Name: Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę laktylacji lizyny specyficznej dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków. Ta technika umożliwia badanie funkcji białek i metabolizmu nowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (22377058), Interdyscyplinarne Finansowanie Biologii Syntetycznej w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej Uniwersytetu Chińskiego w Nankinie oraz Narodowe Specjalne Programy Wsparcia Talentów Wysokiego Poziomu (Program 10 000 Talentów) – Młode Talenty.

1. Bursztynowa mutageneza kodu kodonowego do kodowania genowego laktylizyny do genu docelowego
<ol>
	<li>Wprowadź bursztynowy kodon stop TAG na pozycji 89 genu hENO1 oraz pozycji 149 w genies fGFP poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce zgodnie z protokołem producenta, oczyszcz produkt PCR i wykonaj rekombinację homologiczną. Użyj następujących podkładów: ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATCGAG ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGACGTTCAGTTTCTTGTTCTTG sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTGTGAAGTTATACTCCAGC UWAGA: Dla specyficznego dla miejsca inkorporacji laktylowanej lizyny, docelowe miejsce powinno być zmutowane do bursztynowego kodonu stopowego (TAG) lub innych bezsensownych kodonów, a TAA lub TGA powinno być używane jako prawdziwy kodon stop.</li>
	<li>Rozmroz komórki kompetentne dla DH5α na lodzie, wymieszaj 5 μL produktu rekombinacji z 50 μL komórek i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Poddaj mieszankę szokowi cieplnej o temperaturze 45 sekund w temperaturze 42 °C, a następnie umieść ją na lodzie na 2-3 minuty. Dodaj 350 μL podłoża LB i inkubuj w temperaturze 37 °C z wstrząsem (220 rpm) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozłóż komórki na podgrzaną płytkę LB zawierającą ampicylinę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin. Wybierz dwie pojedyncze kolonie do sekwencjonowania Sanger, aby potwierdzić mutację.</li>
</ol>
2. Ekspresja białka mleczonego w komórkach E. coli
<ol>
	<li>Ko-transformuj 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli DH10B z około 100 ng pBad-ENO1-K89TAG każda, który koduje gen docelowy, oraz pEvol-MmKlacRS1 (plazmid Addgene # 232157), który koduje parę KlacRS i tRNA.</li>
	<li>Inkubuj mieszankę na lodzie przez 25 minut, poddawaj wstrząs cieplny w 42 °C przez 45 sekund, a następnie ponownie zalodźniaj przez 3 minuty. Dodaj 350 μL medium LB w temperaturze pokojowej, intensywnie wstrząśnij przy 220 obr./min przez 1 godzinę w 37 °C.</li>
	<li>Rozprowadz hodowlę komórkową na płytkę LB/z dodatkiem 100 μg/mL ampicyliny (amp100) i 50 μg/mL chloramfenikolu (Cm 50). Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.</li>
	<li>Wybierz jedną kolonię, aby zaszczepić 4 mL hodowlę startową i inkubować przez noc. Następnego dnia rozszerzyj nocną hodowlę do 400 mL LB/Amp100cm50 , a następnie intensywnie wstrząśnij przy 220 obr./min, 37 °C, aż OD 600 osiągnie 0,6-0,8.</li>
	<li>Indukuj 0,2% L-arabinozy i 1 mM Klac; inkubuj w temperaturze 30 °C, 220 obr./min przez dodatkowe 16 godzin.</li>
</ol>
3. Kodowanie genetyczne laktylizyny w komórkach HEK 293T
<ol>
	<li>Komórki nasienne w płytkach 12-dołków o gęstości 1 x10 5 komórek na dołek z 1 mL medium DMEM. Po 24 godzinach inkubacji, gdy konfluencja komórek osiągnie 70%-80%, przekonuj transfekcję. UWAGA: Zaleca się konfluencję 70%-80% dla transfekcji, natomiast testy formowania kolonii wymagają niższej gęstości siewu, co należy określić empirycznie.</li>
	<li>Aby przygotować rozcieńczony roztwór DNA, dodaj 0,75 μg pcDNA-sfGFP-N149TAG i pNeu-KlacRS (plazmid Addgene # 232155) w proporcji 1:1 do 38 μL bezsurowicowego DMEM z wysoką zawartością glukozy. Delikatnie pipetuj w górę i w dół lub krótko wymieszaj wiry.</li>
	<li>Aby przygotować rozcieńczony odczynnik transfekcyjny, należy dodać 2,25 μL odczynnika transfekcyjnego do 38 μL DMEM wolnego od surowicy z wysokoglukozą. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 3x-4x, żeby wymieszać. UWAGA: To, czy Opti-MEM może być stosowany, zależy od instrukcji producenta, ponieważ zawartość surowicy może zakłócać efektywność transfekcji.</li>
	<li>Natychmiast dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego roztworu DNA naraz. UWAGA: Nie mieszaj roztworów w odwrotnej kolejności.</li>
	<li>Natychmiast pipetuj w górę i w dół 3x-4x lub krótko w wir, żeby wymieszać. Inkubuj przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić powstanie kompleksów transfekcyjnych/DNA. UWAGA: Kompleks transfekcyjny/DNA powinien być użyty w ciągu 20 minut od przygotowania.</li>
	<li>Dodaj mieszankę transfekcyjną i DNA 50 μL kroplami na podłoże w każdym dołku i ujednolic mieszaninę, delikatnie mieszając płytkę.</li>
