Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Sieć Trybu Domyślnego, czyli DMN, to kluczowa, szeroko zakrojona sieć, powiązana z różnymi funkcjami poznawczymi oraz zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak depresja. Badanie złożonej dynamiki DMN w modelach zwierzęcych dostarcza bezcennych informacji na temat jego funkcji zarówno w stanie zdrowym, jak i patologicznym. Jednak poważnym wyzwaniem było przeprowadzanie stabilnych, długoterminowych i dużych rejestracji elektrofizjologicznych z wielu głębokich i rozproszonych węzłów, DMN, u myszy zachowujących się na jawie.

Przedstawiamy tutaj nowatorski protokół chirurgiczny dwufazowy opracowany w laboratorium Eero Castren. Technika ta tworzy duże, trwałe i zamykalne okno czaszki, umożliwiające powtarzające się podłużne zapisy z ponad 1 000 kanałów elektrod jednocześnie. Osiąga się to poprzez połączenie mikroelektrokortykografii powierzchniowej, mikro-ECoG, z dwoma sondami Neuropixels, co umożliwia bezprecedensowy dostęp do sieci Default Mode Network.

Ten film przedstawi krok po kroku przewodnik po tym solidnym zabiegu chirurgicznym – od przygotowania zwierząt i wszczepienia płyty głowy po stworzenie przewlekłego okna czaszki, zapewniając wysokiej jakości, długoterminowe pozyskiwanie danych do badań w neurobiologii sieciowej. Wszystkie pokazane procedury zostały zatwierdzone przez Krajową Radę Eksperymentów w Finlandii i są zgodne z europejską dyrektywą dotyczącą ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Faza 1, przygotowanie zwierząt i implantacja płyty głowowej.

Aby przeprowadzić ten zabieg, zacznij od przygotowania wszystkich niezbędnych materiałów chirurgicznych i sprzętu. Znieczulaj mysz 4% izofluranem i utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5 do 2,5% przy przepływie tlenu 0,5 litra na minutę. Ogol sierść z czubka głowy i umieść zwierzę na kontrolowanej poduszce grzewczej wyposażonej w wewnętrzny czujnik temperatury skalibrowany tak, by utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały zabieg.

Stosuj maść karbomerową do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramce tak, aby czaszka leżała płasko i podaj przedoperacyjne środki przeciwbólowe oraz przeciwzapalne za pomocą podskórnych zastrzyków: karprofenu, buprenorfiny i deksametazonu. Dezynfekuj ogolone miejsce roztworem povidonu i jodu oraz wstrzyknij roztwór lidokainy-epinefryny jako miejscowe znieczulenie pod skórę głowy.

Wykonaj małe nacięcie poprzeczne w okolicy ucha i stopniowo je powiększaj, aby całkowicie odsłonić górną część powierzchni czaszki. Ostrożnie oczyść odsłoniętą czaszkę acetonem, aż wszystkie widoczne okostki zostaną usunięte, aby zapewnić silne przyleganie implantu. Użyj tępego, okrągłego ostrza skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałości tkanki okostnej i łącznej, których płukanie acetonem nie rozwiązało w pełni.

Za pomocą urządzenia stereotaktycznego zaznacz prostokątny obszar czaszki o wymiarach 4 milimetrów na 7,6 milimetrów względem bregmy. Prostokąt powinien rozciągać się na dwa milimetry boczne od bregmy po obu stronach, trzy milimetry rostralnie i 4,6 milimetra kaudalnie. Następnie zaznacz dwa miejsca wkłucia sondy wewnątrzczaszkowej na prawej półkuli.

Oznacz miejsce sondy rostralnej na 1,66 milimetra przed i 1,95 milimetra bocznie od bregmy, a miejsce sondy ogonowo 2,2 milimetra z tyłu i 1,9 milimetra bocznie od bregmy. Następnie wygraweruj wzór krzyżujący się na wszystkich odsłoniętych powierzchniach kości poza wyznaczonym obszarem okna za pomocą ostrza chirurgicznego z numerem 11 i uzyskaj płytkie, ale wyraźnie określone rowki o głębokości około 0,2 do 0,4 milimetra, tworząc jednolitą siatkę o wymiarach około jednego na jeden milimetr. Stwórz aplikator do cienkiego kleju, przyklejając sterylną igłę 30G do końcówki patyczka i wyginając igłę w kształt litery V.

