Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy
27 marca 2026
Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.
Moje badania koncentrują się na ustanowieniu ustandaryzowanego workflow krio-ET, umożliwiającego in-situ analizę strukturalną grubych tkanek, takich jak hipokamp myszy. Istniejące metody nie są niezawodne dla grubych tkanek, dlatego protokół ten integruje zoptymalizowane kroki do standaryzowanej analizy. Na początek umieść kroplę 10 L roztworu 10% sacharozy na czystą szklaną powierzchnię.
Szybko rozcinaj hipokamp świeżo uśpionej myszy. Za pomocą ostrego żyletki wycinaję małe kawałki tkanek o powierzchni 0,5 do 1 milimetra sześciennego. Używając wykałaczki lub szczoteczki drobnej, przenieś tkankę na przygotowane miedziane siatki TEM w środku wysokociśnieniowego do zamrażania.
Użyj 2-metylpentanu, aby utrzymać tkankę wilgotną i dostosować jej pozycję na siatce, jednocześnie minimalizując obciążenia mechaniczne, aby uniknąć uszkodzeń siatki. Następnie przykryj tkankę i siatkę tarczą miedzianą o średnicy 3 milimetrów. Aby zakończyć montaż, umieść na górze drugi wysokociśnieniowy nośnik mrażący, płaskim do dołu, aby utworzyć szczelną kanapkę z goframi.
I sprawdź parametry zamrożenia, aby upewnić się, że nie ma nieprawidłowości w przyrządzie. Upewnij się, że całkowity czas od sekcji tkanki do zamrożenia nie przekracza 90 sekund. Zdobądź nową siatkę o rozmiarze 300 siatki złota, która będzie służyć jako ostateczna siatka odbiorcza do procesu wyjmowania.
Pod mikroskopem stereoskopowym w temperaturze pokojowej delikatnie przypiąć siatkę do kompatybilnego pierścienia krio-FIB AutoGrid. Następnie przechowuj złożony AutoGrid bezpośrednio w suchym piecu, utrzymywany w temperaturze około 40 stopni Celsjusza, aby zminimalizować nagromadzenie się szronu przed użyciem. Podczas ciągłego zanurzania zespołu w ciekłym azocie, ostrożnie oddziel zszklejoną siatkę TEM od otaczających elementów zespołu gofrów.
Za pomocą schłodzonych, cienko obrażonych pęset, delikatnie rozdziel dwa nośniki mrażące pod wysokim ciśnieniem. Następnie, na wstępnie schłodzonej stacji roboczej do załadunku kriogenicznym, zamontuj izolowaną siatkę tkanek w drugim pierścieniu krio-FIB AutoGrid pod ochroną ciekłego azotu. Załaduj oba AutoGridy do wyznaczonych slotów uchwytu na próbkę promu kriotransferowego.
Ustawij każdy AutoGrid tak, aby nacięcie frezujące było skierowane na zewnątrz i ustawione pionowo, aby umożliwić niższy kąt frezowania. Utrzymuj w pełni załadowany prom zanurzony w ciekłym azocie lub utrzymywany w stanie wstępnie schładzonym aż do transferu do FIB-SEM. Załaduj stopień próbki do instrumentu za pomocą pręta próbkowego.
Po przejściu kriogenicznym do mikroskopu przejdź do siatki tkankowej przy niskim powiększeniu SEM. Następnie pokryj powierzchnię siatki platyną z częstotliwością 30 miliamperów przez 15 sekund, aby zapewnić przewodzącą ochronę. Nałóż organometalową platynową pokrywkę o grubości 0,5 do 1,0 mikrometra, używając systemu wtrysku gazu przez około 60 sekund.
Nałóż na powierzchnię siatki ostatnią warstwę platyny powlekaną sputterem z ciśnieniem 30 miliamperów przez 15 sekund. Korzystając z obrazu wiązki elektronów SEM, przejdź do wybranego obszaru zainteresowania na siatce tkanek. Aby ustawić próbkę do frezowania po stronie frontowej, wyreguluj stopień o około 110 stopni obrotu i 7 stopni pochylenia, aby powierzchnia próbki była pod kątem odpowiednim dla dostępu wiązki jonowej.
