Mapowanie odporności niemowląt przy minimalnym układzie: Integracyjne profilowanie jednokomórkowe i wielokomórkowe

Nasze badania definiują, jak odporność we wczesnym okresie życia adaptuje się po urodzeniu, wykorzystując podłużne, wysokowymiarowe profilowanie multiomiczne na podstawie małych objętości krwi. Protokół ten może być stosowany w badaniach neonatologicznych i pediatrycznych dotyczących podłużnego profilowania immunologicznego na podstawie ograniczonej liczby próbek biologicznych w zakresie zdrowia, infekcji i stanu zapalnego. Na początek szybko rozmroz fiolkę zawierającą zlizowane czerwone krwinki niemowląt w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej 10 mililitrów ciepłego, kompletnego medium RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wiruj probówkę w 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w trzech mililitrach pełnego nośnika RPMI i policz łączną liczbę komórek.

Rozcieńcz próbkę, jeśli stężenie jest zbyt wysokie, by je zliczyć. Po zliczeniu komórek powtórz etap wirowania i ponownie zawiesz komórki w pełnym medium RPMI, aby uzyskać stężenie miliona komórek na mililitr. Przelej 100 mikrolitrów zawierających 0,1 miliona komórek do każdej dołki płyty V-bottom z 96 dołkami.

Wiruj płytę w 764 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń nadmiar. Następnie do wszystkich próbek z wyjątkiem niebarwionej kontroli dodaj 100 mikrolitrów żywego martwego barwnika rozcieńczonego 1 do 2 000 w PBS z blokiem FC i blokiem monocytów rozcieńczonym 1 do 100 do 100.

Inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przemyć komórki, dodaj 100 mikrolitrów PBS. Wiruj płytę w 764 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie wyrzucaj supernatant.

Dodaj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał powierzchniowych, rozcieńczonego od jednego do 200 w sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją, czyli buforze FACS, do wszystkich próbek z wyjątkiem grupy kontrolnej bez barwienia. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu FACS, wiruj i wyrzucam supernatant.

Ufiksuj komórki, dodając do każdej próbki 100 mikrolitrów 4% paradehydu. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, następnie ponownie myj komórki i ponownie zawieszaj w 200 mikrolitrach buforu FACS. Przygotuj kulki kompensacyjne UltraComp jako jednokolorowe kontrolery.

Bejcuj jednokolorowe koraliki kontrolne tą samą procedurą co próbki, w tym utrwalającą, jeśli próbki były utrwalone. Przygotuj też regulatory fluorescencji minus jeden lub FMO w ten sam sposób. Uruchom próbki, jednokolorowe kontrolki, sterowanie bez barwienia oraz regulatory fluorescencyjne minus jeden na konwencjonalnym lub spektralnym cytometrze przepływowym.

Otwórz FlowJo i wybierz interesującą Cię próbkę do analizy. Ustaw bramki z odpowiednimi kontrolami izotypowymi i FMO. Brama leukocytów wykorzystuje FSC w porównaniu z SSC, aby wykluczyć zanieczyszczenia, a komórki dobierają się według rozmiaru i ziarnistości.

Wyklucz dublety stosujące FSCA w porównaniu z FSCH. Zrób "gate" żywe komórki za pomocą barwnika żywotnościowego, aby wykluczyć martwe komórki. Z żywych pojedynczych komórek dzieli się na limfocyty ujemne z datą CD33 oraz komórki szpikowe z dodatnim wynikiem CD-33.

W komórkach z CD33 zidentyfikować monocyty z CD14 dodatnie. Następnie w komórkach z CD33 zidentyfikować dendrytyczne CD14-ujemne, CD11C-dodatnie. Obecnie, wśród limfocytów CD33-ujemnych limfocytów występują limfocyty T z dodatnim wynikiem CD3 oraz komórki naturalnego zabójcy z CD3 i CD56 dodatnie.

