Name: Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania i montażu długich plazmidów za pomocą technologii Nanopore z użyciem szczepów Escherichia coli. Protokół zapewnia wysoką wydajność DNA i dokładność sekwencjonowania przy tolerancji na zanieczyszczenie chromosomalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni Steve Salipante (University of Washington) za hojne udostępnienie zestawu klinicznych szczepów E. coli opublikowanych w45. Ta praca została częściowo wsparta funduszami na badania nad mianowaniem na stanowisko Dyrektora ds. Innowacyjności i Rozwoju Przedsiębiorczości od UCSC dla MC oraz grantem University of California Alianza MX “Profilowanie genomowe izolowanych szczepów gruźlicy wśród populacji wysokiego ryzyka i podatnych na Meksyk: wgląd w transmisję i oporność na leki” dla MC.

1. Ekstrakcja DNA plazmidowego
UWAGA: Ten protokół został użyty do ekstrakcji DNA plazmidowego z klinicznej szczepu Escherichia coli oraz jego odpowiednich transkonjugantów za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA plazmidowego35. Szczegółowe protokoły dotyczące koniugacji można znaleźć w36. Protokół nadaje się zarówno do plazmidów wysoko-kopiowych, jak i nisko-kopiowych, o wielkości od ~3 kb do ~200 kb. Duże plazmidy wymagają szczególnej uwagi, ponieważ mają tendencję do posiadania niskiego wskaźnika kopii (nawet 1-2 kopie na komórkę), co ogranicza wydajność DNA. Aby to kompensować, protokół zaleca zwiększenie masy komórkowej i objętości buforów lizy i neutralizacji, aby zapewnić wystarczającą ilość DNA plazmidowego do wiązania z kolumną. Plazmidy do 200 kb wciąż mogą być odzyskane przy użyciu tego protokołu; jednak, jego przydatność do megaplazmidów (>200 kb) jest ograniczona.
<ol>
	<li>Ekstrakcja plazmidów
	<ol>
		<li>Dzień 1: Rozmazać próbki na agarowych płytkach Luria-Bertani (LB) uzupełnionych odpowiednim antybiotykiem w celu wyboru odpowiedniego markera oporu plazmidowego i inkubacji w 37 °C przez 24 h. 
		UWAGA: Dodać karbenicylinę (lub odpowiedni antybiotyk) do LB w końcowej koncentracji 100 µg/mL poprzez dodanie 1 µL 100 mg/mL roztworu początkowego na 1 mL pożywki.</li>
		<li>Dzień 2: Zainokuować 3-5 mL LB z odpowiednim antybiotykiem kulturą pojedynczej kolonii izolowanych z Dnia 1. Inkubować z mieszaniem w 37 °C przez ~8 h lub do osiągnięcia OD600 1-2. 
		UWAGA: Pomiar OD600: Wyzerować spektrofotometr świeżą pożywką LB zawierającą odpowiedni antybiotyk, a następnie przenieść 1 mL kultury do czystej kulwetki i zmierzyć OD przy 600 nm. Jeśli odczyt przekracza zakres liniowy, rozcieńczyć próbkę i ponownie zmierzyć.</li>
		<li>Zainokować 400 mL LB uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem z 400 µL starteru z Dnia 2. Inkubować z mieszaniem w 37 °C przez 8-12 h lub do osiągnięcia OD600 1-2 (jak opisano wcześniej). 
