybami, a tryby superrozdzielczości zapewniały wyraźniejsze szczegóły strukturalne niż konfokalne.
Pomiar funkcji rozproszenia punktowego za pomocą 100-nanometrowych fluorescencyjnych kulek wykazał, że Airyscan SR wraz z późniejszą dekonwolucją stawów poprawił rozdzielczość zarówno boczną, jak i osiową w porównaniu z samym Airyscan SR. Protokół ten pozwala badaczom badać morfologię organelli, dynamikę cytoszkieletu oraz kolokalizację cząsteczek zarówno w komórkach stałych, jak i żywych z rozdzielczością około 120 nanometrów. Najważniejszym aspektem tego protokołu jest skrupulatne przygotowanie próbki przy użyciu wysokiej jakości szkła pokrywowego oraz zoptymalizowane barwienie zapewniające integralność sygnału dla przetwarzania superrozdzielczego.
Zgodnie z tą procedurą badacze mogą przeprowadzić ilościową analizę obrazów, taką jak pomiar stosunku sygnału do szumu lub kolokalizację, korzystając z dedykowanego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę zaawansowanych zastosowań w obrazowaniu za pomocą mikroskopu konfokalnego z skanowaniem laserowym zintegrowanego z wielokanałowym detektorem matrycowym. Umożliwia wielomodalne obrazowywanie od konfokalnego do superrozdzielczego (~120 nm), czyniąc wysokorozdzielcze obrazowywanie komórek bardziej dostępnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia
- Obrazowianie komórek
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Konwencjonalna mikroskopia napotyka na ograniczenia związane z dyfrakcją.
- Metody superrozdzielczego obrazowywania mogą być złożone i fototoksyczne.
- Ten protokół ma na celu zmniejszenie barier w obrazowaniu superrozdzielczym.
- Skupia się na detekcji wielokanałowej opartej na konfokalności dla lepszej dostępności.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy protokół do wysokorozdzielczego obrazowywania.
- Aby ułatwić badanie struktur komórkowych i subkomórkowych.
- Aby zwiększyć dostępność technik superrozdzielczych.
Zastosowane metody
- Ustawienia mikroskopu konfokalnego i kontrole środowiskowe.
- Konfiguracja parametrów obrazu dla optymalnych wyników.
- Sekwencyjne skanowanie, aby zminimalizować przesłuchiwanie między kanałami.
- Zdobywanie i przetwarzanie obrazów do wizualizacji.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne obrazowywanie struktur komórkowych z minimalnym nakładaniem się.
- Wykazano lepszą rozdzielczość w trybach superrozdzielczych w porównaniu z konfokalnym.
- Podkreślono znaczenie skrupulatnej przygotowania próbki.
- Podano metody ilościowej analizy obrazów.
Wnioski
- Ten protokół pozwala na szczegółowe badanie morfologii i dynamiki organelli.
- Obsługuje zarówno obrazowywanie komórek martwych, jak i żywych.
- Badaczom udaje się osiągnąć rozdzielczość około 120 nm.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Super-resolution confocal microscopy with multiplex detection enables nanoscale visualization of subcellular structures while reducing phototoxicity and operational complexity. This protocol supports high-content, quantitative imaging workflows essential for early discovery, target validation, and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The integrated platform and shared management model facilitate scalable, reproducible imaging across diverse research teams and portfolio projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of organelle morphology and cytoskeleton dynamics at ~120 nm resolution.
- Supports functional target validation by quantifying molecular colocalization and spatial distribution.
- Reduces mechanistic ambiguity through high signal-to-noise imaging of subcellular processes.
- Facilitates predictive confidence in early-stage biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream phenotypic screening and compound evaluation.
- Standardizes imaging parameters for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables multiplexed, multicolor fluorescence detection for complex assay development.
- Delivers quantitative outputs suitable for automated image analysis and screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling both fixed and live cell imaging.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions based on quantitative subcellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, screening, and translational research by providing a unified imaging workflow from confocal to super-resolution modes.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via nanoscale imaging of cellular structures.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through standardized, multiplexed imaging protocols.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as signal-to-noise ratio and colocalization for robust data analysis.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and disease model validation with high-resolution, multimodal imaging.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, shared resource model for sustainable imaging infrastructure across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust quantitative imaging.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, sample preparation, and image analysis.
- Needs access to multiplexed confocal platforms and computational processing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of imaging parameters and metadata management.
- Adaptable to both fixed and live cell models with attention to phototoxicity and staining optimization.
- Dependent on high-quality cover glass and optimized sample preparation for super-resolution performance.