W komórkach T z dodatnim wynikiem CD3 zidentyfikować podzbiory CD8 i CD4 dodatnie oraz zidentyfikować komórki B z CD3, CD56 i CD19. Na początek rozmroz jedną fiolkę z kriogenicznie konserwowanymi komórkami czerwonymi krwinek w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przelej zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów medium T-komórkowego i wiruj w 430 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń nadmiar. Po ponownym zawieszeniu pelletu komórkowego z jednym mililitrem PBS, należy dodać kolejne dziewięć mililitrów PBS do próbki. Wiruj probówkę w 430 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć supernatant.

Policz komórki i oceń żywotność za pomocą wykluczenia trypanu niebieskiego. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, użyj zestawu do usuwania martwych komórek w następujący sposób. Najpierw przygotuj bufor wiążący 1x, rozcieńczając roztwór buforu wiążącego 20x sterylną wodą podwójnie destylowaną.

Ponownie zawieś granulkę komórkową w 100 mikrolitrach mikrogranulek usuwających martwe komórki na każde 10 do mocy siedmiu komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść kolumnę separacyjną magnetyczną w odpowiednim stojaku magnetycznym wraz z rurką zbiorczą.

Następnie wyrównuj kolumnę, płucząc ją 500 mikrolitrami buforu wiążącego 1x. Zwięź objętość zawiesiny komórkowej do 500 mikrolitrów z buforem wiązającym 1x. Po wymianie probówki pobierającej należy zastosować zawiesinę komórkową do kolumny i zebrać przepływ do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra.

Następnie przemyj kolumnę dwa razy 500 mikrolitrami buforu wiążącego i zbieraj przepływ do tej samej rurki mikrowirówki. Wiruj eluat w 300 g przez 10 minut i wyrzuć supernatant. Policz komórki i ponownie oceń żywotność, używając wykluczenia trypana niebieskiego.

Aliquot 20 000 żywotnych komórek do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Następnie wiruj ogniwa w 300 g przez 10 minut i usuwaj supernatant. Ponownie zawiesić komórki przy 40 mikrolitrach PBS zawierającej 0,04% BSA.

Na koniec umieść rurkę zawierającą komórki na lodzie i natychmiast wyślij ją do ośrodka rdzenia genomowego w celu generowania i sekwencjonowania bibliotek. Zbieraj wyniki sekwencjonowania w formacie wyjść cell ranger. Przetworzono zaschnięte próbki krwi z plam wcześniaków i grup kontrolnych.

Znormalizowana ekspresja białek 92 białek immunologicznych została zmierzona ilościowo. Ekspresja genu aktywującego limfocyty trzy oraz adaptera transbłonowego regulującego prog sygnału 1 była istotnie wyższa we krwi obwodowej wcześniaków w wieku dwóch miesięcy w porównaniu do terminowej krwi pępowinowej. Zastosowano kompleksową strategię gatingu do identyfikacji populacji leukocytów na podstawie próbek białych krwinek z krwinki czerwonej.

W populacji limfocytów T rozróżniono podgrupy CD4 i CD8 dodatnie. Po przefiltrowaniu przechwycono i sprofilowano ponad 120 000 komórek w zestawie danych sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego dla pojedynczych komórek. Redukcja wymiarowości i analiza klasteryzacji zidentyfikowały 14 odrębnych klastrów komórek.

Klastry komórek były anotowane na podstawie genów różnicowo ekspresyjnych i znanych markerów komórkowych. 12 z 14 klastrów odpowiadało liniom komórek odpornościowych, w tym limfocytom T, komórkom naturalnego zabójcy, limfocytom B, komórkom szpikowym oraz neutrofilom. Wykres słupkowy ilustrował względny odsetek komórek w klastrze w ciągu tygodnia, jednego miesiąca i dwóch miesięcy wieku.

Badanie to umożliwia pomiar komórkowych, transkryptomicznych, proteomicznych i funkcjonalnych sygnatur immunologicznych podłużnie na podstawie próbek krwi o ograniczonej objętości. Przyszłe badania mogą wykorzystać te metody do określenia zdrowych trajektorii odpornościowych i ujawnienia zaburzeń wczesnych odpowiedzi immunologicznych związanych z chorobami.