	<li>Po 6 godzinach po transfekcji zamień medium na świeże DMEM zawierające 1 mM Klac. Hodowla przez 24-48 godzin. UWAGA: Na podstawie naszych wcześniejszych danych, Klac w stężeniach 1-5 mM nie wykazał efektów cytotoksycznych na komórki26. Stężenie robocze Klac powinno być optymalizowane w oparciu o poziom ekspresji białka. Jeśli docelowe białko jest podatne na utratę modyfikacji laktylacji, zaleca się podawanie inhibitorów HDAC (np. trichostatyny A) lub inhibitora syrtuiny NAM (nikotynamidu).</li>
</ol>
4. Oczyszczanie białka mlecylnego za pomocą jego tagu w komórkach E. coli
<ol>
	<li>Komórki pobierz przez wirowanie w 6 900 x g przez 10 minut w 4 °C. Ponownie zawiesij w 50 mL buforu lizyzowego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lyse przez ultradźwięki na lodzie przez 3 sekundy pulsu, 8 sekund w odstępie 200 W przez 30 minut. Wirówka w 13 800 x g, 4 °C przez 30 minut, a następnie pobiera supernatant. UWAGA: Jeśli docelowe białko jest podatne na ścinanie mechaniczne, krok ultradźwiękowy można zastąpić łagodną lizą komórek przy użyciu opracowanego odczynnika do ekstrakcji białek odpowiedniego dla E. coli.</li>
	<li>Przefiltruj supernatant przez membranę o pojemności 0,45 μm, aby zebrać rozpuszczalne frakcje. Załaduj klarowane lizaty na kolumnę grawitacyjne Ni-NTA o pojemności 1 mL. Przemyj z około 5 mL Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 5 mM imidazolu), aż w eluacie nie zostanie wykryte białko wykrywalne. Eluć białko za pomocą 1 mL buforu B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazolu) przez 5 razy. Zachowaj wszystkie ułamki. Sprawdź eluowane białko szybkim testem Bradforda.</li>
	<li>Połącz oczyszczone frakcje białka i przeprowadź wymianę buforową do buforu magazynującego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Należy zaniedbać skoncentrowane białka do 50 μL w każdej probówce, zamrażać i przechowywać w temperaturze -80 °C do następnej analizy.</li>
</ol>
5. Charakterystyka biochemiczna białka mleczonego
<ol>
	<li>SDS-PAGE i Western Blotting<ol>
		<li>Rozdziel białko według SDS-PAGE (90 V przez 20 minut, potem 150 V przez 50 minut). Pofarbuj żel Coomassie Blue, podgrzej przez 15 sekund w mikrofalówce i odbarw roztworem odbarwiającym (40% etanolu absolutnego, 10% kwasu octowego lodowcowego i 50% wody dejonizowanej) na shakerze (50 obr./min, 15 min). Powtarzaj proces odbarwiania, aż pasma białkowe będą wyraźnie widoczne.</li>
		<li>Aktywuj membranę PVDF w metanolu na 1 minutę. Złóż stos transferowy w kolejności: gąbka, papier filtracyjny, żel, membrana, papier filtracyjny, gąbka. Przelew przeprowadź przy 250 mA przez 1 godzinę w buforze wstępnie schłodzonym. Zablokuj błonę 5% mlekiem odtłuszczonym na 1,5 godziny, a następnie myj 3 razy TBST (po 10 minut każda).</li>
		<li>Inkubować z pierwotnymi przeciwciałami (Anti-His 1:10 000; Lizyna anty-L-Laktylonowa 1:1 000) w temperaturze 4 °C w nocy. Pierz 3 razy TBST. UWAGA: Optymalne współczynniki rozcieńczenia powinny być określane empirycznie dla przeciwciał uzyskanych z różnych komercyjnych źródeł.</li>
		<li>Inkubuj z wtórnym przeciwciałem królika (1:10 000) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Pierz 3 razy TBST. Obraz z wykorzystaniem chemiluminescencji i zapisu danych w Image Lab.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizy spektrometrii mas<ol>
		<li>Do analizy masy w całości rozcieńcz białka do końcowego stężenia 0,1 μg/μL wodą zawierającą 0,1% kwasu mrówkowego (FA), a następnie poddaj je ultrawydajnemu systemowi chromatografii cieczowej (UPLC). Faza mobilna składała się z rozpuszczalnika A (0,1% FA w wodzie) i rozpuszczalnika B (acetonitrylu, ACN) o przepływie 0,3 mL/min.</li>
		<li>Zmierz masy cząsteczkowe hENO1-89Klac za pomocą spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości kwadrupolowej długości lotu (Q-TOF) z zakresem m/z ustawionym na 300-2000. Zbieraj i przetwarzaj wszystkie dane za pomocą oprogramowania MassLynx.</li>
		<li>Do analizy proteomicznej analizuj trawione lizaty komórkowe zgodnie z opisaniem wcześniej, używając nanoprzepływowego systemu chromatografii cieczowej sprzężonej z wysokorozdzielczym spektrometrem mas tribrid wyposażonym w analizator. Faza mobilna składała się z rozpuszczalnika A (0,1% aromatu aromatu w wodzie) i rozpuszczalnika B (ACN/woda, 8:2, v/v) z przepływem 300 nL/min.</li>
		<li>Oddziel peptydy na kolumnie kapilarnej C18 o odwróconej fazie (75 μm x 250 mm) z gradientem 90 minut: 3%-8% B (0-5 min), 8%-28% B (5-60 min), 28%-38% B (60-75 min), 38%-100% B (75-80 min) oraz 100% B (80-90 min). Uzyskaj spektra MS1 powyżej m/z 350-1800 z rozdzielczością 120 000 i celem AGC 4e5. Generuj widma MS2 poprzez fragmentację zderzeń wyższych energii (HCD) (energia kolizji = 32%), z pierwszą masą m/z 110, rozdzielczością 30 000 i celem AGC 5e4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej<ol>
