Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore
7 lipca 2026
Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.
Badamy nad replikacją, utrzymaniem i dystrybucją samoreplikują się koliste elementy DNA, znane jako plazmidy, co wymaga określenia ich sekwencji. Ten protokół dotyczy kwestii pokrycia i dokładności związanych z sekwencjonowaniem długich odczytów poprzez wzbogacanie DNA plazmidowego i optymalizowanie metod montażu. Nasz protokół jest zaprojektowany do sekwencjonowania plazmidów w sytuacjach, w których sekwencja chromosomowa jest albo znana, albo nieistotna.
Aby rozpocząć, rozprowadź próbki na płytkach LB z wkrętem uzupełnionych odpowiednim antybiotykiem, aby wybrać odpowiedni marker oporu przenoszony przez plazmid. Inkubuje się płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zaszczepić trzy do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem z pojedynczej izolowanej kolonii.
Inkubuj kulturę z mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około osiem godzin lub do momentu osiągnięcia gęstości optycznej na 600 nanometrach jednej do dwóch. Następnie zaszczepić 400 mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem z 400 mikrolitri pożywki starterowej i inkubować, jak pokazano wcześniej. Następnie przenieść kulturę do odpowiednich butelek wirówkowych dla objętości kultury.
Wiruj przez 10 minut przy 4 200 G i ponownie zawieś pellet za pomocą objętości reagentów zalecanych przez producenta. Po lizie komórek i neutralizacji wiruj lizat przy 4 200 G przez 30 minut. Przenieś nadstan do nowej epruwetki i wiruj ponownie.
Przeprowadź równoważenie, mycie i elucję DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie zawieś opadnięte DNA w 100 mikrolitri wody wolnej od nukleaz, aby zmaksymalizować stężenie dla przygotowania biblioteki nanoporowej. Następnie, aby sprecyzować DNA, przygotuj rury testowe zgodnie z podaną tabelą.
Po kalibracji fluorometru włóż próbki do fluorometru i zapisz odczyty zgodnie z instrukcją urządzenia. Zaprogramuj termocykler do 30 stopni Celsjusza przez dwie minuty, następnie do 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Obróć i wymieszaj rozmrożone komponenty zestawu zgodnie z podaną tabelą.
Inkubuj rury PCR przygotowane do kodowania pasków za pomocą programu termocyklu. Następnie umieść rurki na lodzie, aby się ochłodziły. Złącz zakodowane próbki w czystej 1,5-mililitrowej epruwetce Eppendorf, upewniając się, że całkowita objętość nie przekracza 1000 mikrolitri.
Gdy kulki są wirowane, dodaj równą objętość kulek do zbiorczej próbki z kodami paskowymi. Mieszaj przez przekręcenie epruwetki, a następnie inkubację przez 10 minut. Następnie przemyj kulki jednym mililitritem 80% etanolu podczas trwania na magnesach.
Usuń etanol i powtórz raz. Zdejmij epruwetkę z magnesów. Zawieś kulki w buforze elucyjnym, używając odpowiedniej objętości w zależności od liczby używanych kodów paskowych i inkubację przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Sprecyzuj stężenie DNA za pomocą jednego mikrolitru elucjowanej próbki na fluorometrze, aby potwierdzić pomyślną przygotowanie biblioteki. Do ligowania adaptera przenieś 11 mikrolitrów biblioteki DNA do nowej epruwetki i oznaczyć ją. Następnie wymieszaj przedstawione komponenty w świeżej epruwetce, aby rozcieńczyć rozmrożony szybki adapter.
Następnie dodaj jeden mikrolitr rozcieńczonego szybkiego adaptera do 11 mikrolitrów biblioteki DNA i przekręć epruwetkę, aby wymieszać zawartość. Krótko wywiruj epruwetkę, aby upewnić się, że cała objętość znajduje się na dole i inkubować epruwetkę na blacie przez pięć minut. Przygotuj mieszaninę do wstępnego namoczenia komórki przepływowej w świeżej epruwetce z DNA i wymieszaj przez inwersję i pipetowanie.
