Name: Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę morfometryczną do analizy subtelnych zmian kształtu czaszkowo-twarzowego u Danio rerio po ekspozycji na etanol. Protokół wykorzystuje punkty orientacyjne i analizy statystyczne do wykrywania defektów niewidocznych w pomiarach liniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania przedstawione w tym artykule zostały wsparte grantem od National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R01AA031043 dla C.B.L.

Wszystkie larwy danio pręgowanego użyte w tym zabiegu zostały wyhodowane i hodowane zgodnie z ustalonymi protokołami IACUC zatwierdzonymi przez Uniwersytet Louisville23.
UWAGA: W badaniu wykorzystano szczep danio bmp7aty68a24 oraz rodzeństwo typu dzikiego (wszystkie w tle AB), a dorosłe ryby utrzymywano w temperaturze 28,5 °C z cyklem światła i ciemności 14/10 godzin. Używaj odpowiednich linii zgodnie z pożądanymi wynikami eksperymentu. Używaj wody sterylizowanej przez odwróconą osmozę. Płeć jako zmienna biologiczna nie ma zastosowania do badanych etapów rozwoju, ponieważ płeć jest po raz pierwszy wykrywalna u danio pręgowanego około 20-25 dni po zapłodnieniu (dpf)25, po wszystkich analizach.
1. Obróbka etanolem
<ol>
	<li>Zbieraj komórki jajowe z krzyżówek heterozygotycznych i morfologicznie zaaranżuj zarodki zgodnie z opisem23.</li>
	<li>Sortuj zarodki do grup próbek po 100 i odstawiaj je w temperaturze 28,5 °C do pożądanych punktów rozwojowych. Inkubuj wszystkie grupy w ośrodku zarodkowym (EM)10,18.</li>
	<li>Po 6 godzinach po zapłodnieniu (hpf) zmień EM na świeży lub EM zawierający 1% etanolu (v/v). Przy 24 hpf wypłukać EM zawierający etanol z trzema świeżymi podmianymi EM10,18.</li>
</ol>
2. Barwienie twarzy i obrazowanie
<ol>
	<li>Ustalić larwy danio danio na 5 dpf i barwić błękitem alcjańskim, oznaczając chrząstkę (Rysunek 1) jak wcześniej opisano26.</li>
	<li>Zrób zdjęcia całego wierzchu, widok brzuszny, jasne pola wizerunku wnętrzności, osadzając larwy opisane wcześniej27.</li>
	<li>Krótko, zamontuj rybę, brzuszną powierzchnią w górę, w roztworze 50% glicerolu z końca barwienia Alcian Blue. UWAGA: Ustawienia mikroskopów złożonych mogą się różnić; Używaj ustawień odpowiednich do pożądanych struktur obrazów. W tym badaniu użyto mikroskopu złożonego Olympus BX53 do generowania wszystkich analizowanych obrazów. Zdjęcia wykonano przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>
3. Genotypowanie
<ol>
	<li>Usuń ogony z 5 larw dpf po barwieniu chrząstki Alcian Blue, jak opisanowcześniej 18.</li>
	<li>Oddziel głowy i ogony larw. Trzymaj głowice w magazynie 50% glicerolu na późniejsze obrazowanie.</li>
	<li>Ogony lyse zawierają 5 μL proteinazy K (10 mg/mL) do ekstrakcji gDNA.</li>
	<li>Wykonaj PCR na gDNA dla każdej próbki za pomocą primerów celujących w interesujący gen, aby amplifikować regiony zawierające SNP.</li>
	<li>Trawić produkt PCR za pomocą trawienia DNA opartego na endonukleazie restrykcyjnej, aby odróżnić allele mutantów od dzikich na podstawie SNP i zidentyfikować SNP. Podziel próbki według genotypu na grupy zbiorcze i obraz do analizy. UWAGA: W tej pracy SNP został amplifikowany w bmp7a i zgenotypowany za pomocą BslI (NEB).</li>
</ol>
4. Oprogramowanie używane do analizy kształtów
<ol>
	<li>Do analizy morfometrycznej larw zabarwionych alcjami, a do analizy statystycznej używaj tpsUtil i tpsDig221 oraz MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org), a do wszystkich analiz statystycznych oprogramowanie MorphoJ i Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis (PAST)22 (https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/). UWAGA: Oprogramowanie tpsUtil można znaleźć pod linkiem "Programy narzędziowe", oprogramowanie tpsDig2 pod linkiem "akwizycja danych", a MorphoJ pod linkiem "Comprehensive programs" na https://sbmorphometrics.org. Rozwiązywanie problemów z każdym oprogramowaniem można łatwo znaleźć zarówno bezpłatnie online, na różnych platformach, jak i w samym oprogramowaniu. Analiza głównych składników (PCA), analiza kanonicznych zmienności (CVA), Procrustes ANOVA oraz wykresy wireframe dotyczące zmienności twarzy zostały wygenerowane przy użyciu MorphoJ, a test normalności wieloczynnikowy i analiza wariancji wieloczynnikowej (MANOVA) wykonano za pomocą PAST.</li>
</ol>
5. Konsekwentne obrazowanie szkieletu twarzy dla wszystkich próbek do analizy
<ol>