		<li>Przemyj ogniwa 2 razy za pomocą wstępnie schłodzonego buforu PBS, a następnie wiruj w 1 380 x g przez 3 minuty po każdym myciu. Ponownie zawiesij pelet komórki uzyskany po wirowaniu w 500 μL buforu PBS i delikatnie pipetuj do wymieszania. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sterylną gazę o grubości 300 oczek, a filtrat zbieraj do rurki cytometrii przepływowej, aby zminimalizować zakłócenia ze strony agregatów komórkowych podczas detekcji. Przeanalizuj przygotowaną próbkę za pomocą cytometru przepływowego z podwójnymi laserami, z wzbudzeniem przy 405 nm i detekcją przy 488 nm dla odpowiadających sygnałów fluorescencyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+lactylation+drives+oncogenesis+by+facilitating+m6A+reader+protein+YTHDF2+expression+in+ocular+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma.</a> Genome Biol. 22 (1), 85(2021).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demethylzeylasteral+targets+lactate+by+inhibiting+histone+lactylation+to+suppress+the+tumorigenicity+of+liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells.</a> Pharmacol Res. 181, 106270(2022).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Royal+jelly+acid+suppresses+hepatocellular+carcinoma+tumorigenicity+by+inhibiting+H3+histone+lactylation+at+H3K9la+and+H3K14la+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites.</a> Phytomedicine. 118, 154940(2023).</li>
<li>Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate%2Flactylation+in+ocular+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Lactate/lactylation in ocular development and diseases.</a> Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+and+clinical+significance+of+lactylation+modification+in+digestive+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors.</a> Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactylome+analysis+suggests+lactylation-dependent+mechanisms+of+metabolic+adaptation+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma.</a> Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate-lactylation+hands+between+metabolic+reprogramming+and+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression.</a> Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diapause-like+colorectal+cancer+cells+induced+by+smc4+attenuation+are+characterized+by+low+proliferation+and+chemotherapy+insensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity.</a> Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+feedback+loop+between+inactive+VHL-triggered+histone+lactylation+and+PDGFR%CE%B2+signaling+drives+clear+cell+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression.</a> Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+lactate+promotes+resistance+to+bevacizumab+treatment+by+facilitating+autophagy+enhancer+protein+Rubcnl+expression+through+histone+H3+lysine+18+lactylation+%28H3K18la%29+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer.</a> Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+modulates+cellular+metabolism+through+histone+lactylation-mediated+gene+expression+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer.</a> Front Oncol. 11, 647559(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+homologous+recombination+repair+by+MRE11+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation.</a> Cell. 187 (2), 294-311 (2024).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycometabolic+reprogramming-induced+XRCC1+lactylation+confers+therapeutic+resistance+in+ALDH1A3-overexpressing+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma.</a> Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).</li>
<li>Liberti, M. V., Locasale, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+warburg+effect%3A+How+does+it+benefit+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The warburg effect: How does it benefit cancer cells.</a> Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).</li>
<li>Varner, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lactoyl-CoA+%28lactyl-CoA%29+by+liquid+chromatography+mass+spectrometry+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues.</a> Open Biol. 10 (9), 200187(2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+homologous+recombination+repair+by+MRE11+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation.</a> Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NBS1+lactylation+is+required+for+efficient+DNA+repair+and+chemotherapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance.</a> Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).</li>