Podnieś pokrywę urządzenia i włóż komórkę przepływową, stosując delikatną presję, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie. Po sprawdzeniu, czy nie ma bąbelek w środku lub w pobliżu portu wstępnego namoczenia, cofnij 20 do 30 mikrolitrów płynu, aby usunąć bąbelki. Następnie wciągnij 800 mikrolitrów mieszanki wstępnego namocowania i wlej ją do portu wstępnego namocowania, unikając bąbelek i pozostaw urządzenie na pięć minut.
Wymieszaj bibliotekę DNA z odpowiednią objętością kulek biblioteki w nowej epruwetce, jak to jest przedstawione tutaj. Wlej 200 mikrolitrów mieszanki wstępnej do portu wstępnego namocowania komórki przepływowej. Wyreguluj pokrywę portu próbki, aby odsłonić port.
Wlej 75 mikrolitrów biblioteki DNA z kulkami do portu próbki jedną kroplą na raz, pozwalając każdej kropli na wchłonięcie się przed dodaniem kolejnej. Następnie ponownie założyć pokrywę portu próbki i zamknąć port wstępnego namocowania. Po zamknięciu pokrywy urządzenia rozpocznij bieg sekwencjonowania.
Ustaw limit czasu działania w oparciu o liczbę plazmidów, które są wielokrotnie multiplexowane, z domyślnym czasem 48 godzin i maksymalnym 72 godzin. Wybierz tryb bardzo dokładnego wyznaczania zasad i odpowiednią opcję zestawu szybkie kod paskowy. Następnie wybierz surowe dane FAST5 lub POD5 i rozpocznij wyznaczanie zasad.
Aby wygenerować przefiltrowaną plików FASTQ do dal
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy schemat pracy dla sekwencjonowania nanoporowego, mający na celu maksymalizację wydajności uzyskiwania plazmidowego DNA oraz dokładności sekwencjonowania. Protokół obejmuje ekstrakcję plazmidów, szybkie kodowanie kreskowe (barcoding), ligację adapterów, sekwencjonowanie i asemblację sekwencji; jest on odpowiedni dla szerokiego zakresu wielkości plazmidów oraz poziomów zanieczyszczenia chromosomalnego. Metodę zademonstrowano z wykorzystaniem Escherichia coli jako organizmu modelowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia molekularna
- Genomika
- Mikrobiologia
Wstęp
- Sekwencjonowanie plazmidów jest niezbędne w badaniach genetycznych, ekspresji genów rekombinowanych oraz w eksperymentach z wychwytywaniem plazmidów.
- Tradycyjne metody sekwencjonowania mogą być ograniczone przez kontaminację chromosomalną i niską wydajność plazmidów.
- Sekwencjonowanie nanoporowe oferuje możliwość odczytów długich fragmentów oraz pozyskiwanie danych w czasie rzeczywistym.
- Wydajne przepływy pracy są niezbędne do optymalizacji przepustowości i dokładności sekwencjonowania plazmidów.
Cel badania
- Opracowanie i opisanie niezawodnego schematu postępowania w sekwencjonowaniu plazmidów z wykorzystaniem nanoporów.
- Maksymalizacja wydajności uzyskiwania plazmidowego DNA oraz dokładności sekwencjonowania.
- Umożliwienie efektywnego równoległego sekwencjonowania wielu próbek.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja plazmidowego DNA z klinicznych szczepów E. coli.
- Przygotowanie bibliotek przy użyciu szybkiego kodowania kreskowego (barcoding) i ligacji adapterów.
- Ładowanie bibliotek do komórki przepływowej nanoporowej w celu sekwencjonowania.
- Odczyt zasad (base calling) wykonywany w czasie rzeczywistym lub post-hoc.
- Asemblacja sekwencji przy użyciu programu Autocycler.
- Porównanie asemblacji z ruchliwością w żelu i asemblacjami dopracowanymi za pomocą krótkich odczytów (short-read polished).
Główne wyniki
- Asemblacje plazmidów odpowiadały rozmiarom wnioskowanym z mobilności w żelu.
- W dwóch trzecich przypadków asemblacje były zgodne lub zbliżone do asemblacji dopracowanych za pomocą short-read (tożsamość parowa w granicach 0,05%).
- Protokół obsługuje plazmidy o rozmiarach od 4 do 174 kb.
- Dopuszczalne zanieczyszczenie chromosomowe do 72% bez utraty dokładności.
