Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach
30 kwietnia 2026
Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.
Protokół ten podkreśla powtarzalny workflow rekonstrukcji nanodysku z ramami wygenerowanej metody. Detergenty destabilizują białka błonowe. Nanodyski z MSP i lipidami postrzegają strukturę natywną dla krio-EM i lizy.
Zacznij od dodania składników lipidowych przygotowanych w chloroformie do szklanej probówki, aby przygotować mieszankę lipidową o pojemności 100 mikrolitrów i dokładnie wymieszać. Odparuj chloroform pod delikatnym strumieniem azotu, aż cała ciecz zostanie usunięta. Do szklanej probówki dodaj około dwóch mililitrów n-pentanu kroplami i odparuj rozpuszczalnik za pomocą gazu azotowego, aby uzyskać suchą, przezroczystą warstwę lipidową.
Po poluzowaniu koreka rurki umieść ją w próżniowym odłamku do suszenia próżniowego. Osuszaj osuszacz i utrzymuj go pod próżnią, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalników. Następnie usuwa warstwę lipidową z próżniowego osuszacza i dodaje 250 mikrolitrów buforu bezdetergentowego, niskosolnego, aby nawilżać warstwę lipidową, uzyskując końcowe stężenie lipidów 10 miligramów na mililitr.
Po ponownym zawieszeniu lipidów podziel je równomiernie na cztery szklane probówki. Sonikuj zawiesiny, aż staną się przezroczyste i przejrzyste, co wskazuje na udane powstanie liposomów. Następnie natychmiast przepłucz przestrzeń nad głową każdej rurki gazem azotowym i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do użycia.
Po przekształceniu komórek E.coli BL21 plazmidem MSP1D1, z tagiem 7-histydynowym i późniejszym rozszerzeniem hodowli. Indukuj ekspresję MSP, dodając IPTG do końcowego stężenia 0,5 do jednego milimolara. Następnie kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin z potrząsaniem.
Wiruj hodowlę bakterii w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usuń supernatant i zachowaj pellet komórkowy. Następnie ponownie zawiesij granulki uzyskane z jednego litra hodowli w 100 do 150 mililitrach buforu lizy.
Dokładnie ujednolicz do uzyskania jednolitej zawieszki bez widocznych grudek. Następnie użyj chłodzonego zakłócacza komórek ultradźwiękowych, aby rozbić bakterie z mocą 35% z cyklami trzysekundowych impulsów, po których następują sześciosekundowe przerwy. Kontynuuj sonikowanie, aż lizat stanie się przezroczysty i jasnobrązowy.
Wiruj lizat w dawce 30 000 g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zbieraj supernatant do kolejnych kroków. Po inkubacji supernatantu z wyrównaną żywicą niklowo-NTA i przemyciu w celu usunięcia zanieczyszczeń, eluuj docelowe białko buforem eluacji i zbieraj frakcje eluatu. Kontynuuj zbieranie frakcji, aż absorpcja eluatu w odległości 280 nanometrów spadnie poniżej 0,01.
Następnie przelej zgromadzony eluat do rurki dializacyjnej i zdializuj go przy buforze dializacyjnym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez noc. Po dializach skoncentruj roztwór za pomocą urządzenia ultrafiltracyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie MSP od dwóch do pięciu miligramów na mililitr. Waż około 250 miligramów bio-kulek do rurki wirówki o pojemności 50 milimetrów.
Dodaj 25 do 30 mililitrów metanolu do rurki. Dokładnie obróć lub zawortuj mieszankę w ciemności. Po wysybaniu rurki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut ostrożnie wyrzuć supernatant i powtórz płukanie metanolem jeszcze dwa razy.
Wykonaj podobne mycia z podwójnie destylowaną wodą trzy razy, a następnie dodaj 25 do 30 mililitrów buforu bezdetergentowego i niskosolnego do kulek. Potrząsaj lub obracaj rurkę na obracającym się stole, aby wymieszać i inkubować, jak pokazano wcześniej. Usuń supernatant i powtórz krok równoważenia buforu niskosolnego trzy razy, aby w pełni ukształtować kulki.
Podziel aktywowane bio-kulki równomiernie na trzy mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do dalszego użycia. Pobierz jedną aliquotę przygotowanego zapasu lipidowego i rozmroz go. Natychmiast wiruj probówkę w temperaturze 7 000g przez pięć sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać zawartość na dnie.
Ultrasonikanowanie lipidów w kąpieli wodnej o amplitudzie 60% i monitorowanie klarowności oraz temperatury co pięć do dziesięciu minut, aby zapobiec przegrzaniu. Kontynuuj sonikację, aż zapas lipidów stanie się przezroczysty i przejrzysty. Oblicz molową ilość docelowego białka błonowego za pomocą przedstawionego równania.
Następnie oblicz wymagane objętości roztworów MSP i lipidów na podstawie molowego stosunku stechiometrycznego białka docelowego do MSP do lipidów w wynoszeniu od jeden do pięciu do 250. Połącz odpowiednie objętości lipidów i MSP, aby przygotować mieszankę główną o pojemności 300 mikrolitrów i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Następnie powoli dodaję 50 mikrolitrów mieszanki do skoncentrowanego roztworu białkowego, delikatnie pipetując, aby zapewnić jednorodność.
Następnie umieść połączoną mieszankę na lodzie na godzinę i delikatnie odwracaj rurkę co 15 minut, aby dokładnie wymieszać. Teraz weź jedną aliquotę z wcześniej aktywowanych bio-kulek i zasysaj resztkowy bufor o niskiej zawartości soli. Dodaj roztwór białkowy do kulek i inkubuj w ciemności przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wiruj mieszankę w temperaturze 7 000g przez pięć sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś supernatant do drugiej aliquoty bio-kulek, z których został zasysany bufor o niskiej zawartości soli. Po dokładnym wymieszaniu zawartości przez delikatną inwersję, inkubuj w ciemności przez cztery do ośmiu godzin lub przez noc.
Po krótkim odwirowaniu roztworu białkowego przenieś supernatant do trzeciej aliquoty preaktywowanych bio-kulek. Inkubuj z rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez godzinę. Po krótkim wirowaniu przelej supernatant do czystej rurki mikrowirówki.
Wirówka w temperaturze 17 000g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć kruszywa. Po oczyszczeniu kompleksów nanodysku TASK2 za pomocą chromatografii wykluczenia wielkościowego, zgromadzmy frakcje pików z elucii i skoncentrujemy je do końcowego stężenia nanodysku TASK2 wynoszącego 1,2 do 1,5 miligrama na mililitr. Aby zweryfikować skład nanodysku, przeanalizuj próbki przy użyciu 12% SDS-PAGE i potwierdz obecność MSP oraz docelowego białka błonowego.
Profil chromatografii z wykluczeniem rozmiaru wykazał dwa główne piki odpowiadające złożonemu kompleksowi nanodysku o 15,1 mililitra oraz wolnym MSP przy 18,0 mililitrach. Ilościowa liczba powierzchni szczytów wykazała, że złożony pik nanodysku miał powierzchnię 147,2. Dla porównania, szczyt free-MSP miał powierzchnię 31,5, co odpowiadało efektywności montażu na poziomie 82,4% komigracji docelowego białka, a MSP w SDS-PAGE potwierdził ich włączenie do pojedynczego kompleksu nanodysku.
Protokół ten pomaga naukowcom badać strukturę białek błonowych przy użyciu budowy nanodysków. Najtrudniejszą częścią jest optymalizacja stosunku białka błonowego, MSP, do lipidów. Za pomocą tej procedury można również wykonywać testy funkcjonalne, rezonans plazmonu powierzchniowego oraz spektrometrię mas.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia powtarzalny protokół rekonstytucji ludzkiego kanału potasowego Task2 w nanodyski z wykorzystaniem białek rusztowujących błony (MSP) oraz fosfolipidów. Podejście to rozwiązuje powszechne problemy w badaniach strukturalnych białek błonowych, takich jak niestabilność i heterogeniczność w środowiskach opartych na detergentach, oraz umożliwia analizę za pomocą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) o wysokiej rozdzielczości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Biochemia białek błonowych
- Kriomikroskopia elektronowa
Wstęp
- Białka błonowe często tracą stabilność i aktywność podczas ekstrakcji detergentami.
- Heterogeniczność próbek utrudnia badania kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) o wysokiej rozdzielczości.
- Technologia nanodysków zapewnia białkom błonowym środowisko lipidowej dwuwarstwy zbliżone do naturalnego.
- Task2 jest ludzkim kanałem potasowym stanowiącym przedmiot analizy strukturalnej.
Cel badania
- Opracowanie skutecznego schematu postępowania w celu rekonstytucji białka Task2 w nanodyski.
- Walidacja jakości i homogeniczności kompleksów Task2-nanodysk.
- Ustanowienie ram metodologicznych dla badań strukturalnych białek błonowych.
Zastosowane metody
- Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego białka Task2 w obecności detergentów.
- Montaż Task2 w nanodyskiach przy użyciu białek MSP i fosfolipidów.
- Walidacja za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC) w celu potwierdzenia powiększenia cząsteczek.
- Analiza SDS-PAGE w celu wykazania współmigracji Task2 i MSP.
- Dwuwymiarowe uśrednianie klas oraz wstępna rekonstrukcja 3D metodą cryo-EM.
Główne wyniki
- Profilem SEC wykazano wyraźne przesunięcie, co wskazuje na pomyślny montaż nanodysków.
- Analiza SDS-PAGE potwierdziła ko-migrację Task2 i MSP, co dowodzi powstania kompleksu.
- Średnie klas 2D wykazały wyraźnie zdefiniowane cechy struktury drugorzędowej.
- Wstępna rekonstrukcja 3D potwierdziła integralność Task2 osadzonego w nanodysku.
Wnioski
- Protokół pozwala na uzyskanie czystych, homogenicznych i strukturalnie nienaruszonych kompleksów Task2-nanodisc.
- Ten schemat pracy poprawia jakość próbek do wysokorozdzielczych badań cryo-EM.
- Metodyka ta ma szerokie zastosowanie w przypadku innych białek błonowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niestabilność i heterogeniczność białek błonowych w systemach opartych na detergentach ograniczają niezawodność wysokorozdzielczych badań strukturalnych, co utrudnia wczesne etapy odkrywania leków. Technologia nanodysków umożliwia stabilizację i oczyszczanie białek błonowych w natywopodobnej dwuwarstwie lipidowej, co bezpośrednio poprawia jakość próbek do analizy cryo-EM. Ten postęp metodologiczny zwiększa pewność predykcji i zmniejsza ryzyko związane z walidacją trudnych celów terapeutycznych wśród białek błonowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie struktury i funkcji białek błonowych w środowisku zbliżonym do naturalnego.
- Ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zachowanie aktywności i konformacji białek.
- Wspiera rzetelną walidację celu dzięki poprawie homogeniczności i integralności próbek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie wysokiej jakości, powtarzalnych próbek białek do dalszych analiz.
- Poprawia standaryzację analiz poprzez minimalizację heterogeniczności i niestabilności próbek.
- Umożliwia wiarygodną ocenę oddziaływań związków z białkami błonowymi o zachowanej strukturze.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ramy metodologiczne pozwalające na rozszerzenie wniosków strukturalnych na inne białka błonowe istotne w kontekście chorób.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, zapewniając odpowiednią jakość próbek do badań strukturalnych i funkcjonalnych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju projektu poprzez umożliwienie strukturalnej charakterystyki o wysokiej rozdzielczości.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda stabilizacji oparta na nanodyskach znajduje zastosowanie na styku wczesnej fazy odkrywania leków i biologii strukturalnej, umożliwiając przejście od identyfikacji celu do charakterystyki związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla białek błonowych będących celem badań.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, homogeniczne próbki odpowiednie do ilościowych analiz biofizycznych i funkcjonalnych.
- Analityka: Zapewnia wysokiej jakości odczyty za pomocą SEC, SDS-PAGE oraz cryo-EM do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z przedklinicznymi schematami pracy, umożliwiając badania strukturalne białek istotnych dla rozwoju chorób.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalny protokół dla różnorodnych białek błonowych w ramach różnych portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje ryzyko mechanistyczne w badaniach nad białkami błonowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i zwiększa powtarzalność badań strukturalnych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu analiz wysokiej rozdzielczości na wcześniejszym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów białkowych błonowych do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie ekspresji i oczyszczania białek błonowych oraz składania nanodysków.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury SEC, SDS-PAGE oraz cryo-EM w celu walidacji i analizy.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa, aby zapewnić powtarzalność dla różnych białek docelowych.
- Może być konieczne dostosowanie składu lipidów lub białek rusztowujących dla różnych białek błonowych.
- Jakość i homogeniczność próbek muszą być walidowane na każdym etapie procesu.