<li>Zong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alanyl-trna+synthetase%2C+AARS1%2C+is+a+lactate+sensor+and+lactyltransferase+that+lactylates+p53+and+contributes+to+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis.</a> Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).</li>
<li>Ju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alanyl-tRNA+synthetase+AARS1+moonlights+as+a+lactyltransferase+to+promote+YAP+signaling+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer.</a> J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactylation+of+METTl16+promotes+cuproptosis+via+m6A-modification+on+FDX1+mRNA+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer.</a> Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+mitochondrial+protein+lactylation+to+limit+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation.</a> Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).</li>
<li>Lv, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+and+oncogenic+stimulation+of+K433+acetylation+promotes+PKM2+protein+kinase+activity+and+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization.</a> Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).</li>
<li>Okada, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation+regulates+the+interaction+between+proteins+and+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes.</a> Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).</li>
<li>Wan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+immonium+ion+of+lactyllysine+reveals+widespread+lactylation+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome.</a> Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).</li>
<li>Shao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+reveals+site-specific+lactylation+in+living+cells+reshapes+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions.</a> Nat Commun. 16 (1), 227(2025).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+%CE%B5-N-L-lactyllysine+for+detecting+delactylase+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells.</a> Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).</li>
<li>Ren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+scope+of+genetically+encoded+lysine+post-translational+modifications+with+lactylation%2C+%CE%B2-hydroxybutyrylation+and+lipoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation.</a> Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+unnatural+cells+with+a+21st+amino+acid+as+a+living+epigenetic+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor.</a> Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).</li>
<li>Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+code+expansion+in+stable+cell+lines+enables+encoded+chromatin+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification.</a> Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).</li>
<li>Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactylation+in+tumor+microenvironment+and+immunotherapy+resistance%3A+New+mechanisms+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges.</a> Cancer Lett. 627, 217835(2025).</li>
<li>Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammalian+cell+logic+gates+controlled+by+unnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids.</a> Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).</li>
<li>Italia, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+sulfation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells.</a> Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Tutaj opisujemy strategię specyficznej inkorporacji Klac w białkach zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Poprzez wprowadzenie bursztynowego kodona stopowego w pożądanej pozycji docelowego genu i współekspresję z ortogonalną parą KlacRS/tRNA w komórkach gospodarza, autentyczna lizyna laktylowa może być precyzyjnie włączana do białek w komórkach żywych, stanowiąc potężne narzędzie do badania biologii specyficznej dla laktylacji.
Wykazaliśmy wykonalność tego workflow, używ...

Laktylacja lizyny (Klac), pierwotnie zidentyfikowana na histonach, stała się kluczowym węzłem łączącym nieprawidłowy metabolizm nowotworów z regulacją epigenetyczną1. Nagromadzenie mleczanu wynikające z zwiększonej glikolizy tlenowej w komórkach nowotworowych stanowi metaboliczne podstawy laktylacji, umożliwiając mleczanowi działanie nie tylko jako produkt metaboliczny, ale także jako cząsteczka sygnalizująca, która bezpośrednio moduluje funkcję białka. Rosnące dowody wskazują, że laktylacja szeroko uczestniczy w inicjacji i progresji guza poprzez koordynację proliferacji komórek nowotworowych 2,3,4,5, przerzutów6, przeprogramowania metabolicznego7 oraz oporności terapeutycznej 8,9.