- Równoległe sekwencjonowanie do 24 próbek przy zachowaniu optymalnego pokrycia.
Wnioski
- Ten schemat pracy umożliwia dokładne i wydajne sekwencjonowanie plazmidów z wykorzystaniem technologii nanoporowej.
- Jest on odpowiedni do weryfikacji plazmidów, ulepszania sekwencji plazmidowych uzyskanych metodą WGS oraz sekwencjonowania plazmidów przechwyconych drogą koniugacji.
- Protokół jest odporny na zanieczyszczenia chromosomalne i ma zastosowanie do plazmidów o różnych rozmiarach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Sekwencjonowanie plazmidów metodą nanoporową z odczytami długimi umożliwia weryfikację i składanie konstruktów plazmidowych z wysoką pewnością, wspierając krytyczną kontrolę jakości oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Ten schemat postępowania rozwiązuje problemy związane z kontaminacją chromosomalną i zmienną wydajnością plazmidów, zapewniając solidne i skalowalne rozwiązania dla rozwoju rekombinowanego DNA oraz wektorów do terapii genowej. Możliwość jego równoległego prowadzenia oraz tolerancja na mieszane wejściowe próbki DNA usprawniają wczesne etapy odkrywania i procesy przedkliniczne, usprawniając podejmowanie decyzji dotyczących portfolio projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną weryfikację zmodyfikowanych plazmidów na potrzeby badań funkcjonalnych i walidacji celów.
- Zmniejsza niejednoznaczność w identyfikacji konstruktów, wspierając minimalizację ryzyka mechanistycznego w biologii odkrywczej.
- Ułatwia szybką selekcję kandydackich konstruktów do dalszego screeningu lub ekspresji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane dane sekwencyjne dla plazmidów gotowych do analizy, co gwarantuje powtarzalność w kampaniach przesiewowych.
- Umożliwia równoległe sekwencjonowanie do 24 próbek, zwiększając przepustowość dla bibliotek konstruktów.
- Zapewnia ilościową dokładność sekwencji, umożliwiając wiarygodne porównywanie zmodyfikowanych wariantów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Poprawia ciągłość przejścia od etapu odkryć do badań przedklinicznych poprzez potwierdzenie integralności plazmidów w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Umożliwia weryfikację sekwencji plazmidów stosowanych w badaniach nad dostarczaniem genów lub biomarkerami.
- Wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez minimalizowanie niepewności związanych z sekwencją w modelach przedklinicznych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ten przepływ pracy oparty na nanoporach integruje procesy od wczesnej weryfikacji konstruktu, poprzez przesiewy, aż po walidację przedkliniczną, wspierając zarówno potoki badawcze oparte na hipotezach, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza wierność sekwencji plazmidu, zmniejszając ryzyko efektów poza celami w testach funkcjonalnych.
- Przesiewanie: Zapewnia weryfikację sekwencji konstruktów gotowych do analizy, wspierając odtwarzalną ocenę związków.
- Analityka: Dostarcza wysokiej dokładności ilościowych danych sekwencyjnych do porównań między próbkami i kontroli jakości.
- Badania translacyjne: Dostosowuje weryfikację sekwencji plazmidu do wymagań modeli przedklinicznych w badaniach ekspresji genów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, zrównolegloną możliwość sekwencjonowania, którą można dostosować do różnych programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach opartych na konstruktach i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje weryfikację plazmidów, toleruje wysokie zanieczyszczenie chromosomalne i wspiera przepływy pracy o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez zapewnienie integralności konstruktu przed dalszymi inwestycjami.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów opartych na genach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie ekstrakcji plazmidów, przygotowywania bibliotek oraz procedur sekwencjonowania nanoporowego.
- Wymaga infrastruktury obliczeniowej dostosowanej do potrzeb basecallingu w czasie rzeczywistym lub post-hoc.
- Korzysta ze zstandaryzowanych protokołów w celu zapewnienia powtarzalności między zespołami oraz porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych rozmiarów plazmidów i tła gospodarza, w tym przy wysokiej zawartości chromosomalnego DNA.
- Najlepiej sprawdza się w zastosowaniach, w których sekwencja chromosomalna jest znana lub nie jest wymagana.
