Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Opracowaliśmy system tRNA zegar/RS, aby przezwyciężyć ograniczenia mimikry i enzymów, umożliwiając precyzyjną inkorporację laktylacji lizyny w celu badania jego biologii. Protokół ten można zastosować do badania metabolizmu nowotworów, funkcji enzymów oraz miejsc zegarowych. Na początek współtransformuj 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli DH10B z około 100 nanogramami każdego z pożądanych plazmidów. Inkubuj mieszankę na lodzie przez 25 minut, a następnie poddaj szok cieplny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund.

Wróć rurkę do lodu na trzy minuty. Dodaj 350 mikrolitrów medium Luria bertani i energicznie potrząsaj rurką z prędkością 220 obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie rozproszy przekształconą hodowlę komórkową na płytce agarowej Luria bertani z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu.

Inkubuj płytę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Następnie wybierz jedną kolonię z talerza, aby zaszczepić czteromililitrową hodowlę startową i inkubować ją przez noc. Następnego dnia rozszerzyć nocną hodowlę do 400 mililitrów podłoża Luria bertani zawierającego ampicylinę i chloramfenikol.

Potrząsaj hodowlą energicznie z prędkością 220 obrotów na minutę i 37 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna w 600 nanometrach osiągnie od 0,6 do 0,8. Następnie indukuj hodowlę 0,2% L-Arabinozy i 1 milimolarną lizyną laktylo, a następnie inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 220 obrotach na minutę przez 16 godzin. Komórki nasienne z płyty z 12 dołkami o gęstości jeden razy 10 do mocy pięciu komórek na odwiert, przy użyciu jednego mililitra DMEM.

Inkubuj przez 24 godziny, aż konfluencja komórek osiągnie od 70 do 80%, a następnie przechodź do transfekcji. Aby przygotować rozcieńczony roztwór DNA, należy dodać 0,75 mikrograma plazmidu zawierającego reporter sfGFP i pNeu-KlacRS w proporcji jeden do jednego do 38 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM o wysokiej glukozie. Delikatnie pipetuj w górę i w dół lub krótko wymieszaj wiry.

Aby przygotować rozcieńczony odczynnik transfekcyjny, należy dodać 2,25 mikrolitra odczynnika transfekcyjnego do 38 mikrolitrów bezsurowicowego DMEM o wysokiej glukozie. Delikatnie pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby dokładnie wymieszać. Natychmiast dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego roztworu DNA jednocześnie.

Następnie pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby wymieszać zawartość, i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, aby umożliwić powstanie kompleksów transfekcyjnych i DNA. Dodaj 50 mikrolitrów transfekcji i kompleksu DNA kropelami do medium w każdym dołku i delikatnie mieszaj płytkę, aby ujednolicić mieszaninę. Sześć godzin po transfekcji zastąpić podłoże świeżym DMEM zawierającym jedną milimolową lizynę laktylową i hodować komórki przez 24 do 48 godzin.

W Escherichia coli powstał pełnowymiarowy hENO1-89Klac, gdy do podłoża dodano jedną milimolową lizynę laktylową. Immunoblotting potwierdził obecność pełnowymiarowego hENO1-89Klac przy użyciu przeciwciał anty-His i anty-L-laktylowej lizyny. Spektrometria mas z metodą jonizacji elektrosprayowej podczas lotu wykazała dominujący szczyt na poziomie 48 178 Daltonów, co odpowiadało oczekiwanej masie hENO1-89Klac bez inicjacyjnej metioniny.

Tandemomowa spektrometria mas tryptyku potwierdziła specyficzne miejsce włączenia Klac w Resztie 89 poprzez obecność kompletnego odwzorowania serii jonów B&Y na zmodyfikowany peptyd. W komórkach HEK293T ssaków mikroskopia fluorescencyjna wykazała silną ekspresję sfGFP w całych komórkach po dodaniu Klac na 24 i 48 godzin, podczas gdy bez suplementacji Klac nie zaobserwowano fluorescencji. Cytometria przepływowa wykazała, że około 31% komórek wykazywało ekspresję sfGFP po 24 godzinach, a po 48 godzinach suplementacji Klac wzrosło do około 37%.

Protokół ten umożliwia badanie specyficznych miejscowo efektów laktylacji lizyny na funkcję białek oraz ułatwia pomiar uzyskanych wyników biologicznych i funkcjonalnych. Po tej procedurze naukowcy mogą przeprowadzać badania mechanistyczne, przeprowadzać testy przesiewowe o wysokiej przepustowości oraz generować stabilne linie komórkowe do rozszerzonej analizy funkcjonalnej. Nasze przyszłe badania mają na celu poprawę efektywności, umożliwienie stabilnej integracji oraz rozwój biosyntezy zegara.