Na poziomie fenotypowym podwyższona lakttylacja jest ściśle związana ze zwiększoną agresywnością guza. Na przykład w raku nerki z komórek przezroczystych (ccRCC) laktilacja H3K18 sprzyja proliferacji i przerzutom poprzez zwiększenie regulacji receptora czynnika wzrostu β pochodzącego z płytek krwi (PDGFRβ), ustanawiając dodatnią pętlę sprzężenia zwrotnego między akumulacją mleczanu a sygnałem onkogennym10. Podobnie w raku jelita grubego (CRC) podwyższona lakttylacja H3K18 napędza progresję guza poprzez zwiększoną transkrypcję autofagii podobnej do Rubikonu (RUBCNL), co sprzyja dojrzewaniu autofagosomów i wspiera przeżycie komórek nowotworowych11.
Poza bezpośrednim wpływem na agresywność guza, laktylacja pośredniczy także w przeprogramowaniu metabolicznym guza poprzez modulację ekspresji i aktywności genów związanych z metabolizmem7. W niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC) laktylacja histonów obniża poziom enzymów związanych z glikolizą, jednocześnie zwiększając enzymy cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA), co zwiększa pobieranie glukozy przez komórki nowotworowe i pogłębia zaburzenia metaboliczne12. Konsekwentnie globalne profilowanie laktylomów pokazuje, że laktylacja preferencyjnie celuje w enzymy zaangażowane w centralne szlaki metabolistyczne, w tym metabolizm glukozy, cykl TCA, metabolizm aminokwasów i kwasów tłuszczowych, a te modyfikacje silnie korelują z agresywnymi fenotypami nowotworowymi7.
Co istotne, biologiczne konsekwencje laktylacji są silnie zależne od miejsca, a ta modyfikacja stała się kluczowym czynnikiem determinującym oporność terapeutyczną nowotworów. W CRC laktylacja K673 rekombinacji mejotycznej 11 (MRE11) wzmacnia naprawę rekombinacji homologicznej (HR), co zwiększa odporność na chemioterapię i inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)13. W glejaku (GBM) interakcja między członkiem rodziny aldehydrogenazy 1, członkiem rodziny aldehydrogenaz 1, A3 (ALDH1A3), a kinazą piruwanianową M2 (PKM2) zwiększa produkcję mleczanu, co następnie indukuje laktilację K247 białka krzyżowego uzupełniającego rentgenowskie 1 (XRCC1), co zwiększa naprawę uszkodzeń DNA, a tym samym napędza radiooodporność i chemooodporność na temozolomid (TMZ)14. Badania te łącznie podkreślają, że precyzyjna kontrola laktylacji przy określonych resztach lizyny jest niezbędna dla mechanistycznej sekcji i celowania terapeutycznego.
Postępy w spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości ujawniły powszechną laktylację enzymów metabolicznych, czynników transkrypcjowych oraz przetworników sygnalizacji, podkreślając jej szeroką rolę w kontrolowaniu metabolizmu, transdukcji sygnałów oraz fizjologii komórkowej 15,16,17,18. Do tej pory zgłoszono kilka enzymów katalizujących laktylację – na przykład AARS1 pośredniczy laktylację p53, wspierając tumourigenezę19, a AARS1/2 reguluje laktylację cGAS, tłumiąc odporność wrodzoną – jednak te enzymy są selektywne pod względem substratów i obecnie nie są w stanie osiągnąć w pełni specyficznej miejscowej lakttylacji na dowolnych białkach20. W związku z tym dziedzina pozostaje wyzwaniem dla sposobu ukierunkowanej manipulacji Klac w celach badawczych lub terapeutycznych.
Badania funkcjonalne wciąż w dużej mierze opierają się na mutagenezie ukierunkowanej na miejsce – zazwyczaj zastępując lizynę (K) glutaminą (Q), aby naśladować stan nienaładowany modyfikacji acylolizyny, takich jak acetylacja lub laktilacja 21,22,23,24. Jednak to podejście ma istotne ograniczenia w wiernym odtwarzaniu natywnej laktylacji: struktura chemiczna i geometria łańcuchów bocznych glutaminy różnią się od tych w przypadku lizyny laktylacyjnej, a co istotne, podstawienie K do Q nie może odróżnić stanów acetylowanych od laktylacowanych, gdy oba modyfikacje mogą zachodzić w tym samym miejscu.