Rozsyp klej cyjanoakrylanowy do jednorazowej plastikowej wagi i zanurz aplikator w zbiorniku kleju. Nałóż klej na każdą odsłoniętą i wygrawerowaną powierzchnię kości, nakładając nie więcej niż jeden osad na miejsce, aby pokrycie było dokładne, ale nigdy zbyt duże. Pozwól klejowi wyschnąć przez siedem minut przed dalszym działaniem.

Aby wszczepić gniazdo odniesienia, wybierz miejsce wiercenia zamiast lewego móżdżku, aby uniknąć widocznych naczyń powierzchownych. Wierć otwór pilotowy w seriach co pięć do dziesięciu sekund, używając okrągłego stalowego żarna o prędkości 20 000 do 25 000 strzałów na minutę, aż otwór stanie się bardziej przezroczysty, odsłaniając jasnoróżowy odcień. Włóż pozłacane gniazdo referencyjne do otworu pilotowego, zabezpiecz je klejem cyjanoakrylanowym i wzmocnij złącze cementem dentystycznym utwardzającym promieniowanie UV.

Utwardz cement dentystyczny lampką LED do utwardzania przez minutę. Następnie nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego do utwardzania UV na wierzchołek odsłoniętej kości rostralnej i połóż płytkę głowy pod czaszką tak, aby jedna krawędź opierała się o rusztowanie cementowe, utwardzone wokół gniazda referencyjnego, a przeciwległa krawędź spoczywała na świeżym dabcie cementu rostralnego. Upewnij się, że płyta głowowa jest wyśrodkowana i wypoziomowana.

Wzmocnij konstrukcję, nakładając cement dentystyczny wokół podstawy płytki głowy i okrążając wygrawerowaną kość oraz gniazdo odniesienia, aż wokół obwodu przyszłego okna czaszki powstanie ciągłe, szczelne obudowanie. Na koniec utwardził cement dentystyczny lampką LED do utwardzania przez minutę. Gdy cement całkowicie utwardzi, pozwól myszy obudzić się z znieczulenia.

Pierwsza faza jest już zakończona. Pozwól myszy odpoczywać przez co najmniej 48 godzin, zanim przejdziesz do kolejnej fazy. Faza 2, Przewlekłe tworzenie okien czaszkowych.

Druga faza wymaga tych samych narzędzi i leków co pierwsza, z wyjątkiem znieczulenia miejscowego. Dodatkowo ta faza wymaga sterylnej, cienkiej membrany PDMS, zimnego, sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego przechowywanego na lodzie, silikonowego uszczelniacza elastomerowego oraz specjalnie wydrukowanej 3D nakrętki ochronnej. Co najmniej 48 godzin po pierwszej operacji ponownie znieczulić mysz izofluranem, umieścić ją na poduszce grzewczej na stereotaktycznej ramie i podać leki przedoperacyjne jak w pierwszej fazie, z wyjątkiem miejscowego znieczulenia lidokainowo-epinefryny.

Rozpocznij przerzedzanie kości wiertarką dentystyczną wzdłuż prostokąta zaznaczonego w Fazie 1, zaczynając od 25 000 strzałów na minutę, trzymając urządzenie wiertnicze pod kątem 90 stopni względem powierzchni kości, i wykonaj jedno lub dwa nieco głębsze przejścia wzdłuż krawędzi prostokąta, aby utworzyć początkowy rowek tnący. Wywierć płytkie rowki w kości i cement dentystyczny przylegający do okna czaszki na dwóch współrzędnych wszczepienia sondy. Te rowki służą jako trwałe wizualne punkty orientacyjne, które pozostają widoczne po usunięciu płata kostnego i służą do powtarzalnego przesuwania sond wewnątrzczaszkowych podczas kolejnych sesji elektrofizjologicznych.

Regularnie stosuj lodowaty, sterylny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy podczas wiercenia, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym kory podłoża i zminimalizować krwawienie. Stopniowo zmniejszaj prędkość wiertła do 20 000 strzałów na minutę, gdy kość się przerzedza. Kontynuuj wiercenie wzdłuż obwodu prostokąta, aż kość w obrycie będzie mniej więcej w 90% przerzedzona.

Nie wierć całkowicie przez czaszkę. Przełącz się na cienko zakrzywiony haczyk dura. Z dużą ostrożnością włóż czubek pod krawędź cienkiej kości i przesuwaj hak wzdłuż obwodu okna, ostrożnie odłączając płat kostny od otaczającej czaszki i tkanki pod spodem.