	<li>Upewnij się, że zdjęcia szkieletu twarzy są wykonywane przy identycznych ustawieniach mikroskopu i zapisywane jako .tif pliki. UWAGA: Ustawienia mikroskopu różnią się w zależności od konfiguracji i funkcjonalności mikroskopu oraz próbek/tkanek do obrazowania. Kluczem jest spójne ustawienie mikroskopu i przygotowanie próbek.</li>
	<li>Zapisz pliki w jednym folderze oznaczonym tak, aby w pełni zidentyfikować eksperyment.</li>
</ol>
6. Przygotowywanie obrazów za pomocą oprogramowania tps
<ol>
	<li>Otwórz Notatnik i wybierz Zapisz jako. Stąd kliknij wszystkie pliki na dole. Zapisz plik jako "experiment-name.tps" i zapisz go w folderze zawierającym wszystkie obrazy do analizy.</li>
</ol>
7. Wprowadzanie obrazów do oprogramowania tps
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie tpsUtil. Następnie zbierz Operation i wybierz plik Build tps z zakładki obrazów .</li>
	<li>Z tej zakładki kliknij enter i otwórz plik zawierający obrazy. Kliknij pierwszy obraz w pliku i wybierz Otwórz.</li>
	<li>Wybierz zakładkę wyjścia , potem plik z notatnikiem tps i zapisz. Gdy pojawi się prośba o wymianę pliku, wybierz tak.</li>
	<li>Następnie kliknij zakładkę ustawienia i utwórz. Przejdź do pliku, aby sprawdzić, czy obrazy zostały dodane.</li>
</ol>
8. Dodawanie punktów orientacyjnych do obrazów
<ol>
	<li>Otwórz tpsDigs2 i otwórz następujące zakładki w kolejności: Wprowadź źródło, plik, a następnie zapisany plik tps Notepad.</li>
	<li>Następnie kliknij opcje , aby zwizualizować opcję Narzędzia obrazu . Tutaj upewnij się, że długość odniesienia wynosi 100 μm. Naciśnij ustaw skalę. UWAGA: Nie skaluj względem skali na obrazie.</li>
	<li>Podczas ustawiania skali naciśnij OK , aby ustawić parametry, a następnie zamknij narzędzia obrazu.</li>
	<li>W tym momencie dodaj punkty orientacyjne do każdego obrazu, który ma być analizowany w celu poprawnej analizy morfologicznej, klikając symbol celu.</li>
	<li>Upewnij się, że punkty orientacyjne są umieszczone w tej samej kolejności dla każdego obrazu. Na następujących łączeniach między elementami chrząstki umieszczono punkty orientacyjne (patrz Rysunek 1E, E'):<ol>
		<li>Połączenie środkowe między chrząstkami Meckela (Landmark #1, Rysunek 1E, E').</li>
		<li>Dwustronne stawy między chrząstkami Meckella a chrząstkami podniebieneckimi (Landmarks #2, Rysunek 1E, E').</li>
		<li>Połączenie środkowe między chrząstkami ceratohyalnymi (Punkt orientacyjny #3, Rysunek 1E, E').</li>
		<li>Dwustronne stawy między chrząstkami podniedbiawokwadratowymi a ceratohyalnymi (Landmarks #4, Rysunek 1E, E').</li>
		<li>Dalszy koniec chrząstki kości kościowej (Punkty orientacyjne #5, rysunek 1E, E').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po umieszczeniu punktów orientacyjnych na obrazie kliknij pliki do menu rozwijanego. Podążaj tą ścieżką, aby zapisać dane , a następnie nadpisać.</li>
	<li>Wyjście z tpsDigs2.</li>
</ol>
9. Wykorzystanie MorphoJ do analizy kształtu przez Prokrustesa ANOVA
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie MorphoJ.</li>
	<li>W ramach wstępnych utworz i nazwa zbioru danych. Wybierz utworzenie nowego zbioru danych i nazwanie go nazwą. Następnie kliknij tps i wybierz notatnik z nowymi punktami danych dodanymi od kroku 8.4. Stwórz zbiór danych.</li>
	<li>Obrazy są gotowe do statystycznego przeglądu za pomocą dopasowania Prokrustesa. Wybierz zakładkę czytającą drzewo projektu i kliknij na zbiór danych. Wybierz następujące przyciski na tej ścieżce: wstępne, nowe dopasowanie Prokrustesa, Wyrównanie według osi głównych oraz Wykonaj dopasowanie Prokrustesa.</li>
	<li>Wybierz macierz kowariancji w warunkach wstępnych; oprogramowanie pokaże współrzędne Prokrustesa. Wykonaj tę funkcję po wywołaniu polecenia.</li>
	<li>Wybierz utwórz lub edytuj szkielet w ramach wstępnych i powiąż punkty na obrazach. Następnie wybierz punkty linkowe i zaakceptuj lub stwórz obraz. Edycja klasyfikatorów.</li>
	<li>Otwórz arkusz kalkulacyjny, trzymając MorphoJ otwartym. Dodaj wszystkie niezbędne informacje, na przykład: genotyp, leczenie, genotyp i leczenie, eksperyment itd. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik CSV.</li>
	<li>W MorphoJ kliknij plik i importuj zmienne klasyfikacyjne , aby wybrać plik CSV. Po otwarciu pliku wróć do drzewa projektu i kliknij zbiór danych.</li>
	<li>Po otwarciu zbioru danych kliknij wstępne i edytuj klasyfikatory. To zapewni, że wszystkie obrazy zostaną dodane.</li>
	<li>Następnie kliknij drzewo projektu, Covmatrix, a następnie Variacja na górze.</li>