Rozszerzenie kodu genetycznego (GCE) stanowi potężne rozwiązanie tych ograniczeń, umożliwiając bezpośrednie włączenie niekanonicznych aminokwasów do białek w określonych miejscach. Dzięki pozytywnemu testowi biblioteki mutantów Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA syntezazy (MmPylRS) Methanosarcina mazei wcześniej zidentyfikowaliśmy wariant wykazujący wzrost zależny od Klac. Ten mutant, posiadający mutacje L301M, Y306L, L309A i C348F, został oznaczony jako KlacRS125,26. KlacRS1 aminoacyluje swoje równorzędne ortogonalne tRNA z Klac, tłumi bursztynowy kodon stop i umożliwia efektywną, specyficzną dla miejsca inkorporację Klac do białek docelowych. Oprócz KlacRS1, zgłoszono kilka innych wariantów aaRS zdolnych do włączenia Klac, w tym LacKRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) pochodzący z MbPylRS oraz LacKRS3 (Y271M/C313S)19,27, a także LacKRS (C348T/Y384F)28 pochodzący zMm PylRS. Razem te narzędzia tworzą wszechstronny zestaw genetyczny do produkcji specyficznych dla miejsca wariantów białek laktylacycznych, aby zrozumieć biologiczne konsekwencje poszczególnych zdarzeń laktylacji.
W naszych poprzednich badaniach zastosowaliśmy ten system oparty na GCE do ekspresji białek ALDOA z laktylacją specyficzną dla miejsca Lys147 zarówno w komórkach E. coli, jak i ssaków. Analizy funkcjonalne wykazały, że laktylacja w Lys147 wywiera negatywny wpływ sprzężenia zwrotnego na glikolizę, zwiększa stabilność termiczną i chemiczną ALDOA oraz sprzyja jej translokacji z cytoplazmy do jądra. Wyniki te nie tylko ujawniły wcześniej nieznany mechanizm regulacyjny ALDOA, ale także potwierdziły odporność, wszechstronność i praktyczną użyteczność tej specyficznej dla lokalizacji platformy laktylacji25,26. Bazując na tym fundamencie, używamy tutaj ludzkiego enolazy-1 (hENO1) oraz superfolderu GFP (sfGFP) jako reprezentatywnych przykładów, aby opisać uproszczeną strategię precyzyjnej inkorporacji Klac przy użyciu naszego ortogonalnego systemu KlacRS/tRNA.

<table><tbody><tr><td>6*jego, Jego tag Rekombinowane przeciwciało monoklonalne</td><td>Proteintech</td><td>84814-1-RR</td><td>Klasa specyficznych immunoglobulin, celujących w 6&; Jego tag (krótki peptyd złożony z sześciu kolejnych reszt histydyny, HHHHHH) w białkach rekombinowanych.</td></tr><tr><td>System UPLC AQUITY</td><td>Wody</td><td></td><td>UltraPerformance Chromatografia Cieczowa</td></tr><tr><td>Królik mAb anty-L-Lakttyllizyny</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Klasa specyficznych immunoglobulin skierowanych na L-Lactyl Lysine (Klac), modyfikację posttranslacyjną (PTM) białek.</td></tr><tr><td>Klonowanie ClonExpress II w jednym kroku</td><td>Vazyme&nbsp;</td><td>C112</td><td>Dzięki prostej, szybkiej i efektywnej technologii bezszwowowego klonowania DNA, fragmenty insertów można sklonować kierunkowo do dowolnego miejsca dowolnego wektora.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CytoFlex</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>Cytometr przepływowy z wysokoczułą możliwością wykrywania i analizy wielokolorowej</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Biokrólik</td><td>EC005H-S</td><td>Typ kompetentnych komórek do transformacji plazmidów, klonowania genów oraz niebiesko-białego przesiewu.</td></tr><tr><td>DH5&alpha;</td><td>Vazyme&nbsp;</td><td>C502</td><td>Typ kompetentnych komórek do transformacji plazmidów, klonowania genów oraz niebiesko-białego przesiewu.