		UWAGA: Zwiększyć objętość kultury powyżej 400 mL, jeśli OD600 nie osiągnie 1-2 w ciągu 12 h. Aby zmniejszyć ryzyko utraty plazmidu lub rearanżacji, ogranicz przelewanie w kulturze tak bardzo, jak to możliwe, i utrzymuj selekcję antybiotykową na wszystkich etapach wzrostu. Zwiększ objętość kultury tylko wtedy, gdy pożądana jest wyższa wydajność DNA.</li>
		<li>Dzień 3: Przenieść kulturę do odpowiednich butelek do wirówki dla objętości kultury. Wirować przez 10 min. w 4200 x g, a następnie ponownie zawiesić osadek za pomocą objętości reagentów zalecanych przez producenta według następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/70202/70202eq1.jpg" style="margin: auto;" /> 
		UWAGA: Przykład: Do zlizania 400 mL kultury bakterii o niskiej kopii (OD600 = 2) odpowiednie objętości buforów lizy RES, LYS i NEU wynoszą po 16 mL. 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/70202/70202eq2.jpg" style="margin: auto;" /> 
		UWAGA: Jeśli objętości reagentów do zawieszenia, lizy lub neutralizacji nie są odpowiednio skalowane do całkowitej biomasy kultury (OD600  × Objętość, czyli ODV), liza może być niekompletna, neutralizacja nieefektywna, a tworzenie osadu nadmiernie intensywne. Może to prowadzić do niższej wydajności plazmidu, zmniejszonej czystości i potencjalnego zatykania kolumn oczyszczających. Proporcjonalne skalowanie objętości buforów, zgodnie z wzorem producenta (krok 1.1.4.), zapewnia efektywną lizję, pełną neutralizację i spójne odzyskiwanie wysokiej jakości DNA plazmidowego.</li>
		<li>Wykonać liza komórek, zwilżenie filtra za pomocą odpowiedniego buforu i neutralizację zgodnie z instrukcjami zestawu. 
		UWAGA: Ułożyć dwa filtry, jeśli objętość osadu jest duża, dostosowując bufor proporcjonalnie. Wykonać dodatkowe kroki wirowania, jeśli nadstan pozostaje mętny. Po neutralizacji, duża objętość osadu może wymagać dodatkowych kroków wirowania. Jest to przypadek większości klinicznych próbek E. coli, prawdopodobnie ze względu na skłonność do tworzenia biofilmu w kulturze37, co wiąże się z wydzielania grubszego podłoża38. Nadmiar osadu w lizacie może zatykać kolumnę, przedłużać czas sączenia i potencjalnie zanieczyszczać próbkę białkami. Jeśli nadstan jest czysty, te dodatkowe kroki mogą nie być konieczne.</li>
		<li>Wirować lizat w 4200 x g przez 30 min. Przenieść nadstan do nowej probówki i ponownie wirować przez 30 min. Jeśli nadstan pozostaje mętny po tych wirowaniach (Rysunek 2), wykonać dodatkowe wirowanie w 4200 x <em

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Identyfikacja i charakterystyka plazmidów ma duże znaczenie dla zdrowia publicznego, mikrobiologii klinicznej i ekologii mikroorganizmów, ponieważ ułatwiają one utrzymanie i rozprzestrzenianie genów adaptacyjnych w różnych środowiskach ekologicznych1,5 i służą jako platformy dla przyspieszonej ewolucji4. Wprowadzenie technologii NGS pozwoliło na sekwencjonowanie w wysokiej przepustowości genomów izolatów mikroorganizmów i populacji, chociaż identyfikacja po montażu kompletnych plazmidów lub kontigów pochodzących z plazmidów wymaga ogólnie długich sekwencji, ponieważ krótkie dane sekwencjonowania nie są w stanie rozdzielić obszarów powtarzających się większych niż wielkość odczytów. ONT stało się bardzo popularnym podejściem do sekwencjonowania długich odczytów, z zastosowaniami, które wykraczają poza sekwencjonowanie całych genomów i metagenomikę, a które obejmują weryfikację sekwencji plazmidów, wykrywanie i charakteryzację modyfikacji epigenetycznych, sekwencjonowanie RNA i ocenę właściwej niestabilności tandemowych tablic genów (przegląd w12,49).
