Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój
24 marca 2026
Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.
Nasze laboratorium bada, jak zapalenie prenatalne zmienia biologię mikrogleju, komórek odpornościowych mózgu przyczyniających się do niekorzystnych wyników neurorozwojowych. Istniejące modele MI koncentrują się na połowie ciąży. Jednak przedstawiamy wczesny protokół ciążowy, który ponadto zawiera metryki kontroli jakości, aby poprawić przeżywalność i konsystencję.
Model może być stosowany do dowolnego dzikiego typu lub genetycznego modelu myszy, aby zbadać wpływ zapalenia środowiskowego na rozwój mózgu. Aby rozpocząć, umieść dwie 8-10 tygodniowe samice myszy C57 BL6 z samcami hodowcami C57 BL6 późnym popołudniem lub wieczorem. Na następne rano oceń samice myszy na rzecz wtyczek dopochwowych i kontynuuj sprawdzanie raz dziennie, aż dojdzie do zapchania.
Wtyczki są tymczasowe i mogą spaść po południu, jeśli nie zostaną sprawdzone rano. Po potwierdzeniu wtyczki dopochwowej, ważyć samicę myszy i zapisać wagę, aby monitorować status ciąży poprzez śledzenie wzrostu masy ciała przez całą ciążę. Oddziel wtyczki dopochwowe do pojedynczych klatek i utrzymuj je w standardowych warunkach zakwaterowania z dostępem ad libidum do żywności i wody.
Oznacz wtyczki dopochwowe jako dzień embrionalny 0,5 i zapisz datę wtyczki dopochwowej, aby zapewnić dokładne śledzenie wieku ciążowego. Aby zrekonstytuować liofilizowany poli IC do wysokiego stężenia w roztworze bazowym, rozpuść go w sterylnym fizjologicznym roztworze soli lub sterylnej wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przemieszaj wysokie stężenie roztworu bazowego.
Następnie rozcieńcz roztwór w fizjologicznym roztworze soli, aby przygotować roztwór bazowy o niskim stężeniu. Aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, podziel około 125 mikrolitrów niskiego stężenia roztworu bazowego do rurek 1,5 mililitrowych i przechowuj rury w 20 stopniach Celsjusza lub 80 stopniach Celsjusza. Natychmiast przed wstrzyknięciem w dzień 9,5 ciąży.
Rozcieńcz niski stężenie poli IC z bezpośrednim fizjologicznym roztworem soli, aby uzyskać pracujące stężenie. Podgrzej pracujący roztwór w 65 stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby zapewnić odpowiednie odtworzenie struktury dwuniciowej rybonukleinowej. Następnie przemieszaj lub pipetuj roztwór, aby zapewnić jednorodną mieszaninę przed wstrzyknięciem.
Aby potwierdzić ciążę, ważyć samicę w poranku dzień 9,5 ciąży. Oblicz objętość wstrzyknięcia poli-IC dla aktywacji odporności matczynej, lub MIA i objętość wstrzyknięcia 0,9% soli fizjologicznej dla kontroli. Wstrzyknij odpowiednią objętość przygotowanego pracującego roztworu poli-IC lub soli do sterylnej strzykawki 27-calowej lub mniejszej.
Teraz odpowiednio przytrzymaj samicę, aby zminimalizować ból i dystres. Wstrzyknij kwas poli-IC lub soli do jamy brzusznej w dolnym lewym lub prawym kwadrancie tuż nad poziomem bioder lub na drugim zestawie sutków. Następnie wyrzuć strzykawki do pojemnika na ostrze BioSafety Sharps.
Zapisz również stronę wstrzyknięcia, aby zachować spójność w całej kohorcie. Natychmiast zwróć samicę do domowej klatki i monitoruj pod kątem wszelkich objawów dystresu. Następnie uzupełnij klatkę żelem hydrokoloidowym na co najmniej 24 godziny po wstrzyknięciu, aby zapobiec odwodnieniu związanemu z zachowaniem chorobowym.