</td></tr><tr><td>System EASY-nano LC 1200</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nano-cieczowa chromatografia do separacji próbek złożonych o wysokiej czułości i wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Eclipse Tribrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>flagowy system wysokiej klasy tribridowej chromatografii cieczowej i spektrometrii masowej (LC-MS)</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phanta Max Super-Fidelity</td><td>Vazyme&nbsp;</td><td>P505</td><td>Wysokowierny pojedynczy enzym łączący szybkie wzmocnienie i wierność</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>PolyJet DNA In Vitro Tranfection Reagent został sformułowany jako silny odczynnik transfekcyjny, który zapewnia skuteczną i powtarzalną transfekcję przy mniejszej cytotoksyczności.</td></tr></tbody></table>

laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach e. coli i ssaków

Site-Specific Lysine Lactylation via Genetic Code Expansion in E. coli and Mammalian Cells

Laktylacja to niedawno odkryta modyfikacja posttranslacyjna (PTM) o różnorodnych funkcjach biologicznych. Od momentu pierwszego zidentyfikowania w 2019 roku jako regulatora polaryzacji makrofagów, laktylacja histonowych stała się kluczowym ogniwem łączącym metabolizm komórkowy z regulacją funkcjonalną. Biochemicznie polega na kowalencyjnym transferze grupy laktylowej na reszty lizyny, pośredniczonym albo przez laktylotransferazy wykorzystujące laktylo-CoA jako dawcę acyklu, albo przez aminoacylo-tRNA syntetazy (AARS) za pośrednictwem laktylo-AMP pośredniego. Dzięki tym mechanizmom poziomy mleczanu wewnątrzkomórkowego są bezpośrednio powiązane z modyfikacją i funkcją białka. Mleczenie pośredniczi w szeregu kluczowych procesów komórkowych, od funkcji fizjologicznych, takich jak regulacja genów, naprawa DNA, przeprogramowanie metaboliczne i modulacja immunologiczna, po procesy patologiczne, takie jak postęp guza i przerzuty. Pomimo identyfikacji licznych miejsc laktylacji za pomocą proteomiki, osiągnięcie specyficznej dla konkretnego miejsca laktylacji lizyny poprzez mutagenezę pozostaje wyzwaniem. Aby temu zaradzić, stosujemy technologię rozszerzania kodu genetycznego, wykorzystując specyficzną aminoaceyl-tRNA syntetazę laktylolizynową (KlacRS) oraz jej odpowiedni tRNA, aby precyzyjnie włączyć laktylizynę (Klac) w wyznaczonych resztach. Strategia ta umożliwia generowanie jednorodnie laktylowanych wariantów białek do bezpośrednich badań funkcjonalnych. Tutaj opisujemy uprościony protokół laktylacji białek specyficznych dla miejsca, zweryfikowany zarówno w komórkach Escherichia coli (E. coli), jak i ssaków, wykorzystując ludzką enolazę-1 (hENO1) i superfolder GFP (sfGFP) jako systemy modelowe.

Najpierw oceniliśmy specyficzność włączenia Klac do białek w E. coli. Gen dla ludzkiej enolazy 1 (hENO1) został zaprojektowany tak, aby zawierał bursztynowy kodon stop w pozostałości K89 (hENO1-89TAG), a ten konstrukt był współekspresjonowany z ortogonalnym KlacRS i jego odpowiednią parą tRNA w E. coli. W braku suplementacji 1 mM Klac nie wykryto pełnowymiarowego hENO1; dla porównania, gdy do podłoża wzrostu dodano 1 mM Klac, powstał pełnowymiarowy hENO1 zawierający Klac na pozycji 89 (hENO1-89...

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Lactylation is a recently discovered post-translational modification (PTM) with diverse biological functions. Since its initial identification in 2019 as ...

