Name: Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj szybką metodę produkcji rekombinowanej rybonukleazy SLFN14 u człowieka w liniach komórek ssaczych HEK293 oraz analizę stechiometryczną za pomocą fotometrii masowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Pillon za krytyczną lekturę tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Program Badań Zewnętrznych Amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia, Narodowy Instytut Nauk Medycznych Ogólnych (NIGMS; R35GM147123 dla M.C.P.) przekazany Baylor College of Medicine i przeniesiony do State University of New York w Buffalo. C.D.M. było wspierane przez stypendium szkoleniowe NIH (Grant nr T32 GM159557).

<ol><li>Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+ribosome-associated+endoribonuclease+slfn14+from+rabbit+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes.</a> Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+schlafen+14+cleavage+of+short+double-stranded+rnas+underpins+its+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity.</a> Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).</li>
<li>Seong, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+14+%28slfn14%29+is+a+novel+antiviral+factor+involved+in+the+control+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication.</a> Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).</li>
<li>Jo, U., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural%2C+molecular%2C+and+functional+insights+into+schlafen+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins.</a> Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velcrin-induced+selective+cleavage+of+trna%28leu%29%28taa%29+by+slfn12+causes+cancer+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death.</a> Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).</li>
<li>Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+11+%28slfn11%29%2C+a+restriction+factor+for+replicative+stress+induced+by+DNA-targeting+anti-cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies.</a> Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+11+triggers+innate+immune+responses+through+its+ribonuclease+activity+upon+detection+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA.</a> Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-usage-based+inhibition+of+hiv+protein+synthesis+by+human+schlafen+11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11.</a> Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).</li>
<li>Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen14+impairs+hiv-1+expression+in+a+codon+usage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner.</a> Viruses. 16 (4), (2024).</li>
<li>Metzner, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+understanding+of+human+slfn11%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanistic understanding of human slfn11.</a> Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).</li>
<li>Garvie, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+pde3a-slfn12+complex+reveals+requirements+for+activation+of+slfn12+rnase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase.</a> Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).</li>
<li>Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+conformational+change+regulates+human+slfn11%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11.</a> Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).</li>
<li>Van Riper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoem+structure+of+the+slfn14+endoribonuclease+reveals+insight+into+rna+binding+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage.</a> Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).</li>
<li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+human+slfn14%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of human slfn14.</a> Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).</li>
<li>Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchellenberg%2C+MJ+%22Encyclopedia+of+cell+biology%22">Encyclopedia of cell biology</a>. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).</li>
<li>Hutchinson, A., Seitova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+prmt+proteins+using+the+baculovirus+expression+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system.</a> J Vis Exp. (173), e62510(2021).</li>
<li>Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+comparison+of+in-house+prepared+transfection+reagents+in+the+delivery+of+mrna+or+DNA+to+a+wide+range+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells.</a> J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+hek293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension.</a> J Vis Exp. (106), e53568(2015).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+counting+and+viability+assessment+of+2d+and+3d+cell+cultures%3A+Expected+reliability+of+the+trypan+blue+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay.</a> Biol Proced Online. 19, 8(2017).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li>
<li>Glasel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+nucleic+acid+purities+monitored+by+260nm%2F280nm+absorbance+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios.</a> Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).</li>