	<li>Wybierz Analizę Głównych Składników , aby zobaczyć wyniki PC. Kliknij wyniki PC, aby zobaczyć wygenerowany wykres.</li>
	<li>Aby dodać kolory do wykresu, kliknij prawym przyciskiem myszy i naciśnij elipsę pewności, aby dodać pożądany klasyfikator. Naciśnij punkty danych kolorów , aby dodać kolory i OK , aby zaakceptować te zmiany. UWAGA: Po zamknięciu i ponownym otwarciu zakładki punktacji PC zgodnie z instrukcjami w kroku 9.10, kolory powinny zostać zaktualizowane.</li>
	<li>Aby zmienić kolory wireframe'ów, przejdź do Preliminaries. Kliknij opcje ustawienia dla wykresu kształtów, znajdujące się na dole ekranu. Wybierz wykresy wireframe, aby zmienić kolory kształtu docelowego, kształtu początkowego i liczb.</li>
	<li>Wybierz wariant, a następnie Prokrustes ANOVA.</li>
	<li>Eksportuj wyniki ANOVA Prokrustesa do pliku arkusza kalkulacyjnego od kroku 9.7.</li>
</ol>
10. Kanoniczna analiza zmienna zbioru danych
<ol>
	<li>W MorphoJ wybierz oryginalny zbiór danych lub projekt. Aby rozpocząć Kanoniczną Analizę Zmienności (CVA), wybierz Porównanie , a następnie Kanoniczną Analizę Zmienną. Wybierz zmienną klasyfikacyjną – wybierz Genotype i Treatment i wykonaj funkcję.</li>
	<li>Aby wyeksportować CVA, kliknij zakładkę wyników i kliknij prawym przyciskiem myszy na otwartą stronę z wynikami. Wybierz Eksportuj do pliku i zapisz informacje.</li>
	<li>Kliknij Drzewo Projektu i wybierz CVA, a następnie Oceny. W lewym górnym rogu strony wybierz Plik. Po otwarciu zakładki Plik wybierz Eksportuj zbiór danych i wybierz typ danych oraz Genotyp i Obróbkę. Zapisz wyniki CVA jako plik .txt.</li>
	<li>Aby przygotować plik do oprogramowania PAST, otwórz zapisane wyniki CVA w Notatniku lub podobnym oprogramowaniu. Zmień ID w lewym górnym rogu na Etykieta , aby nie wprowadzać w błąd oprogramowania PAST. Zapisz zredagowane wyniki CVA lub odpowiednik.</li>
</ol>
11. MANOVA w oprogramowaniu PAST
<ol>
	<li>Aby zaimportować wyniki CVA w PAST, wybierz Plik, a następnie Otwórz , aby uzyskać dostęp do zapisanych wyników CVA z Notatnika lub odpowiednika. Gdy otworzy się okno Import pliku tekstowego , wybierz Nazwy, Dane dla wiersza i kolumny oraz tabulator dla separatora. Wybierz Import.</li>
	<li>W zakładce Pokaż wybierz Atrybuty kolumn. Obok przycisku Type otwórz menu rozwijane i wybierz Grupę dla pierwszej kolumny, która powinna zawierać zmienne klasyfikatora.</li>
	<li>Wyróżnij dane PC lub CV. Wybierz Wielowymiarowe, Testy i Wielowymiarową Normalność , aby uruchomić test normalności. Uruchom ten test na PC i CV osobno.</li>
	<li>Kliknij szarą pustą komórkę w lewym górnym rogu, powyżej wpisu, aby zaznaczyć cały zbiór danych. Wybierz Multivariate, Testy i MANOVA , aby przetworzyć MANOVA. Eksportuj wyniki MANOVA do pliku arkusza kalkulacyjnego od kroku 9.7. UWAGA: Oprogramowanie udostępnia zarówno wyniki podsumowania , jak i parowe . Eksportuj lub zapisuj oba.</li>
</ol>

<ol><li>May, P. A., Baete, A., Russo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+characteristics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Prevalence and characteristics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Pediatrics. 134 (5), 855-866 (2014).</li>
<li>May, P. A., Gossage, J. P., Kalberg, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+epidemiologic+characteristics+of+FASD+from+various+research+methods+with+an+emphasis+on+recent+in-school+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Disabil+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies.</a> Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).</li>
<li>Klingenberg, C. P., Wetherill, L., Rogers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44 (7-8), 649-657 (2010).</li>
<li>Smeriglio, P., Zalc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+cells+contribution+to+craniofacial+bone+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporos+Rep%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration.</a> Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-631 (2023).</li>
<li>Smith, S. M., Garic, A., Flentke, G. R., Berres, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+in+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Neural crest development in fetal alcohol syndrome.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 102 (3), 210-220 (2014).</li>
