Model szczura z kanulacją przewodu limfatycznego szyjnego do oceny transportu limfatycznego z głowy i mózgu

Nasz projekt bada, jak limfatyczne mózgu łączą się z chorobami OUN, takimi jak Alzheimer, udar czy neurozapalenie, poprzez identyfikację substancji odprowadzających odtok z mózgu. Istniejące metody nie posiadały protokołu ani niezawodnego podejścia do teoretycznego próbkowania i ilościowego określenia wypływu limfatycznego pochodzącego z CNS, co jest możliwe dzięki temu protokołowi. Na początek wstępnie załaduj około 0,7 mililitra rozcieńczonego roztworu antykoagulanta do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 mililitra z igłą 30-gauge, aby pokryć wewnętrzną powierzchnię kaniuli polietylenowej.

Przechowuj wcześniej załadowaną strzykawkę w sterylnych warunkach do czasu użycia. Do przygotowania kanil użyj rur o średnicy zewnętrznej 0,5 milimetra i 0,3 milimetra dla obu sekcji końcowych oraz rurek o średnicy zewnętrznej 0,6 milimetra i 0,5 milimetra dla części środkowej. Za pomocą nożyczek przytnij segmenty kaniuli na długości dwóch centymetrów dla części bliższej łączącej się z igłą strzykawki, 40 centymetrów dla środkowej części oraz ośmiu centymetrów dla części dystalnej przeznaczonej do kanilowania.

Złóż kaniulę w konfiguracji głowa do ogona. Następnie wycinam i fazuj dalszy koniec zespołu kaniuli pod kątem około 45 stopni, aby ułatwić płynne wprowadzenie do przewodu limfatycznego szyjnego. Sprawdź przenikliwość każdej kaniuli, podłączając wstępnie naładowaną strzykawkę do bliższego końca złożonej kaniuli.

Delikatnie wypuścić niewielką ilość roztworu, aby przepłukać kaniulę. Upewnij się, że roztwór płynnie wypływa z dalszego końca bez oznak przecieku. Ułóż znieczulonego szczura na plecach na podgrzewanej podrobie chirurgicznej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przechyl głowę i wyprostuj szyję, używając małej poduszki podtrzymującej, jeśli to konieczne, aby zwiększyć ekspozycję okolicy szyjnej. Delikatnie unieruchom kończyny przednie za pomocą gumek recepturek lub taśm chirurgicznych, aby zminimalizować ruch. Płucz sierść na okolicy szyjnej sterylną solą fizjologiczną, aby ułatwić golenie.

Następnie dokładnie ogol całe miejsce zabiegu, aby zapewnić całkowite usunięcie sierści przed nacięciem. Oznacz miejsce operacji, rysując linię przerywaną o szerokości 2,5 centymetra, aby potwierdzić długość początkowego nacięcia. Umieść górny koniec nacięcia około jednego do 1,5 centymetra poniżej dolnej wargi.

Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia odruchem uszczypania palców, ostrożnie naciń powierzchowną warstwę mięśni szyjnych wzdłuż wyznaczonej linii. Następnie delikatnie rozdziel pozostałe warstwy mięśni, głównie powierzchowną powięź szyjnej, aby odsłonić tętnicę szyjną. Wycofać mięsień mostkowy i gruczoł podżuchwy i odchylić je od pola chirurgicznego, aby ułatwić identyfikację przewodu chłonnego szyjnego.

Użyj rozszerzacza tkanek, aby utrzymać okno chirurgiczne. Za pomocą patyczka watowego tymczasowo odsuń tkankę mięśniową, lokalizując węzeł chłonny i towarzyszący mu przewód limfatyczny. Zlokalizuj nieprzezroczysty, bezbarwny przewod limfatyczny szyjny biegnący równolegle do tętnicy szyjnej.

Używając tępych kleszczy, delikatnie przechodź przez rozdzielone tkanki łączne i utrzymuj kleszcze na miejscu. Ostrożnie izoluj przewód chłonny szyjki szyjnej od otaczających tkanek łącznych i tłuszczowych za pomocą tępego rozwarstwienia. Następnie wykonaj małe nacięcie w górnej połowie odsłoniętego naczynia.

Niewielkie wtórne nakłucie skórne około 1,5 centymetra od okna chirurgicznego może być wykonane jako dodatkowy punkt fiksacji kaniuli. Włóż kaniulę przez drugie otwarcie, chwyć jej dalszy koniec kleszczami i upewnij się, że fazowana powierzchnia jest skierowana ku górze. Następnie delikatnie wprowadź dalszy koniec około dwóch milimetrów do przewodu limfatycznego przez nacięcie, kierując go w stronę głowy.

Monitoruj bliższy koniec kanili przez jedną do dwóch minut. Powierdź pomyślny wypływ kanilowacji, obserwując powolny i stały odpływ płynu limfatycznego. Zabezpiecz kaniulę, nakładając niewielką kroplę kleju tkankowego cyjanoakrylanem pipetą w miejscu nacięcia i wtórnym otworze fiksacyjnym.

Obserwuj przepływ limfy przez kilka minut, aby potwierdzić stały odpływ. Następnie ostrożnie usuwam rozszerzacz tkanek i przestawiam gruczoł podżuchwy na pierwotne miejsce. Przymocuj wcześniej oznakowaną, powłokę antykoagulantową mikrowirówkę do dalszego końca kaniuli.

Następnie przestaw wszystkie warstwy mięśni na ich pierwotne miejsce i zamykaj nacięcie skóry szwami i/lub klejem tkankowym. Zbieraj limfę nieprzerwanie do mikrowirówek pokrytych antykoagulantem, wymieniając je w określonych odstępach czasu, zazwyczaj co godzinę. Upewnij się, że szczur pozostaje znieczulony przez cały okres pobierania braci.

Przechowywać zebrane próbki w okładach z lodem w chłodni. Godzinowe przepływy limfy mierzone przez sześciogodzinny okres zbierania u skutecznie ukanulowanych szczurów wahały się od 0,09 do 0,13 mililitra na godzinę. U zdrowych szczurów skumulowany transport limfatyczny albuminy podanej wewnątrzprążkowo oznaczanej trytem pozostawał znikomy przez pierwsze dwie godziny i znacznie wzrósł po nich.

Porównanie stężeń albuminy znakowanej trytem pomiędzy limfą a osoczem wykazało różne profile stężeń w czasie u zdrowych szczurów. Neurozapalność wywołana przez podanie lipopolisacharydu Escherichia coli w międzyotrzewnowej wiązała się z nieznacznie zmniejszonym ogólnym przepływem limfy w ciągu ośmiu godzin oraz niemal dwukrotnym zmniejszeniem udziału całkowitej dawki transportowanej do limfy. Stosunek stężeń limfatycznych do osocza nie wykazał istotnej różnicy między zdrowymi a neurozapalnymi szczurami, co wskazuje na podobne profile wyczyszczenia limfatycznego szyjki macicy.

Protokół ten umożliwiał bezpośrednie biologiczne pobieranie próbek limfy pochodzącej z mózgu, łącząc pośrednie obrazowanie zewnętrzne lub metodę żywicową z mierzalnym wypływem ośrodkowego układu nerwowego. Protokół umożliwia badanie centralnie podawanego usuwania leków przez szlaki limfatyczne, umożliwiając pomiar dróg odpływu i wskaźników oczyszczania. Przyszłe badania mogą zbadać, jak stany chorób OUN alarmują wyczyszczenie limfatyczne i wykorzystać tę wiedzę do optymalizacji leków w celu przywrócenia funkcji limfatycznej mózgu podczas leczenia.