Opracowaliśmy system tRNA zegar/RS, aby przezwyciężyć ograniczenia mimikry i enzymów, umożliwiając precyzyjną inkorporację laktylacji lizyny w celu badania jego biologii. Protokół ten można zastosować do badania metabolizmu nowotworów, funkcji enzymów oraz miejsc zegarowych. Na początek współtransformuj 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli DH10B z około 100 nanogramami każdego z pożądanych plazmidów. Inkubuj mieszankę na lodzie przez 25 minut, a następnie poddaj szok cieplny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund.Wróć rurkę do lodu na trzy minuty. Dodaj 350 mikrolitrów medium Luria bertani i energicznie potrząsaj rurką z prędkością 220 obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie rozproszy przekształconą hodowlę komórkową na płytce agarowej Luria bertani z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu.Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Następnie wybierz jedną kolonię z talerza, aby zaszczepić czteromililitrową hodowlę startową i inkubować ją przez noc. Następnego dnia rozszerzyć nocną hodowlę do 400 mililitrów podłoża Luria bertani zawierającego ampicylinę i chloramfenikol.Potrząsaj hodowlą energicznie z prędkością 220 obrotów na minutę i 37 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna w 600 nanometrach osiągnie od 0,6 do 0,8. Następnie indukuj hodowlę 0,2% L-Arabinozy i 1 milimolarną lizyną laktylo, a następnie inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 220 obrotach na minutę przez 16 godzin. Komórki nasienne z płyty z 12 dołkami o gęstości jeden razy 10 do mocy pięciu komórek na odwiert, przy użyciu jednego mililitra DMEM.Inkubuj przez 24 godziny, aż konfluencja komórek osiągnie od 70 do 80%, a następnie przechodź do transfekcji. Aby przygotować rozcieńczony roztwór DNA, należy dodać 0,75 mikrograma plazmidu zawierającego reporter sfGFP i pNeu-KlacRS w proporcji jeden do jednego do 38 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM o wysokiej glukozie. Delikatnie pipetuj w górę i w dół lub krótko wymieszaj wiry.Aby przygotować rozcieńczony odczynnik transfekcyjny, należy dodać 2,25 mikrolitra odczynnika transfekcyjnego do 38 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM o wysokiej glukozie. Delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby dokładnie wymieszać. Natychmiast dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego roztworu DNA jednocześnie.Następnie pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby wymieszać zawartość, i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, aby umożliwić powstanie kompleksów transfekcyjnych i DNA. Dodaj 50 mikrolitrów transfekcji i kompleksu DNA kropelami do medium w każdym dołku i delikatnie mieszaj płytkę, aby ujednolicić mieszaninę. Sześć godzin po transfekcji zastąpić podłoże świeżym DMEM zawierającym jedną milimolową lizynę laktylową i hodować komórki przez 24 do 48 godzin.W Escherichia coli powstał pełnowymiarowy hENO1-89Klac, gdy do podłoża dodano jedną milimolową lizynę laktylową. Immunoblotting potwierdził obecność pełnowymiarowego hENO1-89Klac przy użyciu przeciwciał anty-His i anty-L-laktylowej lizyny. Spektrometria mas z metodą jonizacji elektrosprayowej podczas lotu wykazała dominujący szczyt na poziomie 48 178 Daltonów, co odpowiadało oczekiwanej masie hENO1-89Klac bez inicjacyjnej metioniny.Tandemomowa spektrometria mas tryptyku potwierdziła specyficzne miejsce włączenia Klac w Resztie 89 poprzez obecność kompletnego odwzorowania serii jonów B&Y na zmodyfikowany peptyd. W komórkach HEK293T ssaków mikroskopia fluorescencyjna wykazała silną ekspresję sfGFP w całych komórkach po dodaniu Klac na 24 i 48 godzin, podczas gdy bez suplementacji Klac nie zaobserwowano fluorescencji. Cytometria przepływowa wykazała, że około 31% komórek wykazywało ekspresję sfGFP po 24 godzinach, a po 48 godzinach suplementacji Klac wzrosło do około 37%.Protokół ten umożliwia badanie specyficznych miejscowo efektów laktylacji lizyny na funkcję białek oraz ułatwia pomiar uzyskanych wyników biologicznych i funkcjonalnych. Po tej procedurze naukowcy mogą przeprowadzać badania mechanistyczne, przeprowadzać testy przesiewowe o wysokiej przepustowości oraz generować stabilne linie komórkowe do rozszerzonej analizy funkcjonalnej. Nasze przyszłe badania mają na celu poprawę efektywności, umożliwienie stabilnej integracji oraz rozwój biosyntezy zegara.

site-specific-lysine-lactylation-via-genetic-code-expansion-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Walidacja aktywności enzymatycznych związanych ze szlakami biochemicznymi może być wyjaśniona za pomocą analizy komplementacji funkcjonalnej (FCA). W tym manuskrypcie opisano test FCA wykazujący aktywność enzymatyczną enzymów biorących udział w metabolizmie aminokwasów, rygorystycznej odpowiedzi bakterii i biosyntezie peptydoglikanu bakteryjnego.

Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

To badanie przedstawia alternatywną strategię do konwencjonalnej metody opartej na toksycznych analogach w identyfikacji nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony, aby osiągnąć jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Poznaj metodę laktylacji lizyny specyficznej dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków. Ta technika umożliwia badanie funkcji białek i metabolizmu nowotworowego.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Przeglądaj więcej filmów