<li>Vo, H. D. L., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+induces+craniofacial+defects+in+Bmp+mutants+independent+of+nkx2.3+by+elevating+cranial+neural+crest+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Ethanol induces craniofacial defects in Bmp mutants independent of nkx2.3 by elevating cranial neural crest cell apoptosis.</a> Biomedicines. 13 (3), (2025).</li>
<li>Brooks, E. R., Islam, M. T., Anderson, K. V., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+directs+patterned+cell+remodeling+during+cranial+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling directs patterned cell remodeling during cranial neural tube closure.</a> Elife. 9, e60234(2020).</li>
<li>Eberhart, J. K., Parnell, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcohol Clin Exp Res. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li>
<li>Fish, E. W., Murdaugh, L. B., Sulik, K. K., Williams, K. P., Parnell, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vulnerabilities+to+prenatal+alcohol+exposure%3A+Limb+defects+in+sonic+hedgehog+and+GLI2+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic vulnerabilities to prenatal alcohol exposure: Limb defects in sonic hedgehog and GLI2 heterozygous mice.</a> Birth Defects Res. 109 (11), 860-865 (2017).</li>
<li>Klem, J. R., Schwantes-An, T. H., Abreu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bone+morphogenetic+protein+signaling+pathway+sensitize+zebrafish+and+humans+to+ethanol-induced+jaw+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bone morphogenetic protein signaling pathway sensitize zebrafish and humans to ethanol-induced jaw malformations.</a> Dis Model Mech. 18 (4), dmm052223(2025).</li>
<li>Swartz, M. E., Lovely, C. B., McCarthy, N., Kuka, T., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ethanol-sensitive+mutants+identified+in+an+F3+forward+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Novel ethanol-sensitive mutants identified in an F3 forward genetic screen.</a> Alcohol Clin Exp Res. 44 (1), 56-65 (2020).</li>
<li>Swartz, M. E., Wells, M. B., Griffin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+zebrafish+mutants+identifies+ethanol-sensitive+genetic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">A screen of zebrafish mutants identifies ethanol-sensitive genetic loci.</a> Alcohol Clin Exp Res. 38 (3), 694-703 (2014).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), e23460(2021).</li>
<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Res. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Zebrafish+as+a+model+for+ethanol+teratogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: Zebrafish as a model for ethanol teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li>
<li>Marrs, J. A., Sarmah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genius+of+the+zebrafish+model%3A+Insights+on+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The genius of the zebrafish model: Insights on development and disease.</a> Biomedicines. 9 (5), 577(2021).</li>
<li>Gray, R., Lloyd, A., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+bone+morphogenetic+protein+and+the+planar+cell+polarity+pathways+lead+to+distinctive+ethanol-induced+facial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Interactions between the bone morphogenetic protein and the planar cell polarity pathways lead to distinctive ethanol-induced facial defects.</a> Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 49 (11), 2502-2519 (2025).</li>
<li>Mutsvangwa, T., Douglas, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+facial+landmark+data+to+characterize+the+facial+phenotype+associated+with+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of facial landmark data to characterize the facial phenotype associated with fetal alcohol syndrome.</a> J Anat. 210 (2), 209-220 (2007).</li>
<li>Klingenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoJ%3A+An+integrated+software+package+for+geometric+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">MorphoJ: An integrated software package for geometric morphometrics.</a> Mol Ecol Resour. 11 (2), 353-357 (2011).</li>
<li>Rohlf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tps+series+of+software%5BTitle%5D)+AND+%22Hystrix%22%5BJournal%5D)">The Tps series of software.</a> Hystrix. 26, 1-4 (2015).</li>
