Model urazu hipoksji i reoxygenacji u samoorganizujących się ludzkich kardioidów

Nasze badania koncentrują się na poszukiwaniu nowych sposobów wspomagania regeneracji serca po urazie. W tym celu generujemy samoorganizujące się organoidy sercowe i przeprowadzamy badania hipoksji i reoxygenacji. Protokół ten może być stosowany do badania reakcji na urazy, interwencji terapeutycznych wspierających regenerację oraz może być wykorzystywany do modelowania chorób specyficznych dla pacjenta.

Na początek należy aspirować ośrodek specyficzny dla mezodermy serca D1 i dodać wystarczającą ilość roztworu odłączającego komórki, aby całkowicie pokryć pluripotentne komórki międzydermy sercowej pochodzące z komórek macierzystych pochodzące z człowieka. Następnie umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Za pomocą pipety dodaj równą objętość ośrodka międzydermy serca D2 do każdego dołka i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić przylegające komórki, następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Za pomocą wirówki rozpuszczaj ogniwa w temperaturze 300G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesij pellet w jednym mililitrze pożywki specyfikacyjnej D2 dla mezodermy sercowej zawierającej pięć mikromolów IWP-2 oraz 50 mikrogramów kwasu askorbinowego na mililitr w RB minus. Wymieszaj 10 mikrolitrów trypan blue z 10 mikrolitrami zawiesiny komórkowej w mikrorurce.

Policz komórki preferowaną metodą liczenia, a następnie rozcieńcz je do stężenia 100 000 komórek na mililitr w podłożu D2 do mezodermy serca, uzupełnionym o dwa mikromolowe tiazoviwiny. Przenieś zawiesinę ogniwa do odpowiednio dopasowanego zbiornika odczynnikowego. Następnie, używając pipety wielokanałowej, podaję 100 mikrolitrów do każdego dołka płytki z ultra-niskim mocowaniem na 96 dołków, aby uzyskać końcowe stężenie 10 000 komórek na otwór.

Obracaj płytę w temperaturze 500G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wywołać powstawanie organoidów serca u człowieka w hodowli zawiesiny. Obserwuj powstawanie dużego, dobrze ograniczonego pelletu komórkowego w każdej dołce. Jeśli granulek nie jest ograniczony, powtórz wirowanie.

Po 24 godzinach przygotuj 10 mililitrów podłoża D3 zawierającego pięć mikromolowych IWP-2 oraz 50 mikrogramów kwasu askorbinowego na mililitr w RB minus na płytkę. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 mikrolitrów medium D3 do każdej dołki, nie usuwając żadnych istniejących nośników. Następnego dnia usuń 100 mikrolitrów podłoża D3 z każdego dołku.

Aby zminimalizować ryzyko aspiracji, przechyl płytkę pod kątem 45 stopni i trzymaj pipetę wielokanałową pod kątem 90 stopni względem ścianki płyty. Umieść pipetę mocno na ścianie wejścia i powoli ją zasysaj. Po usunięciu podłoża należy zastąpić go 100 mikrolitrami ośrodka D4 zawierającego pięć mikromolów IWP-2 w RB minus.

Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów z odciętą końcówką, przenieś ludzkie organoidy sercowe do rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Pozwól organoidom opaść na dno rurki i delikatnie usuń nadmiar materiału. Dodaj sól fizjologiczną z buforem fosforanowym do przemycia organoidów raz.

Poczekaj kilka sekund, aż opadną, i delikatnie usuń nadmiar PBS. Następnie dodaj 4% paradehydu formalnego, aby utrwalić organoidy, i umieść rurkę w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby umożliwić utrwalenie. Następnie przenieś pożądaną liczbę organoidów stałych do rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra.

Usuń roztwór utrwalający i przepłucz organoidy PBS zawierającym 0,1% Tween 20. Przygotuj pierwotny roztwór przeciwciał, rozcieńczając go do pożądanego stężenia w roztworze barwiącym. Za pomocą pipety dodaj od 50 do 100 mikrolitrów pierwotnego roztworu przeciwciał do każdej rurki mikrowirówki, zapewniając pełne pokrytie organoidów.

Po inkubacji i kolejnych płukaniach inkubuj próbkę z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w roztworze barwniczym przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na platformie do wstrząsania. Po inkubacji wykonaj płukania zgodnie z opisaną wcześniejszą metodą. Następnie, używając wyciętego końcówki pipety, przenieś organoidy na dodatnio naładowany szklany szkiełek.

Delikatnie usuń nadmiar PBS Tween 20 i dodaj kilka kropli materiału montażowego, aby zakryć organoidy. Ostrożnie załóż na organoidy pokrywkę, aby je spłaszczyć. Następnie przeszedł do wykonania mikroskopii fluorescencyjnej.

Po wybudowaniu utrwalonych organoidów przez noc w 30% sacharozy przy czterech stopniach Celsjusza, przełóż je do plastikowej formy i dodaj do formy niewielką kroplę związku o optimalnej temperaturze cięcia, tylko tyle, by zakryć organoidy. Używając cienkiej pęsety lub końcówki pipety, delikatnie przestaw organoidy w masie tak, aby nie były zlepione i nie oddalały się od krawędzi formy. Umieść organoidy jak najbliżej dna formy, aby zmaksymalizować ich liczbę obecnych w pojedynczej kriosekcji.

Włóż formę do chłodziarki styropianowej zawierającej warstwę suchego lodu, aby zamrozić początkową warstwę związku o wysokiej temperaturze cięcia. Poczekaj kilka minut, aż masa stwardnieje, a potem przenieś formę na blat. Dodaj dodatkową masę do optymalizacji temperatury cięcia, aż forma zostanie wypełniona.

Pozwól pierwszej warstwie całkowicie się roztopić, zanim ponownie przetasz formę do suchego lodu, aby całkowicie zamroziła. Po zamrożeniu przechowuj formy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub przechodź do kriosekcji, aby uzyskać sześciomikrometrowe przekroje. Za pomocą pipety przenieś pięć mililitrów ośrodka do niedołków na 96-dołkowy ludzki organ organoidowy serca do kolby do hodowli komórek.

Umieść kolbę w komorze hipoksji i przepłucz komorę gazem beztlenowym składającym się z 5% dwutlenku węgla i 95% azotu przez trzy minuty. Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę przed zainicjowaniem hipoksji. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń około 150 mikrolitrów medium ze wszystkich dołków płytki organoidalnej serca człowieka.

Następnie, używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów, ostrożnie usuń pozostałe medium z każdego dołka, nie naruszając organoidów. Dodaj 50 mikrolitrów podłoża hipoksyjnego do każdego dołku. Umieść płytkę organoidalną serca człowieka w komorze hipoksji.

I przepłukać komorę gazem beztlenowym składającym się z 5% dwutlenku węgla i 95% azotu przez trzy minuty. Umieść komorę hipoksji w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na sześć godzin. Aby rozpocząć ponowne natlenienie, usuń ludzkie organoidy sercowe z komory hipoksji.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj do każdego dołku 150 mikrolitrów wcześniej podgrzanego RB+medium. Na koniec umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól na co najmniej trzy godziny na ponowne natlenienie przed przeprowadzeniem dalszych testów. Po sześciu godzinach hipoksji i 24 godzinach reperfuzji aktywność dehydrogenazy mleczanowej z zewnątrzkomórkowych komórek mleczanowych została istotnie zwiększona u uszkodzonych organoidów serca w porównaniu do osób kontrolnych bez uszkodzeń.

Organoidy sercowe leczone hipoksją wykazywały jądra kardiomiocytów TUNEL-dodatnie, a odsetek jąder kardiomiocytów TUNEL-dodatnich był istotnie wyższy u uszkodzonych organoidów w porównaniu do osób kontrolnych. Zaobserwowano zależny od czasu wzrost powstawania blizn wraz ze wydłużającym się czasem niedotlenienia przed ponownym natlenieniem powietrza. Po 24 godzinach po reperfuzji 69% nieuszkodzonych ludzkich organoidów sercowych biło, podczas gdy żaden z uszkodzonych organoidów nie bił.

Nieuszkodzone ludzkie organoidy sercowe wykazywały zsynchronizowane przejściowe zjawiska wapnia w pięciu obszarach zainteresowania, z pikami występującymi jednocześnie i o podobnych przebiegach fal. Uszkodzone ludzkie organoidy sercowe nie wykazywały skoordynowanych skurczów, lecz nieregularne, spontaniczne przejściowe jawności wapnia w obszarach zainteresowania. Protokół ten pozwala naukowcom naśladować zawał mięśnia sercowego w ludzkich organoidach sercowych pochodzących z iPSC.

Największym wyzwaniem technicznym w zapewnieniu powtarzalnych uszkodzeń jest całkowite usunięcie istniejących mediów. Nasze przyszłe badania mają na celu identyfikację czynników, które mogą wspierać regenerację tkanek w ludzkich modelach organoidów sercowych.