Następnie zapisz wstrzykniętą objętość dawki poli-IC, datę i godzinę wstrzyknięcia, wiek ciążowy i numer partii poli IC. Trzy godziny po wstrzyknięciu, obserwuj każdą mysz indywidualnie przez jedną minutę i oceń zachowanie, takie jak zmniejszona aktywność, pochylona postawa, grimasa na twarzy lub wodnisty stolec, używając trzypunktowej skali. Klasyfikuj myszy wykazujące jedno lub więcej z tych zachowań jako wykazujące ostre zachowania chorobowe.
Następnie, używając minimalnie inwazyjnej metody, takiej jak krwiotok z ogona, starannie pobierz krew matczyną z wstrzykniętej samicy. Pobierz około 50 mikrolitrów krwi. Po potwierdzeniu hemostazy, zwróć samicę do domowej klatki.
Pozwól krwi zebranej na skrzepnięcie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wyśrodkuj próbkę z prędkością 2000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby oddzielić surowicę od skrzepu. Po ponownym wyśrodkowaniu próbki, starannie zebrać górną warstwę klarownej surowicy bez zakłócania skrzepu.
Przechowywaj surowicę w 20 stopniach Celsjusza, aż będzie gotowa do analizy cytokin w dalszym ciągu. Po wstrzyknięciu ważyć samicy codziennie przez trzy dni, aby monitorować reakcję na kwas poli-IC. W dniu oczekiwanego porodu, zapisz wyniki miotu, w tym wielkość miotu, żywotność młodych lub brak miotu, aby wskazać nieudaną ciążę.
Natychmiast usuń wszelkie martwe młode i wyrzuć je zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Użyj metod ELISA lub wielokrotnych analiz, aby ilościowo ocenić cytokiny zapalne, takie jak IL-6 i TNF-alfa w surowicy matczynej po wstrzyknięciach MIA lub kontrolnych zgodnie z instrukcjami producenta. Po ilościowej oce
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowany protokół indukowania aktywacji odporności matczynej (MIA) we wczesnej ciąży u myszy, która jest szeroko stosowanym modelem badania wpływu czynników środowiskowych na zaburzenia neurorozwojowe (NDDs). Protokół obejmuje wiele wskaźników kontroli jakości, w tym ilościowe oznaczenie cytokin w surowicy matki oraz analizę dynamiki masy ciała, w celu zwiększenia powtarzalności i przewidywania wyników ciąży.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Zaburzenia neurorozwojowe
- Immunologia
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Zaburzenia neurorozwojowe (NDDs) wynikają ze złożonych interakcji genetycznych i środowiskowych.
- Aktywacja odporności matki (MIA) jest kluczowym środowiskowym czynnikiem ryzyka wystąpienia NDDs.
- Modele mysie MIA są powszechnie stosowane, lecz obarczone są problemami z zmiennością i powtarzalnością.
- W celu poprawy spójności eksperymentalnej niezbędne są zestandaryzowane protokoły oraz kontrola jakości.
Cel badania
- Opracowanie zestandaryzowanego protokołu indukcji MIA we wczesnym okresie ciąży u myszy.
- Wprowadzenie wskaźników kontroli jakości w celu oceny odpowiedzi odpornościowej i przewidywania wyników ciąży.
- Identyfikacja czynników wpływających na powtarzalność i przeżywalność miotu w modelu MIA.
Zastosowane metody
- Indukcja MIA w 9,5 dniu embrionalnym (E9.5) przy użyciu kwasu poliinozynowo-policytydydowego (poly(I:C)).
- Ilościowe oznaczenie cytokin w surowicy matek w celu potwierdzenia aktywacji immunologicznej.
- Monitorowanie trajektorii masy ciała matek od E0.5 do E12.5.
- Ocena wpływu dostawcy zwierząt oraz formulacji poly(I:C) na wyniki.
Główne wyniki
- Poziomy cytokin w surowicy stanowią wiarygodny wskaźnik pozwalający potwierdzić aktywację odpornościową i wykluczyć osobniki o niskiej odpowiedzi.
- Wyraźne wzorce przyrostu masy ciała matek pozwalają przewidzieć przeżywalność miotu.
- Dostawca zwierząt ma istotny wpływ na odpornościową odpowiedź matek oraz przeżywalność miotu.
