Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego
February 27th, 2026
Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.
Nasze badania wykorzystują oprogramowanie morfometryczne do ilościowego określenia, czy etanol i bmp7a oddziałują, powodując subtelne defekty czaszkowo-twarzowe u danio pręgowanych. Miary liniowe pomijają subtelne zmiany. W tej metodzie używamy punktów orientacyjnych do ilościowego określania zmian kształtu, jednocześnie kontrolując różnice w rozmiarze.
Aby zacząć, otwórz oprogramowanie tpsDigs2. Kliknij Input source, potem File, i wybierz zapisany plik TPS Notepad. Kliknij Opcje, aby zwizualizować opcję Narzędzia obrazu.
Ustaw długość odniesienia na 100 mikrometrów i naciśnij na Ustaw skalę. Kliknij OK, aby potwierdzić parametry skalowania, a następnie wyjdź z okna narzędzi obrazu. Następnie kliknij symbol celowania i umieść pierwszy punkt orientacyjny w stawie środkowym między chrząstkami Meckela.
Umieść drugie punkty orientacyjne w dwustronnych stawach między chrząstkami Meckela a chrząstkami palatokwadratowymi. Trzeci punkt orientacyjny umieść w stawie środkowym między chrząstkami ceratohyalnymi, a czwarty na stawach obustronnych między chrząstkami palatokwadratowymi a ceratohyalnymi. Następnie umieść piąte punkty orientacyjne na dalszym końcu chrząstki szkienkowej, dbając o to, by punkty orientacyjne były ustawione w tej samej kolejności dla każdego obrazu.
Po umieszczeniu punktów orientacyjnych kliknij Plikuj, aby otworzyć rozwijane menu. Wybierz Zapisz dane, a następnie Nadpisuj, aby zapisać zaktualizowany plik. Zamknij oprogramowanie tpsDigs2.
Uruchom oprogramowanie MorphoJ. Kliknij Plik, wybierz Create New Dataset i przypisz nazwę zbiorowi. Kliknij TPS i wybierz plik Notepada zawierający nowo dodane punkty danych.
Następnie stwórz zbiór danych. W Project Tree kliknij zbiór danych. Wybierz Preliminary, potem New Procrustes Fit.
Wybierz Wyrównanie według osi głównych i kliknij Wykonaj dopasowanie Prokrustesa. W sekcji Wstępne wybierz Generuj Macierz Kowariancji, aby uzyskać współrzędne prokrusta. Wykonaj tę funkcję po wywołaniu polecenia.
Teraz wybierz Stwórz lub Edytuj Wireframe i powiąż punkty na obrazach. Kliknij powiązane punkty i zaakceptuj lub utwórz obraz, a następnie edytuj klasyfikatory w razie potrzeby. Otwórz program arkusza kalkulacyjnego, trzymając MorphoJ otwartym.
Wprowadź informacje klasyfikacyjne, takie jak GENOTYPE, TREATMENT i GENOTYPE TREATMENT, Następnie zapisz plik jako CSV. W MorphoJ kliknij Plik i wybierz Import zmiennych klasyfikatora, aby zaimportować plik CSV. Wróć do drzewa projektu i kliknij zbiór danych.
W sekcji Wstępne wybierz Edytuj Klasyfikatory, aby potwierdzić, że wszystkie obrazy są uwzględnione. W Drzewie Projektu wybierz CovMatrix, a następnie kliknij Variacja na górze strony. Wybierz analizę głównych komponentów, aby obliczyć wyniki głównych komponentów.
Kliknij wyniki PC, aby wyświetlić wygenerowany wykres. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres i wybierz Elipsy Pewność, aby dodać pożądany klasyfikator. Wybierz Punkty Danych Kolorów, przypisz kolory i kliknij OK, aby zastosować zmiany.
W sekcji Wstępne wybierz Opcje Ustawienia dla wykresu kształtów znajdującego się na dole ekranu. Wybierz wykresy drutowe i zmodyfikuj kolory docelowego kształtu, kształtu początkowego oraz liczb. Wybierz wariant, a potem Prokrustes ANOVA.
Eksportuj wyniki ANOVA prokruste do wcześniej utworzonego pliku arkusza kalkulacyjnego. W MorphoJ wybierz oryginalny zbiór danych w Drzewie Projektu. Kliknij Porównanie, a następnie Analiza Kanoniczna Zmienności.
Wybierz zmienne klasyfikacyjne GENOTYPE TREATMENT i wykonaj funkcję. Aby wyeksportować wyniki, kliknij zakładkę Wyniki i kliknij prawym przyciskiem myszy na stronę z wynikami. Wybierz Eksport do pliku i zapisz wyniki.
W Drzewie Projektu wybierz Kanoniczną Analizę Zmienną, a następnie wyniki. Kliknij Plik, wybierz Eksportuj zbiór danych, wybierz typ danych i GENOTYP TRAKTOWANIE. Zapisz wyniki CVA jako plik TXT.