<li>Hammer, O., Harper, D., Ryan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAST%3A+Paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Palaeontol+Electron%22%5BJournal%5D)">PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontol Electron. 4, 1-9 (2001).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Dick, A., Hild, M., Bauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Bmp7+%28snailhouse%29+and+its+prodomain+in+dorsoventral+patterning+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential role of Bmp7 (snailhouse) and its prodomain in dorsoventral patterning of the zebrafish embryo.</a> Development. 127 (2), 343-354 (2000).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+craniofacial+morphogenesis+in+zebrafish+using+4D+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+ethanol+levels+in+zebrafish+embryos+using+head+space+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography.</a> J Vis Exp. (156), e60766(2020).</li>
<li>Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Tol2+system%3A+A+modular+and+flexible+gateway-based+transgenesis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Tol2 system: A modular and flexible gateway-based transgenesis approach.</a> J Vis Exp. (189), e64679(2022).</li>
<li>Suttie, M., Foroud, T., Wetherill, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facial+dysmorphism+across+the+fetal+alcohol+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Facial dysmorphism across the fetal alcohol spectrum.</a> Pediatrics. 131 (3), e779-e788 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+and+Shh+signaling+mediate+the+expression+of+satb2+in+the+pharyngeal+arches%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bmp and Shh signaling mediate the expression of satb2 in the pharyngeal arches.</a> PLoS One. 8 (3), e59533(2013).</li>
<li>Dong, X. R., Wan, S. M., Zhou, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+of+BMP7+genes+in+zebrafish%3A+bmp7a+for+dorsal-ventral+pattern+and+bmp7b+for+melanin+synthesis+and+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation of BMP7 genes in zebrafish: bmp7a for dorsal-ventral pattern and bmp7b for melanin synthesis and eye development.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 838721(2022).</li>
<li>McCarthy, N., Wetherill, L., Lovely, C. B., Swartz, M. E., Foroud, T. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FASD charakteryzuje się szerokim zakresem wad rozwojowych, w tym defektami czaszkowo-twarzowymi, takimi jak hipoplazja szczęki. Danio pręgowane jest silnym modelem FASD ze względu na genetyczną konserwację u ludzi, wysoką płodność, przezroczyste larwy oraz zapłodnienie zewnętrzne. Danio pręgowane od dziesięcioleci służy zarówno do badania powstawania szkieletu czaszkowo-twarzowego, jak i wpływu etanolu na rozwój 6,12,13,15,18,28,29.<...

Zaburzenia ze spektrum alkoholowego płodu (FASD) charakteryzują się szerokim zakresem wad rozwojowych, w tym wad behawioralnych, neurologicznych i fizycznych 1,2. Wśród tych defektów fizycznych znajdują się ubytki czaszkowo-twarzowe, takie jak hipoplazja szczęki 3,4,5,6. Chociaż czas i dawka ekspozycji na etanol przyczyniają się do złożonej etiologii FASD, wkład genetyczny odgrywa istotną rolę w etiologii FASD 6,7,8,9,10,11,12. To połączenie czynników sprawia, że badanie wad twarzy u kohort ludzkich jest trudne. Aby zbadać wpływ ekspozycji na etanol prenatalny na rozwój, stosujemy model danio dano. Danio pręgowane stanowi silny wzór dla FASD, ponieważ dzieli 70% ortologów genów z ludźmi, a 82% znanych genów wywołujących choroby:13, 14, 15, 16. Oprócz genetycznej ochrony, danio pręgowane: (i) mają wysoką płodność, co pozwala na produkcję kilku larw danio pręgowanego jednocześnie, (ii) poddawają się zapłodnieniu zewnętrznemu, co umożliwia bezpośrednie badanie procesów rozwojowych wrażliwych na etanol, (iii) mają silnie zachowany i stereotypowy rozwój kręgowców czaszkowo-twarzowy, oraz (iv) są przezroczystymi zarodkami/larwami umożliwiającymi wizualizację struktur szkieletowych17. Wcześniej wykazaliśmy, że mutacje w wielu różnych genach danio danio uwrażliwiają zarodki na wady twarzy wywołane etanolem, a te defekty mogą być subtelne i trudne do rozpoznania okiem10,18. Ponadto zaobserwowaliśmy, że larwy dzikiego typu obtraktowanego etanolem wykazują niewielkie zmiany w okolicy czaszkowo-twarzowej w porównaniu do nieleczonych larw typu dzikiego, choć ponownie trudno te zmiany zidentyfikować okiem10. Chociaż te zmiany pozostają niezauważone przy obserwacji wzrokowej, udało nam się pokazać te zmiany kształtu twarzy wywołane etanolem za pomocą analiz morfometrycznych dostępnych na obrazach 2D viscerokrania10.