<li>Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+the+quantification+limit+of+the+qubittm+rna+hs+assay+using+rna+spike-in%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in.</a> BMC Mol Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Swiech, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+serum-free+suspension+hek+293+cell+culture+for+efficient+production+of+human+rfviii%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii.</a> BMC Biotechnol. 11, 114(2011).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Advances+in+the+structures%2C+mechanisms+and+targeting+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones.</a> Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).</li>
<li>Bernhard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+spliced+leader+rna+recognition+by+the+trypanosoma+brucei+cap-binding+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex.</a> Nat Commun. 16 (1), 685(2025).</li>
<li>Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+mass+analysis+of+intact+ribosomes+by+mass+photometry+and+orbitrap-based+charge+detection+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry.</a> iScience. 24 (11), 103211(2021).</li>
<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+igg+molecules%3A+Structural+variations%2C+chemical+modifications+and+possible+impacts+to+stability+and+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function.</a> MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+purification+of+rna-binding+proteins%3A+Application+to+hiv-1+rev%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev.</a> Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+proteoform+project%3A+Defining+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">The human proteoform project: Defining the human proteome.</a> Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).</li>
<li>Carrasco-Zanini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+biological+influences+on+the+human+plasma+proteome+beyond+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome.</a> Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).</li>
<li>Adhikari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-stringency+blueprint+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A high-stringency blueprint of the human proteome.</a> Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).</li>
<li>Liao, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbpworld+for+exploring+functions+and+disease+associations+of+rna-binding+proteins+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species.</a> Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).</li>
<li>Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna-binding+proteins+in+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Rna-binding proteins in human genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).</li>
<li>Poodts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+sars-cov-2+spike+rbd+using+the+insect+cell-baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system.</a> Viruses. 14 (12), (2022).</li>
<li>Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Methods. 147, 40-49 (2018).</li>
<li>Shi, X., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+n-glycosylation+in+the+baculovirus-insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system.</a> Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka kluczowych kroków podkreśla wydajność i wszechstronność tego protokołu produkcji białek. Aby zmaksymalizować wydajność białek rekombinowanych, wykorzystujemy komórki HEK293, które mają wysoki pobór obcych plazmidów i mogą być hodowane w zawiesinach, aby zmaksymalizować gęstość komórek w średniej objętości23. W tym szeroko skalowym protokole dostarczania transgenów stosuje się odczynniki PEI, ponieważ pozwala osiągnąć wysoką efektywność transfekcji przy stosunkowo niskich kosztach w porównani...

Schlafen 14 (SLFN14) to niedostatecznie zbadany rybonukleaz i czynnik restrykcyjny ssakówgospodarza 1,2,3. Ludzkie białko SLFN14 należy do sześcioosobowej rodziny regulatorów genów SLFN, odgrywających rolę w odporności, aktywności przeciwwirusowej, chemowrażliwości oraz różnicowaniu komórek 4,5,6,7,8. Mechanistyczne wglądy w rolę regulatorów genów SLFN pozostają niepełne; jednak wielu członków prowadzi działalność rybonukleazową niezbędną do kontroli translacyjnej 7,9. Rybonukleazy SLFN są aktywowane podczas homodymeryzacji białek, tworząc szczelinę wiążącą RNA złożoną w rozszczepieniu substratu10,11. Aby chronić komórki przed fałszywym rozszczepieniem RNA, większość rybonukleaz SLFN istnieje głównie jako monomer i oczekuje na aktywację przez sygnały molekularne specyficzne dla każdego członka rodziny 5,7,11,12.
Rekombinowana produkcja ludzkiego SLFN14 umożliwiła kompleksowe badania molekularne tego wcześniej niedostatecznie zbadanego rybonukleazy, dostarczając nowych informacji na temat jego funkcji i regulacji 2,13,14. Oczyszczone rekombinowane białko SLFN14 przyspieszyło charakterystykę swojej aktywności transferowej RNA zależnej od struktury przy użyciu testów in vitro RNAna cięciu RNA 2,14. Badania kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) oczyszczonego białka SLFN14 ujawniają również układ homodimerów SLFN14, gdzie dupleksowane RNA ładuje się do centralnej szczeliny 2,13,14. Zespół wyższego rzędu SLFN14 został dodatkowo scharakteryzowany przez fotometrię masową, technikę pojedynczej cząsteczki do pomiaru masy cząsteczkowej. Niespodziewanie, ta wrażliwa technika pokazuje, że SLFN14 głównie tworzy homodymer odporny na sól, ale może także tworzyć homotetramer wrażliwy na sól o nieznanej funkcji 2,13,14. Łącznie możliwość uzyskania oczyszczonego ludzkiego białka SLFN14 była kluczowym kamieniem milowym, umożliwiającym wczesne molekularne wglądy, które z pewnością zainspirują ekscytujący nowy etap badań nad kontrolą translacyjną pośredniczoną przez SLFN14.