- Formulacja Poly(I:C) nie wpływa znacząco na wyniki.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa powtarzalność modelu MIA we wczesnej ciąży.
- Monitorowanie odpowiedzi immunologicznej i masy ciała matki poprawia przewidywanie wyników ciąży.
- Kontrola dostawcy zwierząt jest krytyczna dla uzyskania spójnych wyników w badaniach nad MIA.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zstandaryzowane modele aktywacji odporności matczynej (maternal immune activation, MIA) są kluczowe dla ograniczania ryzyka przy wczesnej walidacji celów terapeutycznych w zaburzeniach neurorozwojowych (NDD) oraz zapewnienia ciągłości translacyjnej w badaniach przedklinicznych. Integracja ilościowych wskaźników odpowiedzi immunologicznej oraz predykcyjnego monitorowania masy ciała matek w niniejszym protokole pozwala rozwiązać problemy z powtarzalnością, wspierając rzetelną selekcję projektów w portfolio oraz porównywalność między badaniami. Zwiększona niezawodność modelu umożliwia podejmowanie bardziej pewnych decyzji dotyczących dalszego rozwoju terapii w obszarze neurorozwojowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę stanu zapalnego w okresie prenatalnym jako mechanistycznego czynnika napędzającego NDDs.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie aktywacji odpornościowej z wynikami rozwoju układu nerwowego.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej podczas wczesnego etapu testowania hipotez i wyboru modelu.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia powtarzalny system in vivo do oceny potencjalnych interwencji celujących w prenatalne szlaki immunologiczne.
- Standaryzuje wskaźniki aktywacji immunologicznej i żywotności, poprawiając porównywalność analiz pomiędzy badaniami.
- Umożliwia ilościowe odczyty (cytokiny, trajektorie masy ciała) dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do czynników ryzyka prenatalnego istotnych dla chorób z grupy NDD.
- Poprawia ciągłość translacyjną poprzez kontrolę zmiennych zakłócających, takich jak dostawca zwierząt.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na terapie neurorozwojowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół pozycjonuje modele MIA we wczesnej ciąży jako podstawowe narzędzia – od biologii odkrywczej po walidację przedkliniczną w badaniach nad rozwojem neurologicznym.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe pomiary cytokin i masy ciała umożliwiają solidną weryfikację hipotez oraz ograniczanie ryzyka biologicznego.
- Przesiewy: Standaryzowana aktywacja immunologiczna wspiera odtwarzalne opracowywanie testów i ocenę związków.
- Analityka: Umożliwia obiektywne porównanie odpowiedzi immunologicznej i wyników ciąży w różnych grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia wierność modelu w odniesieniu do istotnych dla ludzi czynników ryzyka prenatalnego w przypadku NDD.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Standaryzacja protokołów i kontrole jakości ułatwiają wdrażanie metod w różnych programach i ośrodkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad NDD.
- Wartość operacyjna: Sprzyja powtarzalności i standaryzacji w badaniach przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz lepszą alokację kapitału w portfelach neurorozwojowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych celujących w prenatalny stan zapalny.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunologii, neurorozwoju oraz zarządzania modelami in vivo.
- Wymaga dostępu do platform do oznaczania ilościowego cytokin oraz infrastruktury do podłużnego monitorowania zwierząt.
- Wymaga ścisłego przestrzegania ustandaryzowanych protokołów i wskaźników kontroli jakości przez wszystkie zespoły.
- Wybór dostawców i pozyskiwanie zwierząt muszą być ściśle kontrolowane w celu zapewnienia powtarzalności.
- Zastosowanie jest ograniczone do modeli prenatalnej aktywacji immunologicznej; adaptacja do innych czynników ryzyka wymaga walidacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:30
Generation of Timed Pregnancies in Mice
1:37
Preparation of Polyinosinic: Polycytidylic Acid [Poly(I:C)] for Injections
2:55
Injecting Pregnant Mice with Poly(I:C) Solution
4:24
Collection of Maternal Blood from Injected Dams
5:42
Monitoring Injected Dams and Validating the Immune Response
6:49
Results
8:29
Conclusion