Delikatnie podnieś skutecznie odłączoną płat kostny haczykiem na oponę twardą w kierunku tylnym do przodu, około 35 stopni nad powierzchnią czaszki. Chwyć uniesioną krawędź kleszczami i delikatnie kołysz w lewo i prawo, aż płytka całkowicie się uwolni. Delikatnie usuwaj odsłonięty obszar z zakrzepłej krwi powtarzającymi się płukaniami lodowatego ACSF.

Po ustąpieniu krwawienia umieść pojedynczą sterylną, prefabrykowaną membranę PDMS bezpośrednio pod powierzchnią oponę. Przy odpowiednim rozmiarze dokładnie zakrywa okno i pasywnie przylega do twardej oponu, trzymając ją płasko przy mózgu. Uszczelnij kraniotomię, nakładając silikon.

Wypełnij każdą szczelinę między obudową cementu dentystycznego a wewnętrzną krawędzią płyty głowy, całkowicie otaczając i nakładając na krawędzie membrany BDMS. Przyklej na główkę specjalnie wydrukowaną 3D ochronną nasłonę niewielką ilością kleju cyjanoakrylowego, aby chronić okno między sesjami nagraniowymi. Mysz jest teraz gotowa do rekonwalescencji i powinna zostać przeniesiona do swojej domowej klatki na indywidualne schronienie, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.

Udana operacja skutkuje przejrzystym, przejrzystym oknem nad korą, z widocznym naczyniem i minimalnymi oznakami stanu zapalnego lub infekcji. Ta przejrzystość może być utrzymywana przez ponad 21 dni, co umożliwia długoterminowe badania podłużne. Surowe sygnały elektrofizjologiczne rejestrowane przez przewlekłe okno utrzymywały wysoką jakość w całej linii czasowej podłużnej.

Tutaj reprezentatywne szerokopasmowe ślady mikro-ECoG pobrane z tylnej siatki retrosplenialnej oraz jednoczesne ślady potencjału pola lokalnego wewnątrzczaszkowego pobrane z powierzchownego kanału korowego są wyświetlane obok siebie przez pierwszy dzień rejestracji i 21 dni po nim. Nagrania z dnia 21 wykazują porównywalną amplitudę sygnału, zawartość spektralną oraz brak artefaktów ruchu i szumów w porównaniu do nagrań z dnia 0 tego samego zwierzęcia, co potwierdza, że ani przewlekła obecność błony PDMS i silikonowej uszczelki, ani powtarzające się nakłucia oponowe nie wprowadziły wykrywalnej degradacji jakości sygnału powierzchni lub wewnątrzczaszki w warstwach kory powierzchownej, gdzie najpierw spodziewano się degradacji. Główną walidacją tej techniki jest pozyskiwanie stabilnych, wysokiej jakości multimodalnych danych elektrofizjologicznych w czasie.

Okno z możliwością ponownego zamknięcia pozwala na wielokrotne wprowadzanie sond do rejestrowania tych samych populacji neuronów przez tygodnie. W całym paśmie alfa macierze wartości blokowania fazowego obliczone z kanałów wzdłuż sondy elektrody wewnątrzczaszkowej o wysokiej gęstości ogonowej wykazują stabilną architekturę funkcjonalną między stanem wyjściowym a sesją po zabiegu w dniu 21. Pokazuje to powtarzalną reinsercję do tego samego miejsca korowego, a nie formalne śledzenie tych samych neuronów.

Chociaż niewielka translacja wstawienia trzonka wyklucza roszczenie do tej samej jednostki, zachowana jest struktura laminarna agregatu i regionalna oddziaływania pasma alfa, co potwierdza, że przewlekłe okno pozwala na podłużne próbkowanie tego samego obwodu funkcjonalnego. Aby bezpośrednio zweryfikować, że przewlekłe okno umożliwia powtarzalne laminarne celowanie tych samych głębokich struktur między sesjami, obliczono gęstość prądu lub mapy CSD z kanałów LFP sond. Profile CSD wywołane bodźcem pokazują, że oczekiwane sygnatury laminarnego źródła zlewającego, w tym kora przedprzedkowa i przedni obszar obręczy, są zachowane między sesjami.