Dla frezowania rowowego zdefiniuj prostokątny rów otaczający blok tkanki docelowej, używając wiązki jonowej pracującej z napięciem 30 kilowoltów. Rozpocznij frezowanie w odległości od bloku, używając stosunkowo wysokiego prądu 15 nanoamperów, aby szybko usunąć materiał. Gdy ściany rowu zbliżają się do bloku z dokładnością do kilku mikrometrów, zmniejsz prąd wiązki jonowej do 7 nanoamperów, aby uzyskać precyzyjniejszą kontrolę frezowania.
Jedną stronę bloku pozostawij przymocowaną do materiału masowego, aby stworzyć tymczasową zaczepkę. Dla bloków tkankowych o szacowanej grubości większej niż 20 mikrometrów wykonaj krok frezowania podciętego od strony odwrotnej, aby ułatwić ostateczne wyjmowanie. Obróć scenę i dostosuj kąt, aby dostać się do dolnej części bloku.
Frezuj połączenie dolne za pomocą wiązki jonów skupionych przy napięciu 30 kilowoltów i prądzie 3 nanoamperów. Przefrezuj dno metalowego bloku, aby ściśle przylegało do bloku próbek. Precyzyjnie frezuj powierzchnię styku między próbką a blokiem złota, aby styk był bardziej napięty.
Aby przymocować próbkę do igły, upewnij się, że blok złota jest w bezpośrednim kontakcie z próbką docelową. Używając wiązki jonów skupionych o napięciu 30 kilowoltów i 0,5 nanoampera, wykonaj od 8 do 12 kolejnych wzorów frezowania na styku, aby zespawać blok złota z próbką. Aby wyjąć blok tkanki, odetnij pozostałą zaczepkę łączącą blok z próbką objętą za pomocą wiązki jonów skupionych.
Ostrożnie manewruj igłą mikromanipulatora, aby całkowicie unieść izolowany blok tkanki z dala od rowu i otaczającej siatki. Cofnij iglicę i przenieś blok do siatki odbiornika. Przesuń igłę mikromanipulatora do wcześniej schłodzonej siatki odbiorniczej o rozmiarze 300 metek.
Opuszczaj blok na wybrany kwadrat siatki. Rozdrobnij małe kryształki lodu na kratce, aby blok tkanki i siatka lepiej się przylegały. Obniż blok tkanki tak, aby stykał się tylko z siatką.
Przefrezuj kawałek o grubości 3 do 4 mikrometrów z bloku na warstwę siatki za pomocą wiązki jonowej. Następnie bezpiecznie zespawaj przełom przez frezowanie, stosując wzory przekroju czyszczącego po obu stronach złącza, a następnie ponownie nałóż przewodzącą i ochronną powłokę na powierzchnię siatki, jak pokazano wcześniej. W przypadku przerzedzania lamel, po ustawieniu kąta sceny określ ostateczną pozycję lamelli w gładkim obszarze bloku tkanki.
Wykonaj systematyczne frezowanie z wykorzystaniem prądów wiązki jonowej oraz kompensacji przechylenia określonych w przedstawionej tabeli. W odległości od 1 do 2 mikrometrów od lamelli opcjonalnie można frezować rów odprężający około 1,5 mikrometra, aby zapobiec zginaniu lub zginaniu lamelli. Po przygotowaniu lameli wykonuje się obrazy za pomocą mikroskopii krioelektronowej.
Bloki tkankowe przetwarzane metodą mrozu pod wysokim ciśnieniem metodą gofrową wykazywały jednolity i elektronowo przezroczysty wygląd. Rekonstruowane tomogramy rozstrzygnęły struktury mitochondrialne w środowisku komórkowym. Kompleksy makrocząsteczkowe, takie jak rybosomy, były wyraźnie rozdzielane w cytoplazmie.
W rekonstruowanych tomogramach widoczne były także cechy komórkowe cytoszkieletu i błon oraz kompleksy porów jądrowych. Struktury i cechy synaptyczne, w tym zapasy wapnia i struktury pochwy mieliny, były wyraźnie widoczne na tomogramach. Protokół ten umożliwia badaczom badanie rodzimej struktury zewnętrznej komórki bezpośrednio w złożonych środowiskach tkankowych.
Najważniejszym wyzwaniem w tym protokole krio-ET jest osiągnięcie jednolitej, wolnej od artefaktów witryfikacji grubych próbek tkanek. Po tej procedurze naukowcy mogą lokalizować obszary zainteresowania za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej lub technik znakowania korelacyjnej, a następnie przeprowadzić uśrednianie subtomogramów i analizę struktury w celu rozdzielenia kompleksów makrocząsteczkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
