Mapowanie odporności niemowląt przy minimalnym układzie: Integracyjne profilowanie jednokomórkowe i wielokomórkowe
3 kwietnia 2026
Protokół ten opisuje pobieranie i przechowywanie próbek krwi od noworodków i dzieci oraz zastosowanie scRNA-seq, proteomiki i spektralnej cytometrii przepływowej do charakteryzacji populacji komórek odpornościowych z tych próbek.
Nasze badania definiują, jak odporność we wczesnym okresie życia adaptuje się po urodzeniu, wykorzystując podłużne, wysokowymiarowe profilowanie multiomiczne na podstawie małych objętości krwi. Protokół ten może być stosowany w badaniach neonatologicznych i pediatrycznych dotyczących podłużnego profilowania immunologicznego na podstawie ograniczonej liczby próbek biologicznych w zakresie zdrowia, infekcji i stanu zapalnego. Na początek szybko rozmroz fiolkę zawierającą zlizowane czerwone krwinki niemowląt w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej 10 mililitrów ciepłego, kompletnego medium RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wiruj probówkę w 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w trzech mililitrach pełnego nośnika RPMI i policz łączną liczbę komórek.
Rozcieńcz próbkę, jeśli stężenie jest zbyt wysokie, by je zliczyć. Po zliczeniu komórek powtórz etap wirowania i ponownie zawiesz komórki w pełnym medium RPMI, aby uzyskać stężenie miliona komórek na mililitr. Przelej 100 mikrolitrów zawierających 0,1 miliona komórek do każdej dołki płyty V-bottom z 96 dołkami.
Wiruj płytę w 764 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń nadmiar. Następnie do wszystkich próbek z wyjątkiem niebarwionej kontroli dodaj 100 mikrolitrów żywego martwego barwnika rozcieńczonego 1 do 2 000 w PBS z blokiem FC i blokiem monocytów rozcieńczonym 1 do 100 do 100.
Inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przemyć komórki, dodaj 100 mikrolitrów PBS. Wiruj płytę w 764 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie wyrzucaj supernatant.
Dodaj 100 mikrolitrów koktajlu przeciwciał powierzchniowych, rozcieńczonego od jednego do 200 w sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją, czyli buforze FACS, do wszystkich próbek z wyjątkiem grupy kontrolnej bez barwienia. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu FACS, wiruj i wyrzucam supernatant.
Ufiksuj komórki, dodając do każdej próbki 100 mikrolitrów 4% paradehydu. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, następnie ponownie myj komórki i ponownie zawieszaj w 200 mikrolitrach buforu FACS. Przygotuj kulki kompensacyjne UltraComp jako jednokolorowe kontrolery.
Bejcuj jednokolorowe koraliki kontrolne tą samą procedurą co próbki, w tym utrwalającą, jeśli próbki były utrwalone. Przygotuj też regulatory fluorescencji minus jeden lub FMO w ten sam sposób. Uruchom próbki, jednokolorowe kontrolki, sterowanie bez barwienia oraz regulatory fluorescencyjne minus jeden na konwencjonalnym lub spektralnym cytometrze przepływowym.
Otwórz FlowJo i wybierz interesującą Cię próbkę do analizy. Ustaw bramki z odpowiednimi kontrolami izotypowymi i FMO. Brama leukocytów wykorzystuje FSC w porównaniu z SSC, aby wykluczyć zanieczyszczenia, a komórki dobierają się według rozmiaru i ziarnistości.
Wyklucz dublety stosujące FSCA w porównaniu z FSCH. Zrób "gate" żywe komórki za pomocą barwnika żywotnościowego, aby wykluczyć martwe komórki. Z żywych pojedynczych komórek dzieli się na limfocyty ujemne z datą CD33 oraz komórki szpikowe z dodatnim wynikiem CD-33.
W komórkach z CD33 zidentyfikować monocyty z CD14 dodatnie. Następnie w komórkach z CD33 zidentyfikować dendrytyczne CD14-ujemne, CD11C-dodatnie. Obecnie, wśród limfocytów CD33-ujemnych limfocytów występują limfocyty T z dodatnim wynikiem CD3 oraz komórki naturalnego zabójcy z CD3 i CD56 dodatnie.
W komórkach T z dodatnim wynikiem CD3 zidentyfikować podzbiory CD8 i CD4 dodatnie oraz zidentyfikować komórki B z CD3, CD56 i CD19. Na początek rozmroz jedną fiolkę z kriogenicznie konserwowanymi komórkami czerwonymi krwinek w kąpieli wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przelej zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów medium T-komórkowego i wiruj w 430 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń nadmiar. Po ponownym zawieszeniu pelletu komórkowego z jednym mililitrem PBS, należy dodać kolejne dziewięć mililitrów PBS do próbki. Wiruj probówkę w 430 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć supernatant.
Policz komórki i oceń żywotność za pomocą wykluczenia trypanu niebieskiego. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, użyj zestawu do usuwania martwych komórek w następujący sposób. Najpierw przygotuj bufor wiążący 1x, rozcieńczając roztwór buforu wiążącego 20x sterylną wodą podwójnie destylowaną.
Ponownie zawieś granulkę komórkową w 100 mikrolitrach mikrogranulek usuwających martwe komórki na każde 10 do mocy siedmiu komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść kolumnę separacyjną magnetyczną w odpowiednim stojaku magnetycznym wraz z rurką zbiorczą.
Następnie wyrównuj kolumnę, płucząc ją 500 mikrolitrami buforu wiążącego 1x. Zwięź objętość zawiesiny komórkowej do 500 mikrolitrów z buforem wiązającym 1x. Po wymianie probówki pobierającej należy zastosować zawiesinę komórkową do kolumny i zebrać przepływ do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra.
Następnie przemyj kolumnę dwa razy 500 mikrolitrami buforu wiążącego i zbieraj przepływ do tej samej rurki mikrowirówki. Wiruj eluat w 300 g przez 10 minut i wyrzuć supernatant. Policz komórki i ponownie oceń żywotność, używając wykluczenia trypana niebieskiego.
Aliquot 20 000 żywotnych komórek do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Następnie wiruj ogniwa w 300 g przez 10 minut i usuwaj supernatant. Ponownie zawiesić komórki przy 40 mikrolitrach PBS zawierającej 0,04% BSA.
Na koniec umieść rurkę zawierającą komórki na lodzie i natychmiast wyślij ją do ośrodka rdzenia genomowego w celu generowania i sekwencjonowania bibliotek. Zbieraj wyniki sekwencjonowania w formacie wyjść cell ranger. Przetworzono zaschnięte próbki krwi z plam wcześniaków i grup kontrolnych.
Znormalizowana ekspresja białek 92 białek immunologicznych została zmierzona ilościowo. Ekspresja genu aktywującego limfocyty trzy oraz adaptera transbłonowego regulującego prog sygnału 1 była istotnie wyższa we krwi obwodowej wcześniaków w wieku dwóch miesięcy w porównaniu do terminowej krwi pępowinowej. Zastosowano kompleksową strategię gatingu do identyfikacji populacji leukocytów na podstawie próbek białych krwinek z krwinki czerwonej.
W populacji limfocytów T rozróżniono podgrupy CD4 i CD8 dodatnie. Po przefiltrowaniu przechwycono i sprofilowano ponad 120 000 komórek w zestawie danych sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego dla pojedynczych komórek. Redukcja wymiarowości i analiza klasteryzacji zidentyfikowały 14 odrębnych klastrów komórek.
Klastry komórek były anotowane na podstawie genów różnicowo ekspresyjnych i znanych markerów komórkowych. 12 z 14 klastrów odpowiadało liniom komórek odpornościowych, w tym limfocytom T, komórkom naturalnego zabójcy, limfocytom B, komórkom szpikowym oraz neutrofilom. Wykres słupkowy ilustrował względny odsetek komórek w klastrze w ciągu tygodnia, jednego miesiąca i dwóch miesięcy wieku.
Badanie to umożliwia pomiar komórkowych, transkryptomicznych, proteomicznych i funkcjonalnych sygnatur immunologicznych podłużnie na podstawie próbek krwi o ograniczonej objętości. Przyszłe badania mogą wykorzystać te metody do określenia zdrowych trajektorii odpornościowych i ujawnienia zaburzeń wczesnych odpowiedzi immunologicznych związanych z chorobami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowane protokoły wysokowymiarowego profilowania immunologicznego u noworodków przy użyciu minimalnych objętości krwi. Poprzez integrację zaawansowanych technik, takich jak cytometria przepływowa, proteomika i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, badanie umożliwia kompleksową analizę podłużną rozwoju odporności noworodka, nawet w przypadku niemowląt z ekstremalnie niską masą urodzeniową lub urodzonych przedwcześnie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Badania neonatologiczne i pediatryczne
- Analiza pojedynczych komórek
Wstęp
- Układ odpornościowy noworodka szybko adaptuje się do nowego, bogatego w bodźce środowiska po narodzinach.
- Odporność we wczesnym okresie życia jest w unikalny sposób dostosowana do potrzeb rozwojowych, a nie jest po prostu niedojrzała.
- Badanie odporności noworodków jest trudne ze względu na ograniczoną objętość krwi dostępną do analizy.
- Kompleksowe profilowanie immunologiczne wymaga metod, które maksymalizują ilość danych pozyskiwanych z małych próbek.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie protokołów wielowymiarowego profilowania immunologicznego z minimalnych próbek krwi noworodków.
- Umożliwienie prowadzenia badań podłużnych rozwoju układu odpornościowego u noworodków i niemowląt urodzonych przedwcześnie.
- Rejestracja komórkowych, transkrypcyjnych i proteomicznych sygnatur immunologicznych w czasie.
Zastosowane metody
- rozmrażanie i przetwarzanie próbek lizowanych erytrocytów noworodków.
- cytometria przepływowa ze szczegółowymi strategiami bramkowania w celu identyfikacji populacji komórek odpornościowych (limfocyty T, limfocyty B, komórki NK, komórki mieloidalne, komórki dendrytyczne, monocyty, neutrofile).
- analiza proteomiczna próbek z wysuszonych kropli krwi z ilościowym oznaczeniem 92 białek związanych z odpornością.
- sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek z usunięciem martwych komórek, przygotowaniem bibliotek i analizą klastrowania ponad 120 000 komórek.
- pobieranie próbek wzdłużnych w wielu punktach czasowych (po jednym tygodniu, jednym miesiącu, dwóch miesiącach).
Główne wyniki
- Protokoły umożliwiły profilowanie immunologiczne z bardzo małych objętości krwi, odpowiednich dla noworodków i niemowląt urodzonych przed terminem.
- Znacząco wyższa ekspresja genu lymphocyte-activation gene three oraz signaling threshold-regulating transmembrane adapter 1 u niemowląt urodzonych przed terminem w drugim miesiącu życia w porównaniu z krwią pępowinową noworodków urodzonych w terminie.
- Identyfikacja i adnotacja 14 odrębnych klastrów komórkowych, z czego 12 odpowiadało znanym liniom immunologicznym.
- Wizualizacja dynamicznych zmian w proporcjach komórek odpornościowych wczesnych etapach życia.
Wnioski
- Opisane metody pozwalają na kompleksowe, podłużne profilowanie immunologiczne na podstawie ograniczonych próbek krwi noworodków.
- Podejścia te ułatwiają badanie prawidłowego rozwoju układu odpornościowego oraz identyfikację rozregulowanych odpowiedzi związanych z chorobami.
- Protokoły te znajdują szerokie zastosowanie w badaniach immunologicznych nad noworodkami i dziećmi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zintegrowane profilowanie pojedynczych komórek i multiomika z minimalnych objętości krwi noworodków umożliwiają uzyskanie bezprecedensowego wglądu w rozwój odporności we wczesnym dzieciństwie, przełamując krytyczne ograniczenia dotyczące próbek w badaniach pediatrycznych. Podejście to wspiera wysokorozdzielcze mapowanie trajektorii immunologicznych, co pozwala na walidację celów iB ograniczanie ryzyka mechanistycznego na najwcześniejszych etapach odporności człowieka. Przedstawione protokoły ułatwiają podłużne, ilościowe monitorowanie stanu immunologicznego, bezpośrednio wpływając na decyzje w procesach translacyjnych dla programów terapeutycznych w pediatrii i neonatologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę populacji komórek odpornościowych i szlaków sygnałowych u noworodków przy użyciu minimalnej ilości biospecymenów.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez rejestrację sygnatur transkrypcyjnych i proteomicznych w różnych punktach czasowych rozwoju.
- Zmniejsza ryzyko mechanistyczne programów immunologii pediatrycznej poprzez ujawnianie unikalnych adaptacji odpornościowych występujących we wczesnej fazie życia.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów dla wskazań noworodkowych i pediatrycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, odtwarzalne schematy identyfikacji i kwantyfikacji komórek odpornościowych z próbek o małej objętości.
- Standaryzuje strategie bramkowania i kontroli w cytometrii przepływowej, zapewniając niezawodność i porównywalność analiz.
- Umożliwia skalowalne, wielowymiarowe przesiewanie fenotypów immunologicznych oraz profili ekspresji białek.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do późniejszej oceny związków i poszukiwania biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników profilowania immunologicznego do pediatrycznych i neonatalnych modeli istotnych dla danej choroby.
- Wspiera podłużne odkrywanie i walidację biomarkerów w zakresie dysregulacji odporności we wczesnym dzieciństwie.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek i ich analizę.
- Zmniejsza ryzyko w procesie badań translacyjnych poprzez mapowanie prawidłowych i zaburzonych trajektorii odporności u niemowląt.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta zintegrowana metoda profilowania łączy wczesne odkrycia, badania przesiewowe i badania translacyjne, umożliwiając kompleksową analizę odpornościową z ograniczonych próbek noworodkowych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kontekście odporności we wczesnym stadium życia.
- Przesiewy: Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary białek i komórek odpornościowych, odpowiednie dla wysokoprzepustowych procesów badawczych.
- Analityka: Dostarcza odczyty multiomiczne oraz wyniki statystyczne umożliwiające rzetelne porównywanie stanów rozwojowych i chorobowych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i progresję z uwzględnieniem ryzyka w programach pediatrycznych i neonatologicznych.
- Wykorzystanie w skali instytucjonalnej: Oferuje ustandaryzowaną, skalowalną platformę do profilowania odpornościowego w ramach różnorodnych inicjatyw badawczych w pediatrii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odpornością u dzieci.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne profilowanie immunologiczne z minimalnej ilości materiału wyjściowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie danych o wysokiej zawartości informacji z ograniczonych próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój terapeutycznych zasobów pediatrycznych i neonatologicznych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej, sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek oraz analizy danych proteomicznych.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury oraz infrastruktury bioinformatycznej do integracji danych multiomicznych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja procedur obchodzenia się z próbkami, strategii bramkowania i kontroli we wszystkich zespołach.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych pediatrycznych i neonatalnych systemów modelowych poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczeniem jest konieczność stosowania specjalistycznych odczynników oraz wsparcia jednostek centralnych w zakresie sekwencjonowania i proteomiki.