Ściana jest złożoną strukturą 3D, którą trudno zmierzyć za pomocą konwencjonalnych pomiarów liniowych. Te pojedyncze miary liniowe nie uwzględniają względnego położenia każdej struktury mierzonej względem oraz ich wpływu na pozostałe mierzone struktury ściany. Analizy morfometryczne rozwiązują te niedociągnięcia, wykorzystując konfiguracje kształtów za pomocą punktów orientacyjnych, które uwzględniają względne położenie wszystkich mierzonych struktur, a nawet kontrolują ogólne różnice w rozmiarach 18,19,20. Takie podejście daje dane dokładniejsze, mają większą rozdzielczość i są znacznie łatwiejsze do wizualizacji, co może dać rezultaty, których nie można zaobserwować przy użyciu konwencjonalnych pomiarów liniowych 18,19,20. Ponadto podejścia morfometryczne mogą dokonywać bezpośrednich porównań między grupami i wewnątrz nich, wykorzystując wielowymiarowe metody statystyczne. Tutaj opisujemy użycie darmowego oprogramowania morfometrycznego tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 oraz Paleontological Statistics (PAST)22, w połączeniu z obrazami 2D wnętrzności u nieobrobionych i etanolem heterozygotycznych dzikich i larw dla genu Bone Morphogenetic Protein (Bmp) bmp7a. Chociaż programy te były wykorzystywane głównie w paleontologii i dziedzinach skoncentrowanych na ekologii, w połączeniu zapewniają gruntowną analizę kształtu twarzy. Ostatecznie w tym protokole pokazujemy, jak wykorzystać te ogólnodostępne aplikacje do ilościowego określenia zmian kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej w modelu danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>tpsUtil, tpsDig2, MorphoJ</td><td><a href="https://sbmorphometrics.org/">https://sbmorphometrics.org</a></td><td></td><td>Oprogramowanie darmowe – może wymagać uprawnień administracyjnych do pobrania</td></tr><tr><td>PRZESZŁOŚĆ</td><td><a href="https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/">https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/</a></td><td></td><td>Oprogramowanie darmowe – może wymagać uprawnień administracyjnych do pobrania</td></tr><tr><td>Mikroskop Jasnego Pola Złożonego</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr></tbody></table>

morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Morphometric Analyses of Shape: The Analysis Software Toolbox for Craniofacial Shape Quantification in Zebrafish

Zaburzenia ze spektrum alkoholu płodu (FASD) charakteryzują się różnorodnym zestawem niepełnosprawności fizycznych, poznawczych i behawioralnych spowodowanych ekspozycją na etanol prenatalny, w tym tych dotykających szkielet twarzy. Na ten wysoki stopień zmienności FASD przyczyniają się lęki genetyczne wrażliwe na etanol, co utrudnia analizę kształtu twarzy. Wcześniej wykazaliśmy, że możemy analizować te zmiany kształtu twarzy wynikające z interakcji gen-etanol u danio pręgowanych. Danio dano jest idealnym modelem do analizy tej zmienności z kilku powodów; (i) 70% genów to ortologie między ludźmi a danio pręgowanymi; (ii) nawożenie zewnętrzne pozwala badaczom kontrolować czas i dawkę stosowania zabiegów etanolem; (iii) struktura szkieletu twarzy jest zachowana u kręgowców; (iv) Przezroczyste larwy umożliwiają bezpośrednie obserwowanie zmian w strukturze szkieletu czaszkowo-twarzowego podczas rozwoju. Jednak analiza kształtu szkieletu czaszkowo-twarzowego może być trudna do pełnej oceny za pomocą prostych miar liniowych, ponieważ nie oddają one ogólnych zmian kształtu. Dodatkowo, zmiany rozmiaru głowicy mogą utrudniać interpretację danych. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy podejście morfometryczne, analizując ogólny kształt twarzy poprzez analizy głównych komponentów za pomocą darmowego oprogramowania tpsDigs2, MorphoJ i PAST. Połączenie tego oprogramowania pozwala na parowe porównanie ogólnej morfologii twarzy. Tutaj przedstawiamy nasze podejście i analizę kształtu twarzy u mutantów danio dano obrobionych etanolem, wykorzystując te programy do przeprowadzenia serii komplementarnych, wielowariantowych analiz statystycznych.

Aby zidentyfikować zmiany kształtu twarzy wywołane etanolem u danio pręgowanych, połączyliśmy dostępne aplikacje programistyczne, aby generować i ilościowo określać dane morfologiczne szkieletu twarzy. Zarodki heterozygotycznych dorosłych ryb nosicielskich bmp7a zostały wygenerowane i poddane etanolowi z 6-24 hpf. Larwy z tych krzyżyków utrwalono na 5 dpf, a chrząstki twarzy zabarwiono błękitem alcyjskim. Zdjęcia wnętrzności wykonano dla każdej larwy w każdym genotypie i grupie leczeń (Rysun...