Rekombinowana rybonukleaza SLFN14 historycznie była trudna do pozyskania przy użyciu standardowych strategii produkcji białek. Oryginalny raport opisujący aktywność enzymatyczną SLFN14 zauważał jego niską wydajność, obniżoną stabilność i niską rozpuszczalność1. Ludzkie białko SLFN14 charakteryzuje się długim łańcuchem polipeptydowym, wyraźną hydrofobowością oraz cytotoksycznością zależną od rybonukleazy, które razem w dużej mierze utrudniają stosowanie konwencjonalnych systemów ekspresji bakterii 1,13,14. Jednak zaawansowane maszyny translacji eukariotycznej i chaperonów oferują potężną alternatywę, która efektywnie produkuje pełnowymiarowe ludzkie białkoSLFN14 15. Zarówno systemy ekspresji baculowirusa, owada i ssaków zostały wykorzystane do uzyskania pełnowymiarowego ludzkiego białka SLFN14 do badań krioEM oraz testów biochemicznych 2,13,14. Jednak w niektórych przypadkach białko SLFN14 pochodzące od owadów wymagało mutacji stabilizującej, aby zapobiec agregacji próbek2. Dostarczanie genów za pomocą bakulowirusa wiąże się również z dużym zaangażowaniem i długim czasem realizacji, co opóźnia postęp badań15,16. Z kolei rekombinowane białko SLFN14 izolowane z gospodarza ekspresyjnego ssaka oferuje przewagę szybkości i eliminuje konieczność inżynierii białek podczas optymalizacji próbek.
Metoda ta została zaprojektowana tak, aby zapewnić stosunkowo szybkie i niewymagające podejście do produkcji rekombinowanego białka typu dzikiego typu SLFN14, odpowiedniego do dalszych badań molekularnych. Wykorzystanie komórek ssaków zapewnia niemal naturalne środowisko do zachowania prawidłowego fałdowania białek bez potrzeby inżynierii białek SLFN1413. Metoda dostarczania genów oparta na chemikaliach, w przeciwieństwie do strategii wektora wirusowego, również przyspiesza czas produkcji z miesięcy do15 dni. Aby zrównoważyć stosunkowo wysokie koszty hodowli komórek ssaków, metoda ta wykorzystuje ekonomiczny odczynnik transfekcyjny polietyliminy (PEI) oraz efektywne komórki transfekcyjnie 293 (HEK293) w zawiesinach 17,18. Aby zminimalizować utratę białek podczas przetwarzania próbek, procedura ta wykorzystuje również strategie niskiego spożycia próbki do oczyszczania białek SLFN14 oraz analizy stechiometrycznej do kontroli jakości próbki. Ten czterodniowy protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące przeprowadzenia 1) ekspresji genów przejściowych w komórkach HEK293, 2) dwuetapowego workflow chromatografii z użyciem kolumn spinowych oraz 3) określenia stechiometrii białek za pomocą fotometrii masowej. Końcowym produktem tego zabiegu jest ludzkie białko SLFN14 typu dzikiego typu zawierające podwójny C-końcowy znacznik Myc-Flag (SLFN14Myc-Flag), który może być wykorzystywany do dalszych badań krioEM oraz jakościowej charakterystyki biochemicznej13. To wszechstronne podejście można zastosować do izolowania i charakteryzowania innych niedostatecznie zbadanych ludzkich białek wiążących ludzkie RNA, szczególnie dużych i cytotoksycznych genów rybonukleazy, które często są trudne do nadekspresji w heterologicznych układach ekspresji. W związku z tym protokół ten obniża barierę kompleksowej charakterystyki molekularnej ludzkiego proteomu.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (b-Me)</td><td>Sigma</td><td>M3148-500ML</td><td>14,3 M Solutions tock</td></tr><tr><td>AcquireMP 2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Adenozyna-5'-trifosforan trihydrat soli sodowej (ATP)</td><td>Chem-Impex International</td><td>00015-100G</td><td>dostosuj roztwór do pH 7,0</td></tr><tr><td>Żel powinowactwa Anti-Flag M2</td><td>Millipore</td><td>A2220</td><td>Żywica antyflagowa</td></tr><tr><td>Hydrat chlorowodorku benzzamidyny</td><td>Sigma</td><td>B6506-25G</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Standardy białek o szerokim zakresie (10-250 kDa)</td><td>Bio-Rad</td><td>P7719S</td><td>Standardy białek z prestaincją</td></tr><tr><td>Hrabina 3</td><td>Invitrogen</td><td>A49862</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>DiscoverMP v2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowym</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1x roztwor</td></tr><tr><td>Peptyd DYKDDDDK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36805</td><td>Peptyd 3xFlag</td></tr><tr><td>Ogniwa FreeStyle 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Komórki zawiesiny ssaków</td></tr><tr><td>Złożone w DMF Geniust M nuclease</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-391121B</td><td>Nukleaza uniwersalna</td></tr><tr><td>HyClone CDM4HEK293 media</td><td>Cytiva</td><td>SH3085802</td><td>Medium wzrostu bez surowicy</td></tr><tr><td>Multimedia HyClone