Laminarne profile mocy między obiema sesjami są bardzo podobne między sesjami, a korelacja Pearsona wynosi 0,81. Różnice obserwowane w wtórnej korze ruchowej prawdopodobnie wynikają z różnic w ruchach pomiędzy nagraniami. Ponieważ wykresy CSD zawierają informacje anatomiczne, mogą dostarczać w trakcie sesji nieuleczalny odczyt tego, które obszary mózgu każda sonda obecnie pobiera próbki, niezależnie od barwienia tkanek pośmiertnych.

Powtarzalność umieszczenia mikro-ECoG powierzchni w trakcie sesji jest ilościowo określana niezależnie od odczytu CSD wewnątrzczaszkowego. Mapy przestrzenne ograniczone pasmem obliczone z siatki mikro-ECoG w dniu 0 i 21 są nakładane, a korelacja pikselowa obu map jest obliczana oddzielnie dla podsiatki rostralnej i ogonowo. Korelacje profili subsiatkowych pozostają wysokie, a przestrzenne kody kreskowe obu sesji widocznie współlokalizują te same gorące punkty mocy kory zarówno na rostralnej, jak i ogonowej połowie układu.

Sinusoidalna kolejka wyrównania widoczna przez przezroczystą siatkę wraz z wygrawerowanymi bruzdami kostnymi na współrzędnych włożenia sondy umożliwia zatem powtarzalność umieszczenia mikro-ECoG w skali milimetrowej w ciągu 21-dniowego przedziału podłużnego. Aby dodatkowo potwierdzić tę technikę, wykonano immunohistochemiczne barwienia dla GFAP i IBA1 w pośmiertnych cięciach mózgu około cztery tygodnie po operacji kraniotomii. GFAP są wyrażane przez astrocyty, które są zwiększone w reaktywnej glejoze, takiej jak uszkodzenia mózgu czy stan zapalny.

IBA1 natomiast jest wyrażany przez mikroglej, który jest bardziej aktywny podczas procesów neurozapalnych. Kohorta walidacyjna składała się ze zwierząt, u których przeprowadzono pełną dwufazową operację, a okno czaszkowe zostało następnie ponownie otwierane trzykrotnie w dniu 0, 21 i 22 po operacji. Jednak w tej kohorcie nie przeprowadzono mikro-ECoG ani wszczepień sond wewnątrzczaszkowych.

Okno zostało ponownie uszczelnione między sesjami, podobnie jak podczas nagrywania elektrofizjologicznego. Ta kohorta izoluje więc wkład zapalny przewlekłego okna i powtarzającą się ekspozycję na oponę od wszelkich uszkodzeń tkanek wywołanych sondą. Nie zaobserwowano istotnych różnic w żadnym z markerów między grupą kontrolną bez operacji a grupą z pojazdem, która przeszła operację.

Te reprezentatywne mikrografie nie wykazują jakościowych dowodów na glej reaktywny ani aktywację mikrogleju w obszarze bezpośrednio pod oknem. Jednak niewielki wzrost aktywacji mikrogleju i astrocytów zaobserwowano odpowiednio obok trajektorii sondy i w półkuli wstawienia sondy, co prawdopodobnie mogło być wynikiem zbyt dużej szybkości wstawiania sondy wewnątrzczaszkowej. Udana operacja daje wyraźne, przezroczyste okno na korę mózgową przy minimalnym stanie zapalnym.

Po okresie przewlekłego leczenia może wystąpić pewien obrzęk mózgu. Można to kontrolować poprzez staranne monitorowanie i, jeśli to konieczne, podawanie dodatkowych środków przeciwbólowych. Do nagrań wystarczy zdjąć pokrywkę i uszczelniacz, umieścić siatki mikro-ECoG i sondy Neuropixels oraz rozpocząć zbieranie danych od przytomnego, zachowującego się zwierzęcia.

Podsumowując, ten dwufazowy protokół chirurgiczny zapewnia niezawodną i bardzo skuteczną metodę tworzenia dużego, przewlekłego okna czaszkowego u myszy. Kluczowymi zaletami procedury są minimalne uszkodzenia opony twardej oraz duża ekspozycja, którą zapewnia, co jest kluczowe dla jednoczesnego umieszczenia zarówno powierzchniowych mikro-ECoG siatek, jak i wielu głębokich sond neuropikseli mózgowych. Metoda ta umożliwia bezprecedensowe badania podłużne analizy elektrofizjologicznej całej sieci w obwodach DMN i innych dużych obwodach.

Otwiera drzwi do głębszych badań nad neuronalnymi podstawami złożonych zachowań oraz patofizjologią zaburzeń mózgu, ostatecznie wspomagając rozwój nowych terapii.