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a varying set of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol ...

Nasze badania wykorzystują oprogramowanie morfometryczne do ilościowego określenia, czy etanol i bmp7a oddziałują, powodując subtelne defekty czaszkowo-twarzowe u danio pręgowanych. Miary liniowe pomijają subtelne zmiany. W tej metodzie używamy punktów orientacyjnych do ilościowego określania zmian kształtu, jednocześnie kontrolując różnice w rozmiarze.Aby zacząć, otwórz oprogramowanie tpsDigs2. Kliknij Input source, potem File, i wybierz zapisany plik TPS Notepad. Kliknij Opcje, aby zwizualizować opcję Narzędzia obrazu.Ustaw długość odniesienia na 100 mikrometrów i naciśnij na Ustaw skalę. Kliknij OK, aby potwierdzić parametry skalowania, a następnie wyjdź z okna narzędzi obrazu. Następnie kliknij symbol celowania i umieść pierwszy punkt orientacyjny w stawie środkowym między chrząstkami Meckela.Umieść drugie punkty orientacyjne w dwustronnych stawach między chrząstkami Meckela a chrząstkami palatokwadratowymi. Trzeci punkt orientacyjny umieść w stawie środkowym między chrząstkami ceratohyalnymi, a czwarty na stawach obustronnych między chrząstkami palatokwadratowymi a ceratohyalnymi. Następnie umieść piąte punkty orientacyjne na dalszym końcu chrząstki szkienkowej, dbając o to, by punkty orientacyjne były ustawione w tej samej kolejności dla każdego obrazu.Po umieszczeniu punktów orientacyjnych kliknij Plikuj, aby otworzyć rozwijane menu. Wybierz Zapisz dane, a następnie Nadpisuj, aby zapisać zaktualizowany plik. Zamknij oprogramowanie tpsDigs2.Uruchom oprogramowanie MorphoJ. Kliknij Plik, wybierz Create New Dataset i przypisz nazwę zbiorowi. Kliknij TPS i wybierz plik Notepada zawierający nowo dodane punkty danych.Następnie stwórz zbiór danych. W Project Tree kliknij zbiór danych. Wybierz Preliminary, potem New Procrustes Fit.Wybierz Wyrównanie według osi głównych i kliknij Wykonaj dopasowanie Prokrustesa. W sekcji Wstępne wybierz Generuj Macierz Kowariancji, aby uzyskać współrzędne prokrusta. Wykonaj tę funkcję po wywołaniu polecenia.Teraz wybierz Stwórz lub Edytuj Wireframe i powiąż punkty na obrazach. Kliknij powiązane punkty i zaakceptuj lub utwórz obraz, a następnie edytuj klasyfikatory w razie potrzeby. Otwórz program arkusza kalkulacyjnego, trzymając MorphoJ otwartym.Wprowadź informacje klasyfikacyjne, takie jak GENOTYPE, TREATMENT i GENOTYPE TREATMENT, Następnie zapisz plik jako CSV. W MorphoJ kliknij Plik i wybierz Import zmiennych klasyfikatora, aby zaimportować plik CSV. Wróć do drzewa projektu i kliknij zbiór danych.W sekcji Wstępne wybierz Edytuj Klasyfikatory, aby potwierdzić, że wszystkie obrazy są uwzględnione. W Drzewie Projektu wybierz CovMatrix, a następnie kliknij Variacja na górze strony. Wybierz analizę głównych komponentów, aby obliczyć wyniki głównych komponentów.Kliknij wyniki PC, aby wyświetlić wygenerowany wykres. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres i wybierz Elipsy Pewność, aby dodać pożądany klasyfikator. Wybierz Punkty Danych Kolorów, przypisz kolory i kliknij OK, aby zastosować zmiany.W sekcji Wstępne wybierz Opcje Ustawienia dla wykresu kształtów znajdującego się na dole ekranu. Wybierz wykresy drutowe i zmodyfikuj kolory docelowego kształtu, kształtu początkowego oraz liczb. Wybierz wariant, a potem Prokrustes ANOVA.Eksportuj wyniki ANOVA prokruste do wcześniej utworzonego pliku arkusza kalkulacyjnego. W MorphoJ wybierz oryginalny zbiór danych w Drzewie Projektu. Kliknij Porównanie, a następnie Analiza Kanoniczna Zmienności.Wybierz zmienne klasyfikacyjne GENOTYPE TREATMENT i wykonaj funkcję. Aby wyeksportować wyniki, kliknij zakładkę Wyniki i kliknij prawym przyciskiem myszy na stronę z wynikami. Wybierz Eksport do pliku i zapisz wyniki.W Drzewie Projektu wybierz Kanoniczną Analizę Zmienną, a następnie wyniki. Kliknij Plik, wybierz Eksportuj zbiór danych, wybierz typ danych i GENOTYP TRAKTOWANIE. Zapisz wyniki CVA jako plik TXT.Aby przygotować plik do oprogramowania PAST, otwórz zapisane wyniki CVA w edytorze tekstu. Zastąp id terminu w lewym