Sekwencjonowanie plazmidów długich odczytów i montaż przy użyciu przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore
July 7th, 2026
Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanopór plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie ma znaczenia. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidowej i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.
Badamy się nad replikacją, utrzymaniem i rozpowszechnianiem samoreplikujących się kolistych elementów DNA, znanych jako plazmidy, co wymaga ustalenia ich sekwencji. Ten protokół dotyczy kwestii pokrycia i dokładności związanych z sekwencjonowaniem długich odczytów poprzez wzbogacanie DNA plazmidowego i optymalizację metod montażu. Nasz protokół jest zaprojektowany do sekwencjonowania plazmidów w sytuacjach, gdy sekwencja chromosomowa jest znana lub nieistotna.
Aby rozpocząć, rozsiewaj próbki na płytkach LB auger uzupełnionych odpowiednim antybiotykiem, aby wybrać odpowiedni marker oporu noszony przez plazmid. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zaszczep trzy do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem pojedynczą izolowaną kolonią.
Inkubować hodowlę z wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około osiem godzin lub do momentu, gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie jeden do dwóch. Następnie zaszczep 400 mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem 400 mikrolirami szczepu starterowego i inkubować jak wcześniej. Następnie przenieś hodowlę do odpowiednich butelek wirówkowych dla objętości kultury.
Wiruj przez 10 minut w temperaturze 4 200 G i zawieś osadu za pomocą objętości reagentów zalecanych przez producenta. Po lizie komórek i neutralizacji, wiruj lizat przez 30 minut w temperaturze 4 200 G. Przenieś nadstan do nowej probówki i ponownie wiruj.
Przeprowadź ekwilibracje, płukanie i elucję DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie zawieś osadzone DNA w 100 mikrolitrach wolnej od nukleazy wody, aby zmaksymalizować stężenie dla przygotowania biblioteki nanopore. Następnie, aby sprecyzować DNA, przygotuj rurki do badań zgodnie z prezentowaną tabelą.
Po kalibracji fluorometru włóż rurki z próbkami do fluorometru i zapisz odczyty zgodnie z instrukcjami urządzenia. Zaprogramuj termocykler do 30 stopni Celsjusza na dwie minuty, następnie do 80 stopni Celsjusza na dwie minuty. Obróć i wymieszaj rozmrożone komponenty zestawu zgodnie z prezentowaną tabelą.
Inkubować rurki PCR przygotowane do kodowania paskiem za pomocą programu termocyklera. Następnie połóż rurki na lodzie, aby się schłodziły. Złóż próbki z kodami kreskowymi w czystym 1,5-mililitrowym probówce Eppendorf, upewniając się, że całkowita objętość nie przekracza 1 000 mikrolitrów.
Gdy kulki są wirowane, dodaj równą objętość kul do złączonych próbek z kodami kreskowymi. Wymieszaj przez potrząsanie probówką, a następnie inkubować przez 10 minut. Następnie spłucz kulki jednym mililitrą 80% etanolu podczas utrzymywania ich na magnesach.
Usuń etanol i powtórz raz. Zdejmij probówkę z magnesu. Zawieś kulki w buforze elucyjnym, używając odpowiedniej objętości w zależności od liczby używanych kodów kreskowych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Zprecyzuj stężenie DNA za pomocą jednego mikrolitara elucydowanego próbki na fluorometrze, aby potwierdzić pomyślną przygotowanie biblioteki. Do ligowania adapterów, przenieś 11 mikrolitrów biblioteki DNA do nowej probówki i oznaczyć ją. Następnie wymieszaj przedstawione komponenty w świeżej probówce, aby rozcieńczyć rozmrożony szybki adapter.
Następnie dodaj jeden mikrolitry rozcieńczonego szybkiego adapteru do 11 mikrolitrów biblioteki DNA i potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość. Krótko wyśrodkuj probówkę, aby upewnić się, że cała objętość znajduje się na dole, i inkubować probówkę na blacie przez pięć minut. Przygotuj mieszaninę do wypełnienia komórki przepływowej w świeżej probówce DNA i wymieszaj poprzez inwersję i pipetowanie.
Podnieś pokrywę urządzenia i włóż komórkę przepływową, stosując delikatne ciśnienie, aby zapewnić prawidłowe umiejscowienie. Po sprawdzeniu obecności bąbelek wewnątrz lub przy porcie wypełniania, cofnij 20 do 30 mikrolitrów płynu, aby usunąć bąbelki. Następnie zasysaj 800 mikrolitrów mieszaniny wypełniającej i wlej ją do portu wypełniania, unikając bąbelek, i pozwól urządzeniu usiedzieć przez pięć minut.
Wymieszaj bibliotekę DNA z odpowiednią objętością kulek biblioteki w nowej probówce, jak pokazano tutaj. Włóż 200 mikrolitrów mieszaniny wypełniającej do portu wypełniania komórki przepływowej. Ustaw pokrywę portu próbki, aby odsłonić port.
Wlej 75 mikrolitrów biblioteki DNA z kulkami do portu próbki jedną kroplą na raz, pozwalając każdej kropli na wchłonięcie przed dodaniem kolejnej. Następnie ponownie zastosuj pokrywę portu próbki i zamknij port wypełniania. Gdy pokrywa urządzenia jest zamknięta, rozpocznij sekwencjonowanie.
Ustaw limit czasu uruchomienia na podstawie liczby plazmidów łączonych w wielokrotności, domyślnie 48 godzin i maksymalnie 72 godziny. Wybierz tryb super dokładnego wywoływania zasad i odpowiednią opcję zestawu szybkiej kodowania paskiem. Następnie wybierz surowe dane FAST5 lub POD5 i rozpocznij wywoływanie zasad.
Aby wygenerować sfil
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