Poniżej, badacze przedstawiają przepływ pracy dla sekwencjonowania plazmidów za pomocą ONT, zaprojektowany dla sytuacji, w których sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Powodem jest to, że ekstrakcja plazmidów jest pracochłonna, kosztowna i czasochłonna (ponieważ populacja gospodarza musi być hodowana w kulturze i przetworzona), a sekwencjonowanie całego genomu za pomocą technologii nanoporowej jest często wystarczające, aby uzyskać kompletne montaże plazmidów, zapewniając ich kontekst genomowy. Przykłady, w których protokół jest pomocny, obejmują weryfikację sekwencji plazmidów w kontekście inżynierii genetycznej plazmidów50,51, poprawę dokładności sekwencji plazmidów już uzyskiwanych przez WGS24, lub charakteryzację plazmidów, które zostały przechwycone z próbek klinicznych lub środowiskowych przez koniugację.
Ekstrakcja DNA z próbek klinicznych i środowiskowych może wymagać niektórych dostosowań. Tutaj autorzy raportują, że niektóre z użytych szczepów klinicznych produkowały matrycę biofilmu, która zasłaniała filtry, wymagając wielokrotnych etapów osadzania i czasami wymagająca dodania dwóch filtrów. Również, aby sekwencjonować plazmidy koniugacyjne, potrzebna jest większa objętość kultury względem sekwencjonowania plazmidów wielokopianych, ponieważ naturalnie występujące średnie i duże plazmidy mają tendencję do posiadania niskiego liczby kopii plazmidów2.
Protokół pozwolił na sekwencjonowanie plazmidów o wielkości od 4 kb do 173 kb. Ten zakres leży w całości w specyfikacjach producenta (od 2 do 200 kb). Niedawno, badanie spojrzeć na 23 000 sekwencji plazmidów zdeponowanych w NCBI i znaleźć znaczące różnice wielkości w zależności od źródła, przy czym plazmidy pochodzenia ludzkiego mają najmniejszą średnią wielkość (76 kb), a plazmidy z gleby i roślin największą (odpowiednio 215 i 427 kb); plazmidy ze wszystkich pozostałych źródeł miały średnią wielkość od 79 do 147 kb, więc ten protokół powinien obejmować większość plazmidów, z możliwym wyjątkiem megaplazmidów52 i plazmidów pochodzenia gleby lub roślinnego3.
Autorzy dołączyli krok wzbogacania DNA plazmidowego, aby poprawić dokładność montażu DNA plazmidowego. Obecność dużych ilości DNA chromosomowego zasypuje pory komórkowe na komórce przepływowej sekwencjonowania niecelowymi odczytami, znacznie zmniejszając głębokość DNA plazmidowego. Krok wzbogacania DNA plazmidowego był już wdrożony w celu całkowitego montażu DNA plazmidowego w próbkach klinicznych dla wykrycia ARGs24. To pokazało znaczne poprawy w efektywności ukończenia montażu plazmidu z nanopore-only sekwencjonowaniem (78% kompletnych montażów względem benchmarku). Inne przykłady wystąpiły50,53,54.
Aby poprawić dokładność odczytu, dwa z tych badań użyło techniki opracowanej przez nanopore, nazywanej “paired basecalling na pseudopaired odczytach”50,53. To podejście polega na wyrównaniu surowych sygnałów elektrycznych z nićmi sense i antisense tej samej cząsteczki DNA, co prowadzi do poprawy dokładności o około rząd wielkości. Paired basecalling na pseudopaired odczytach jest kompatybilny z multiplexowaniem, o ile strategia pozwala na identyfikację nić przednich i tylnych tej samej cząsteczki. W ten sposób nie może być używany w plazmidach oczyszczonych z próbek o nieznanym komplecie plazmidów lub zawierających mieszaninę plazmidów. Należy zauważyć, że liczba plazmidów w genomie zazwyczaj waha się od 0 do 7 plazmidów (szczególnie w izolatów klinicznych)2,55.
Badacze

Plazmidy są samoreplikującymi się fragmentami DNA, powszechnie występującymi u bakterii. Ich wielkość jest bardzo zmienna, waha się od <800 bp do 2,5 Mbp, a zazwyczaj mają rozkład dwuizbowy, z mniejszym szczytem odpowiadającym wielokopianym, niekoniugacyjnym plazmidom i większym szczytem odpowiadającym plazmidom o niskiej kopii, często koniugacyjnych1,2. Plazmidy odgrywają kluczowa rolę w ekologii mikrobiologicznej, przenosząc geny, które pomagają ich gospodarzom przystosować się do wyzwań środowiskowych lub uzyskać dostęp do nowych nisz ekologicznych. Plazmidy służą również jako platformy dla przyspieszonej ewolucji, zapewniając zwiększoną plastyczność genetyczną i pośrednicząc w poziomym przenoszeniu genów między szczepami, gatunkami, rodzajami, a nawet rodzinami3,4. Analizy sieciowe i porównawcze genomów potwierdziły rolę środowiskowego rezystomatu jako trwałego rezerwuaru klinicznie istotnych genów odporności na antybiotyki (ARG), ułatwiając w ten sposób ich utrzymanie i rozprzestrzenianie się w różnych środowiskach ekologicznych5. Śledzenie plazmidów i ich zawartości, czyli genów odporności na antybiotyki i genów wirulencji, pomaga w identyfikacji ścieżek transmisji6. Dlatego identyfikacja i charakterystyka plazmidów jest bardzo istotna dla wielu zastosowań w zdrowiu publicznym, mikrobiologii klinicznej i biotechnologii.
Wprowadzenie technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), które umożliwiają wysokowydajne sekwencjonowanie nieznanych szablonów DNA, otworzyło drogę do genomowej charakterystyki izolowanych mikrobów. Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) umożliwia śledzenie pojawiania się, rozprzestrzeniania się i przenoszenia nowych patogenów, szczepów odpornych na leki i wariantów unikających szczepionek. Jest również coraz częściej wykorzystywane do pomocy w identyfikacji ścieżek transmisji podczas klinicznych wybuchów epidemii, potencjalnie informując o interwencjach w celu zapobiegania przyszłym wybuchom7. Wreszcie, WGS pozwala na profilowanie genów ARG, które mogą informować o decyzjach terapeutycznych8, chociaż łączenie ARG z jakościowymi i ilościowymi fenotypami odporności na antybiotyki jest nadal w trakcie realizacji9.
Jednak krótkie dane sekwencjonowania (SR), które są zazwyczaj produkowane przez WGS w skali, są ogólnie w zakresie 400–500 bp. Ta wielkość jest krótsza niż wielkość większości Mobilnych Elementów Genetycznych (MGEs) i dlatego nie może ich rozdzielić10. In silico identyfikacja sekwencji plazmidów w danych WGS jest dalsza skomplikowana przez niekompletne pokrycie i ze względu na wspólne sekwencje między plazmidami a także między bakteriami chromosomami i innymi plazmidami10. W konsekwencji, skomplikowane złożenia są często rozbite i niekompletne, co sprawia, że ich subgenomowa lokalizacja (chromosomalna lub plazmidowe) jest niemożliwa do przypisania10.
Technologia sekwencjonowania długich odczytów (LR) generuje bardzo ciągłe złożenia, które rozciągają się na większą liczbę powtórzeń, co znacznie ułatwia produkcję kompletnych złożeń plazmidowych. Są zasadniczo dwa rodzaje długich, jednocząsteczkowych technologii sekwencjonowania11,12. Jedna z tych metod, sekwencjonowanie nanoporowe, staje się popularna w mikrobiologii ze względu na niski koszt, szybkie czasy realizacji i przydatność dla środowisk o ograniczonych zasobach13,14.
Urządzenia sekwencjonowania nanoporowego używają komórek przepływowych zawierających tablice tysięcy nanoporów. DNA jest wczytywane do komórki przepływowej, otwierane przez białko motoryczne z aktywnością helikazy i przepływa przez nanopory napędzane różnicą prądu. Gdy nukleotydy w danym pojedynczym łańcuchu przechodzą przez pojedyncze nanopory, prąd jest zakłócany, co wytwarza charakterystyczny sygnał, który jest mierzony przez elektroniczny czujnik podłączony do każdego poru. Ten sygnał jest dekodowany za pomocą algorytmów basecallingu, a wynikowe dane są zbierane i analizowane dalej przy użyciu różnych narzędzi bioinformatycznych.
W porównaniu z podejściami SR-sekwencjonowania, sekwencjonowanie nanoporowe ma tendencję do produkowania niższej jakości odczytów (niższe wyniki Q) i generowania wstawień/delecji w sekwencjach homopolimerów podczas analizy danych elektrycznych (basecallingu)15. Zauważono również, że pobliska metylacja w natywnym DNA może powodować systematyczne błędy w basecallingu16. Powszechnie stosowanym rozwiązaniem jest dołączenie danych SR do korekcji błędów po montażu. Jednak ten proces (znany jako “polerowanie”) zwiększa koszt i kompleksowość17. Zwiększenie pokrycia sekwencjonowania może również poprawić dokładność, ale nie zawsze jest to technicznie osiągalne.</p

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>1.5 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>15 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>250 mL sterile flasks&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424R-PR-R</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R-P-R</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Disposable Inoculating Loops: 1 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Electronic Digital Scale</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-355-720</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Ethanol-resistant markers</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Flow cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Wszelkie rękawiczki nitrylowe działają</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP26184</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>MinION Sequencing Device&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI Plasmid DNA Extraction Kit</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube racks</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp;R96PCRFSP</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>PCR tubes: (0.2 mL)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Program autocycler v0.5.2</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bcftools v1.22</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools team)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bwa v0.7.19</td><td>Heng Li, originally at the Broad Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program canu v2.3</td><td>University of California, Davis &amp; Pacific Biosciences collaborators</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program flye v2.9.6</td><td>University of California, San Diego (Pavel Pevzner lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program medaka v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program metamdbg&nbsp;v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program miniasm v0.3</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minipolish&nbsp; v0.2.0&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program racon v1.5.0</td><td>Genome Institute of Singapore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program samtools v1.22.1</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools project)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; Assay Tubes</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>Set of micropipettes that dispense between 1 &ndash; 10 &mu;L (P10), 2 &ndash; 20 &mu;L (P20), 20 &ndash; 200 &mu;L (P200) and 200 &ndash; 1000 &mu;L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Micropipety powinny być skalibrowane</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Sterilized tips for 10 &mu;L, 200 &mu;L and 1000 &mu;L&nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221052</td><td>Może być zastąpiony inną marką</td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu nanopore

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

Niniejsze badanie opisuje proces sekwencji nanopore przeznaczony do maksymalizacji wydajności DNA plazmidowego i dokładności sekwencjonowania. Badacze omawiają każdy krok procesu, który obejmuje ekstrakcję DNA plazmidowego, przygotowanie biblioteki z szybką kodowaniem kreskowym i ligowaniem adapterów, załadowanie biblioteki na komórkę przepływową do sekwencjonowania, wyznaczanie zasad (w czasie rzeczywistym lub pocztowy) oraz montaż sekwencji przy użyciu Autocycler. Autorzy określają również wymagania sprzętowe, które w dużej mierze zależą od tego, czy wyznaczanie zasad odbywa się w czasie rzeczywistym. Autorzy sekwencjonowali plazmidy oczyszczone z dziesięciu szczepów klinicznych przy użyciu tego procesu. Aby wyeliminować różnice pomiędzy szczepami komórek gospodarza jako zmienną, autorzy  również sprzężyli te kliniczne szczepy ze wspólnym szczepem odbiorczym i sekwencjonowali transkonjugaty. Eksperymenty te wyprodukowały montaże plazmidowe, które pasują do wielkości plazmidów wywnioskowanych z mobilności w żelu i które, w 2/3 przypadków, pasują również do krótkich, wypolerowanych montaży czyli są w granicach 0,05% identyczności par sekwencji. Wzbogacanie sekwencji DNA plazmidowego maksymalizuje również wydajność sekwencjonowania plazmidów, pozwalając na równoległe sekwencjonowanie do 24 próbek przy optymalnym pokryciu. Ten protokół jest odpowiedni dla plazmidów o wielkości od 4 do 174 kb i toleruje do 72% zanieczyszczenia chromosomowego bez wpływu na dokładność. Ten protokół jest idealny w sytuacjach, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest interesująca, na przykład dla weryfikacji sekwencji plazmidowych, poprawy dokładności plazmidowych sekwencji już uzyskanych przez WGS, lub sekwencjonowania plazmidów uchwyconych przez koniugację. Organizmem użytym do zilustrowania tej pracy jest Escherichia coli, który jest reprezentatywny dla gospodarzy stosowanych do rekombinowanej ekspresji genów i dla uchwycenia plazmidów przez koniugację.

Kliniczne szczepy E. coli 
Aby zilustrować zastosowanie ONT do sekwencjonowania plazmidów z klinicznych szczepów, autorzy sekwencjonowali 10 szczepów, które były hojnym darem Dr. Stephen Salipante z University of Washington. Te szczepy były częścią kolekcji 312 szczepów pochodzących z krwi lub moczu, szczepów E. coli patogennego poza przewodem pokarmowym (ExPEC), uzyskanych w trakcie rutynowej opieki klinicznej w University of Washington Medical Center45.
Koniugacja plazmidów i charakterystyka przez test mobilności w żelu 
Badaczom przeprowadzili także test koniugacji za pomocą szczepu E. coli LMB100 jako odbiorcy. Koniugacja to proces prowadzący do transferu plazmidu obecnego w komórce (dawcy) do innej komórki (zwanej odbiorcą)46. Transfer wymaga kontaktu fizycznego między dwoma komórkami i jest zwykle wykrywany za pomocą markerów wskazujących na obecność plazmidu koniugacyjnego w komórkach odbiorczych. Pozwoliło to autorom wyeliminować różnice w szczepie żywiciela jako zmienną i przedstawić zastosowanie protokołu do sekwencjonowania plazmidów uzyskanych przez przechwytywanie plazmidów (metoda stosowana do profilowania plazmidów z danej niszy ekologicznej). Wszystkie testy koniugacji wyprodukowały transkonjuganty, potwierdzając obecność koniugacyjnego plazmidu w dawcy. Protokół, którego autorzy zastosowali, jest opisany w36. Grupa zidentyfikowała plazmidy obecne w szczepach dawcy i odbiorcy i oszacowała ich mobilność za pomocą elektroforezy w polu pulsującym (PFGE). Lista dziesięciu reprezentatywnych szczepów dawcy jest przedstawiona w Tabeli 8, a oszacowane rozmiary plazmidów obecnych w nich są wymienione w trzeciej kolumnie. Plazmidy spoza zakresu rozdzielczości żelu PFGE są wykluczone z tej tabeli, ale badacze byli w stanie skonstruować kilka mniejszych plazmidów o wielkości około 4kb (nie pokazano).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szczep dawcy</td>
			<td>Plazmida</td>
			<td>Oszacowany rozmiar PFGE</td>
			<td>Długość montażu</td>
			<td>Średnia głębokość</td>
			<td>głębokość 0 bp</td>
			<td>Pokrycie %</td>
			<td>Zmienione pozycje</td>
			<td>Dokładność przed SR  %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_08 
			_0081</td>
			<td>pblood_08_ 
			0081_1</td>
			<td>170000</td>
			<td>171829</td>
			<td>100</td>
			<td>99.941803</td>
			<td>54</td>
			<td>0.0314</td>
			<td>99.9686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_08 
			_0081</td>
			<td>pBlood_08_ 
			0081_2</td>
			<td>82000</td>
			<td>85576</td>
			<td>46.9</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>2</td>
			<td>99.9977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_d-08 
			_0094</td>
			<td>pBlood_d-08 
			_0094</td>
			<td>179000</td>
			<td>173334</td>
			<td>382.6</td>
			<td>3121</td>
			<td>98.19943</td>
			<td>2,347</td>
			<td>98.646</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_08 
			_1447</td>
			<td>pBlood_08 
			_1447</td>
			<td>97000</td>
			<td>99624</td>
			<td>36.2</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_10 
			_0913</td>
			<td>pBlood_10 
			_0913_1</td>
			<td>70000</td>
			<td>71788</td>
			<td>49</td>
			<td>4</td>
			<td>99.994428</td>
			<td>188</td>
			<td>99.7381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_10 
			_0913</td>
			<td>pBlood_10 
			_0913_2</td>
			<td>112000</td>
			<td>118727</td>
			<td>41.2</td>
			<td>126</td>
			<td>99.893874</td>
			<td>276</td>
			<td>99.7675</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_1 
			1_184</td>
			<td>pBlood_11 
			_184_1</td>
			<td>150000</td>
			<td>146583</td>
			<td>65.1</td>
			<td>287</td>
			<td>99.804206</td>
			<td>134</td>
			<td>99.9086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_11_184</td>
			<td>pBlood_11 
			_184_2</td>
			<td>75000</td>
			<td>74263</td>
			<td>82.1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>32</td>
			<td>99.9569</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood_2011 
			_0238</td>
			<td>pBlood_ 
			2011_0238</td>
			<td>170000</td>
			<td>167286</td>
			<td>110.9</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upec_108</td>
			<td>pUPEC_108</td>
			<td>130500</td>
			<td>131039</td>
			<td>103.9</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upec_134</td>
			<td>pUPEC_134</td>
			<td>160500</td>
			<td>157

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

The present study describes a workflow for nanopore sequencing designed to maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy. Researchers cover each step ...

Badamy nad replikacją, utrzymaniem i dystrybucją samoreplikują się koliste elementy DNA, znane jako plazmidy, co wymaga określenia ich sekwencji. Ten protokół dotyczy kwestii pokrycia i dokładności związanych z sekwencjonowaniem długich odczytów poprzez wzbogacanie DNA plazmidowego i optymalizowanie metod montażu. Nasz protokół jest zaprojektowany do sekwencjonowania plazmidów w sytuacjach, w których sekwencja chromosomowa jest albo znana, albo nieistotna.Aby rozpocząć, rozprowadź próbki na płytkach LB z wkrętem uzupełnionych odpowiednim antybiotykiem, aby wybrać odpowiedni marker oporu przenoszony przez plazmid. Inkubuje się płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zaszczepić trzy do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem z pojedynczej izolowanej kolonii.Inkubuj kulturę z mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około osiem godzin lub do momentu osiągnięcia gęstości optycznej na 600 nanometrach jednej do dwóch. Następnie zaszczepić 400 mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem z 400 mikrolitri pożywki starterowej i inkubować, jak pokazano wcześniej. Następnie przenieść kulturę do odpowiednich butelek wirówkowych dla objętości kultury.Wiruj przez 10 minut przy 4 200 G i ponownie zawieś pellet za pomocą objętości reagentów zalecanych przez producenta. Po lizie komórek i neutralizacji wiruj lizat przy 4 200 G przez 30 minut. Przenieś nadstan do nowej epruwetki i wiruj ponownie.Przeprowadź równoważenie, mycie i elucję DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie zawieś opadnięte DNA w 100 mikrolitri wody wolnej od nukleaz, aby zmaksymalizować stężenie dla przygotowania biblioteki nanoporowej. Następnie, aby sprecyzować DNA, przygotuj rury testowe zgodnie z podaną tabelą.Po kalibracji fluorometru włóż próbki do fluorometru i zapisz odczyty zgodnie z instrukcją urządzenia. Zaprogramuj termocykler do 30 stopni Celsjusza przez dwie minuty, następnie do 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Obróć i wymieszaj rozmrożone komponenty zestawu zgodnie z podaną tabelą.Inkubuj rury PCR przygotowane do kodowania pasków za pomocą programu termocyklu. Następnie umieść rurki na lodzie, aby się ochłodziły. Złącz zakodowane próbki w czystej 1,5-mililitrowej epruwetce Eppendorf, upewniając się, że całkowita objętość nie przekracza 1000 mikrolitri.Gdy kulki są wirowane, dodaj równą objętość kulek do zbiorczej próbki z kodami paskowymi. Mieszaj przez przekręcenie epruwetki, a następnie inkubację przez 10 minut. Następnie przemyj kulki jednym mililitritem 80% etanolu podczas trwania na magnesach.Usuń etanol i powtórz raz. Zdejmij epruwetkę z magnesów. Zawieś kulki w buforze elucyjnym, używając odpowiedniej objętości w zależności od liczby używanych kodów paskowych i inkubację przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Sprecyzuj stężenie DNA za pomocą jednego mikrolitru elucjowanej próbki na fluorometrze, aby potwierdzić pomyślną przygotowanie biblioteki. Do ligowania adaptera przenieś 11 mikrolitrów biblioteki DNA do nowej epruwetki i oznaczyć ją. Następnie wymieszaj przedstawione komponenty w świeżej epruwetce, aby rozcieńczyć rozmrożony szybki adapter.Następnie dodaj jeden mikrolitr rozcieńczonego szybkiego adaptera do 11 mikrolitrów biblioteki DNA i przekręć epruwetkę, aby wymieszać zawartość. Krótko wywiruj epruwetkę, aby upewnić się, że cała objętość znajduje się na dole i inkubować epruwetkę na blacie przez pięć minut. Przygotuj mieszaninę do wstępnego namoczenia komórki przepływowej w świeżej epruwetce z DNA i wymieszaj przez inwersję i pipetowanie.Podnieś pokrywę urządzenia i włóż komórkę przepływową, stosując delikatną presję, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie. Po sprawdzeniu, czy nie ma bąbelek w środku lub w pobliżu portu wstępnego namoczenia, cofnij 20 do 30 mikrolitrów płynu, aby usunąć bąbelki. Następnie wciągnij 800 mikrolitrów mieszanki wstępnego namocowania i wlej ją do portu wstępnego namocowania, unikając bąbelek i pozostaw urządzenie na pięć minut.Wymieszaj bibliotekę DNA z odpowiednią objętością kulek biblioteki w nowej epruwetce, jak to jest przedstawione tutaj. Wlej 200 mikrolitrów mieszanki wstępnej do portu wstępnego namocowania komórki przepływowej. Wyreguluj pokrywę portu próbki, aby odsłonić port.Wlej 75 mikrolitrów biblioteki DNA z kulkami do portu próbki jedną kroplą na raz, pozwalając każdej kropli na wchłonięcie się przed dodaniem kolejnej. Następnie ponownie założyć pokrywę portu próbki i zamknąć port wstępnego namocowania. Po zamknięciu pokrywy urządzenia rozpocznij bieg sekwencjonowania.Ustaw limit czasu działania w oparciu o liczbę plazmidów, które są wielokrotnie multiplexowane, z domyślnym czasem 48 godzin i maksymalnym 72 godzin. Wybierz tryb bardzo dokładnego wyznaczania zasad i odpowiednią opcję zestawu szybkie kod paskowy. Następnie wybierz surowe dane FAST5 lub POD5 i rozpocznij wyznaczanie zasad.Aby wygenerować przefiltrowaną plików FASTQ do dal

long-read-plasmid-sequencing-assembly-using-nanopore-sequencing-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.

Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.

Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę sekwencjonowania i montażu długich plazmidów za pomocą technologii Nanopore z użyciem szczepów Escherichia coli. Protokół zapewnia wysoką wydajność DNA i dokładność sekwencjonowania przy tolerancji na zanieczyszczenie chromosomalne.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Przeglądaj więcej filmów