Aby przygotować plik do oprogramowania PAST, otwórz zapisane wyniki CVA w edytorze tekstu. Zastąp id terminu w lewym górnym rogu na Etykieta i zapisz edytowany plik. Otwórz oprogramowanie PAST i kliknij File, a następnie otwórz, aby wybrać edytowany plik ocen CVA.
W oknie importu. Wybierz Nazwy, dane dla wiersza i kolumny oraz Tabulator jako separator, a następnie kliknij Import. W zakładce Pokaż wybierz atrybuty kolumn.
W menu rozwijanym obok Typ przypisz grupę do pierwszej kolumny zawierającej zmienne klasyfikatora. Wyróżnij główny komponent lub kanoniczne kolumny danych zmiennych. Wybierz Wielowymiarowy, następnie Testy, a następnie wybierz Wielowymiarową normalność, aby przeprowadzić test normalności osobno dla danych głównych składowych i kanonicznych.
Kliknij szarą pustą komórkę w lewym górnym rogu powyżej Wpis, aby zaznaczyć cały zbiór danych. Wybierz Multivariate, następnie Testy, a następnie wybierz multivariate analysis wariantów do przeprowadzenia analizy. Wyeksportuj wyniki MANOVA do wcześniej utworzonego pliku arkusza kalkulacyjnego.
Zdjęcia wnętrzności zostały wykonane dla każdej larwy w każdym genotypie i grupie leczonej. Chrząstki wnętrzności były oznaczane na reprezentatywnym obrazie, a na każdym obrazie umieszczano punkty orientacyjne, aby generować zbiory danych oznaczone punktami orientacyjnymi. Główny komponent 1 odpowiadał za około 34% całkowitej zmienności kształtu, a główny komponent 2 za 20% całkowitej zmienności kształtu.
Każdy główny składnik wykazywał specyficzne zmiany kształtu mięśni mózgowych względem średniego kształtu wszystkich mięśni czaszki. Wykres analizy głównych komponentów wykazał nakładające się średnie między grupami genotypowymi i leczonymi, bez wyraźnego klastrowania. Larwy dzikiego typu poddawanego etanolem wykazywały dużą elipsę pewności 95% średniej ze względu na niewielką wielkość próby.
Kanoniczny wariant 1 oznaczał subtelne skrócenie lub wydłużenie stawu ceratohyalnego w magentowym szkiecie drucianym w porównaniu do przeciętnego czarnego szkieletu. Kanoniczny wariant 2 wykazał przesunięcie przyśrodkowo tylko po jednej stronie viscerokranii w stawach między podczaszeniem Meckella a pałatokwadratowym. Larwy typu dzikiego traktowane etanolem wykazywały duży eliptyczny poziom pewności 95% średniej, który pokrywał się ze wszystkimi innymi grupami.
Analiza wielowartościowa wariantów wykazała istotny ogólny wpływ genotypu i leczenia. Największym wyzwaniem jest konsekwentne montowanie próbek. Przechylone larwy mogą powodować niedokładne pomiary i wpływać na wyniki.
Protokół ten dostosowuje się do różnych struktur anatomicznych, analizuje dane 3D, generuje miary liniowe i pomaga określić rozmiary próbek eksperymentalnych. Przyszłe badania będą dotyczyć innych wrażliwości na genotyp etanolu, zwiększać rozmiary próbek i stosować ten wszechstronny zestaw narzędzi do różnych struktur anatomicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative morphometric analysis of craniofacial shape in zebrafish enables high-resolution detection of subtle phenotypic effects from gene-environment interactions, such as those relevant to fetal alcohol spectrum disorders. This workflow enhances predictive confidence in early-stage target validation and supports mechanistic de-risking for developmental toxicity studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions where phenotypic screening and translational continuity are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene-environment interactions affecting craniofacial development.
- Supports functional target validation by quantifying subtle morphological phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through multivariate statistical analysis of shape variation.
- Improves predictive confidence for developmental toxicity endpoints.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream phenotypic screening workflows.
- Standardizes landmark-based morphometric assays for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation.
- Enables robust assay development for gene-environment interaction studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish craniofacial phenotypes with disease-relevant endpoints in FASD research.
- Supports translational biomarker identification through quantitative shape metrics.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of developmental toxicity.
- De-risks advancement decisions by clarifying subtle phenotypic effects.
Pipeline & Workflow Integration
This morphometric workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and phenotypic screening in zebrafish models.
- Discovery Biology: Quantifies gene-environment effects on craniofacial development for hypothesis-driven studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative shape data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides principal component, canonical variate, and MANOVA outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges zebrafish phenotypes to human-relevant developmental endpoints.
- Enterprise Reuse: Toolbox is adaptable to other anatomical structures and scalable for broader R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental toxicity studies.
- Operational Value: Standardizes morphometric analysis for reproducibility and cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene-environment interaction targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in morphometric analysis and zebrafish developmental biology.
- Needs access to imaging, landmarking, and statistical analysis software (tpsDigs2, MorphoJ, PAST).
- Demands rigorous sample mounting and orientation for reproducible results.
- Adaptable to 3D data and other anatomical structures with protocol modifications.
- Sample size and mounting consistency are critical for statistical power and accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