górnym rogu na Etykieta i zapisz edytowany plik. Otwórz oprogramowanie PAST i kliknij File, a następnie otwórz, aby wybrać edytowany plik ocen CVA.W oknie importu. Wybierz Nazwy, dane dla wiersza i kolumny oraz Tabulator jako separator, a następnie kliknij Import. W zakładce Pokaż wybierz atrybuty kolumn.W menu rozwijanym obok Typ przypisz grupę do pierwszej kolumny zawierającej zmienne klasyfikatora. Wyróżnij główny komponent lub kanoniczne kolumny danych zmiennych. Wybierz Wielowymiarowy, następnie Testy, a następnie wybierz Wielowymiarową normalność, aby przeprowadzić test normalności osobno dla danych głównych składowych i kanonicznych.Kliknij szarą pustą komórkę w lewym górnym rogu powyżej Wpis, aby zaznaczyć cały zbiór danych. Wybierz Multivariate, następnie Testy, a następnie wybierz multivariate analysis wariantów do przeprowadzenia analizy. Wyeksportuj wyniki MANOVA do wcześniej utworzonego pliku arkusza kalkulacyjnego.Zdjęcia wnętrzności zostały wykonane dla każdej larwy w każdym genotypie i grupie leczonej. Chrząstki wnętrzności były oznaczane na reprezentatywnym obrazie, a na każdym obrazie umieszczano punkty orientacyjne, aby generować zbiory danych oznaczone punktami orientacyjnymi. Główny komponent 1 odpowiadał za około 34% całkowitej zmienności kształtu, a główny komponent 2 za 20% całkowitej zmienności kształtu.Każdy główny składnik wykazywał specyficzne zmiany kształtu mięśni mózgowych względem średniego kształtu wszystkich mięśni czaszki. Wykres analizy głównych komponentów wykazał nakładające się średnie między grupami genotypowymi i leczonymi, bez wyraźnego klastrowania. Larwy dzikiego typu poddawanego etanolem wykazywały dużą elipsę pewności 95% średniej ze względu na niewielką wielkość próby.Kanoniczny wariant 1 oznaczał subtelne skrócenie lub wydłużenie stawu ceratohyalnego w magentowym szkiecie drucianym w porównaniu do przeciętnego czarnego szkieletu. Kanoniczny wariant 2 wykazał przesunięcie przyśrodkowo tylko po jednej stronie viscerokranii w stawach między podczaszeniem Meckella a pałatokwadratowym. Larwy typu dzikiego traktowane etanolem wykazywały duży eliptyczny poziom pewności 95% średniej, który pokrywał się ze wszystkimi innymi grupami.Analiza wielowartościowa wariantów wykazała istotny ogólny wpływ genotypu i leczenia. Największym wyzwaniem jest konsekwentne montowanie próbek. Przechylone larwy mogą powodować niedokładne pomiary i wpływać na wyniki.Protokół ten dostosowuje się do różnych struktur anatomicznych, analizuje dane 3D, generuje miary liniowe i pomaga określić rozmiary próbek eksperymentalnych. Przyszłe badania będą dotyczyć innych wrażliwości na genotyp etanolu, zwiększać rozmiary próbek i stosować ten wszechstronny zestaw narzędzi do różnych struktur anatomicznych.

morphometric-analyses-shape-analysis-software-toolbox-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Wiele struktur biologicznych nie ma łatwo definiowalnych punktów orientacyjnych, co utrudnia zastosowanie nowoczesnych metod morfometrycznych. Tutaj ilustrujemy metody badania baculum myszy (kości w penisie), w tym sekcję i skanowanie mikrotomografią komputerową, a następnie metody obliczeniowe do definiowania półpunktów orientacyjnych, które są używane do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu.

Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum

Wprowadzamy półautomatyczny protokół do analizy kształtów struktur mózgu, w tym segmentację obrazu za pomocą otwartego oprogramowania i dalszą grupową analizę kształtów za pomocą zautomatyzowanego pakietu do modelowania. W tym miejscu demonstrujemy każdy krok protokołu analizy kształtu 3D z segmentacją hipokampa na podstawie obrazów MR mózgu.

Trójwymiarowe modelowanie kształtów i analiza struktur mózgu

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Poznaj metodę morfometryczną do analizy subtelnych zmian kształtu czaszkowo-twarzowego u Danio rerio po ekspozycji na etanol. Protokół wykorzystuje punkty orientacyjne i analizy statystyczne do wykrywania defektów niewidocznych w pomiarach liniowych.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów