Pobieranie próbek DNA środowiskowych z jednostek obserwatorskich wielorybów w celu monitorowania waleni

Protokół ten zapewnia ustandaryzowane podejście do pobierania próbek eDNA wielorybów podczas rejsów obserwatorskich. Dostępnych jest wiele różnych metod pobierania próbek eDNA. To utrudnia analizę danych porównawczą.

Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem warunków środowiskowych i zabezpiecza przed zanieczyszczeniem. Przy wsparciu laboratorium radia eDNA protokół ten może być realizowany przez osoby niebędące ekspertami oraz naukowcami obywatelskimi podczas obserwacji wielorybów i na całym świecie. Na początek przygotuj materiały terenowe, w tym arkusze danych terenowych oraz laminowany krok po kroku protokół terenowy do pobierania próbek DNA środowiskowych waleni.

Umieść wodoodporny marker, dwa filtry eDNA na każdy odcisk fleka, odpowiednią liczbę rękawiczek i dedykowany pojemnik na odpady w pudełku. Przygotuj jedno lub więcej sztywnych wiader odpowiednich do typu statku i konfiguracji pokładowej, wtórny pojemnik DNA środowiskowy oraz przenośną pompę perystaltyczną lub próżniową. Zakładaj rękawiczki podczas obsługi sprzętu i zmieniaj je między zadaniami.

Aby wysterylizować sprzęt, należy stosować rozcieńczony roztwór wybielacza domowego, równomiernie rozpryskując wszystkie powierzchnie wiader, pokrywek, pojemników i rur pompy. Dokładnie przepłucz wodą z kranu trzy razy. Zabierz wszystkie materiały na pokład przed przyjazdem pasażerów i przechowaj je w wyznaczonym czystym miejscu.

Koordynacja, czas pobierania próbek i pozycjonowanie jednostki wraz z załogą jednostki. Obserwuj wzorce wynurzania się na wodzie, aby przewidzieć nurkowania wielorybów. Pobierz 20 litrów wody morskiej z odcisku fłetki tak szybko, jak to możliwe, zapewniając nie więcej niż 10 minut opóźnienia po zanurzeniu wieloryba.

Pobieranie próbek z różnych regionów, stosując dostosowane warunki logistyczne dostosowane do każdej lokalizacji i typu jednostki. W razie potrzeby przetransportuj zebraną wodę do wyznaczonej stacji filtracyjnej na pokładzie, unikając rozcieku. Zapisz tożsamość gatunku, współrzędne systemu pozycjonowania geograficznego, czas oraz identyfikację replikacji próbek w arkuszu danych.

Zmień rękawice przed filtracją. Otwórz woreczek filtracyjny i dotykaj filtra tylko przy wyjściu. Włóż wlot do rurki, a następnie podłącz rurkę pompy do wylotu.

Zanurz rurkę w próbce wody bez zanurzania obudowy filtra i ustaw pompę na szybki, stały przepływ. Filtruj 10 litrów nieprzerwanie, monitorując stabilność przepływu. Następnie odwróć filtr i uruchom pompę przez 30 do 60 sekund, aby usunąć resztki wody.

Dostosuj układ pompy filtrującej do warunków polowych. Wyłącz pompę i odłącz rurkę. Włóż filtr do oryginalnego woreczka i natychmiast go oznacz.

Zmień rękawice i przygotuj się do filtracji przy drugim replikacyjnym zabiegu. Przechowuj samoochronne filtry DNA środowiska w bezpiecznym, suchym pojemniku w zacienionym pomieszczeniu o temperaturze otoczenia. Filtry należy przechowywać w lodówce, jeśli temperatura otoczenia przekracza 20 stopni Celsjusza i wysłać je w ciągu trzech miesięcy.

Wszystkie procedury laboratoryjne wykonuj w dedykowanych pomieszczeniach sterylizowanych w ultrafioletowym i z odpowiednią wentylacją. Po założeniu rękawiczek i odzieży ochronnej bez DNA, dokładnie wyczyść stoły warsztatowe. Za pomocą kleszczy wolnych od DNA złóż membranę filtra w trójkąty i przenieś ją do rurki reakcyjnej o średnicy dwóch mililitrów, z końcówką skierowaną w dół.

Do każdej probówki reakcyjnej dodaj 400 mikrolitrów buforu lizowego składającego się z 380 mikrolitrów buforu TES i 20 mikrolitrów proteinazy K. Krótko wiruj i inkubuj w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny z poruszeniem. Włóż filtr do plastikowego wlotu z perforowanym dnem i wiruj w 18 626G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby oddzielić bufor lizy od filtra.

Odczynniki do ekstrakcji pipety do płyt płuczących i elucijnych. Używaj wielu płytek wiążących, jeśli całkowita objętość lizatu przekracza 300 mikrolitrów. Wiruj magnetyczne cząstki i dodaj 30 mikrolitrów na dołek w pierwszej płycie wiązania.

Uruchom wstępny program pobierania DNA dla dwóch płytek wiążących oraz kolejny program ekstrakcji DNA na robocie. Aby uruchomić wszystkie reakcje QPCR w potrójnym egzemplarzu, przygotuj wymaganą mieszankę główną w dedykowanym workspace i rozprowadz ją na odwierty. Do każdego dołku dodaj trzy mikrolitry docelowego standardu DNA lub ekstraktu eDNA.

Po uszczelnieniu przygotowanej płyty PCR wiruj ją w 3 500G przez 10 sekund, a następnie podłącz ją do ilościowego termocyklera PCR w czasie rzeczywistym. Na koniec przeprowadź test w zoptymalizowanych warunkach cyklicznych. W zatoce Skjalfandi na Islandii oraz na Azorach zebrano 247 próbek DNA środowiskowego lub eDNA, obejmując zebranie do 10 litrów wody morskiej z dwoma samozachowawczymi filtrami eDNA na odcisk förnda.

Spośród 44 analizowanych filtrów eDNA dla eDNA humbaka, 20 dało sygnały amplifikacyjne, podczas gdy 24 nie wykazały amplifikacji. Puste wyboje ekstrakcji, kontrole terenowe i ilościowe kontrole PCR nie wykazały wykrywalnego amplifikacji, co wskazuje na brak zanieczyszczenia. Wśród pozytywnych reakcji dziewięć filtrów eDNA wykazało co najmniej jedną wartość progową cyklu poniżej granicy wykrywania i zostały sklasyfikowane jako wiarygodne detekcje.

Pozostałe 11 filtrów EDNA dawało wartości progowe cyklu przekraczające granicę wykrywalności, wskazujące na prawdopodobne wykrycia. Wartość progu średniego cyklu była nieco niższa w filtrach eDNA na Azorach, około 34,7, w porównaniu do filtrów islandzkich o wartości około 36,9. Różnica w wartościach progowych cyklu między filtrami eDNA z Azorów i Islandii nie była statystycznie istotna.

Protokół ten może być wykorzystywany w przyszłych dużych kampaniach pobierania próbek eDNA w celu badania bioróżnorodności morskiej lub genetyki populacji wielorybów. Protokół ten umożliwia nieinwazyjne wykrywanie i monitorowanie waleni oraz współwystępujących taksonów za pomocą eDNA zawartego w odciskach mołtwi zebranych z jednostek obserwatorów wielorybów.