SFM4Transfx-293</td><td>Cytiva</td><td>SH3086002</td><td>Ośrodek transfekcyjny przejściowy</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>Zeiss</td><td>4Y00-R0DY-1007-3BF3</td><td>Olej immersyjny</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbek Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td>2x zapas roztworu</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>VWR</td><td>J580-25MG</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu heksahydrat (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>MassFerence P1&nbsp;</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-41033</td><td>Kolba kalibru 500x</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek MassGlass UC</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21022</td><td>Suwak i uszczelka</td></tr><tr><td>Kolumna mikro-biospinowa</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td>Pusta kolumna spinowa z polipropylenu</td></tr><tr><td>System Milli-Q IQ 7000</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0C</td><td>Ultraczysta woda typu I</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX żele wolne od plam</td><td>Bio-Rad</td><td>4568086</td><td>4-15% STRONA SDS</td></tr><tr><td>Minitron z wilgotnością, chłodzeniem i CO2</td><td>Infors</td><td>72175</td><td>Wstrząsanie inkubatorowe</td></tr><tr><td>Zestaw do wyrównania MP</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21019</td><td>Narzędzie do ustawiania ustawiania, pęseta miękka, magnes</td></tr><tr><td>Nanofotometr</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>Spektrofotometr UV-vis</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Marka Clay Adams</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-45036B</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Fenylosulfonylofluorek (PMSF)</td><td>Research Products International</td><td>P20270-25.0</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Poliwęglanowa kolba do wstrząsania &nbsp;</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>WPFBC1000S</td><td>Wentylowana flaszka bazowa z przegrodami</td></tr><tr><td>Polietyimina (PEI) MW 40 000</td><td>Nauki polinaukowe</td><td>24765</td><td>Odczynnik transfekcyjny</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testowania wysokiej czułości na kubity RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32852</td><td>ilościowa analiza za pomocą barwnika specyficznego dla RNA</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6065</td><td>Coomassie G-250</td></tr><tr><td>DNA plazmidowe z ekspresją SLFN14</td><td>Orygene</td><td>RC226257</td><td>klon ORF oznaczony przez człowieka</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Millipore</td><td>1.37017</td><td></td></tr><tr><td>Tris, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60202. K2</td><td>1 m buforowany roztwór</td></tr><tr><td>Tris (2-karboksyetylo) fosfinowodorek (TCEP)</td><td>Złota Biotechnologia</td><td>TCEP10</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>M143-1L</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Bejca trypanowego niebieskiego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>0,4% zapasów roztworu</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td>detergent</td></tr><tr><td>TwoMP</td><td>Refeyn</td><td>MP-PRO-00001</td><td>Fotometr masy</td></tr><tr><td>Kolumna Desaltin Zeba 40K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A57759</td><td>Chromatografia wykluczenia rozmiaru</td></tr></tbody></table>

szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy slfn14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Rapid Production of Recombinant Human SLFN14 Ribonuclease and Stoichiometric Analysis by Mass Photometry

Rybonukleazy to wyspecjalizowana klasa białek wiążących RNA, które katalizują rozszczepienie RNA i przyczyniają się do różnych procesów biologicznych, w tym regulacji genów. Niemniej jednak struktura, funkcja i regulacja wielu ludzkich rybonukleaz pozostają słabo scharakteryzowane ze względu na wyzwania związane z produkcją białek rekombinowanych. Metoda ta opisuje efektywne podejście do ekspresji, oczyszczania i stechiometrycznej analizy rybonukleazy Schlafen 14 (SLFN14) u człowieka. SLFN14 z oznakowaniem rekombinantowym flagowym był wyrażany w komórkach zawiesinowych HEK293 i izolowany za pomocą szybkiego, dwuetapowego procesu oczyszczania obejmującego chromatografię anty-Flag affinity, a następnie niskorozdzielczą chromatografię wykluczenia wielkościowego. Fotometria masowa, czuła technika pojedynczą, wykazała, że w warunkach fizjologicznych SLFN14 tworzy stabilny homodimer związany z komórkowym RNA, podczas gdy wysoka ilość soli sprzyja dysocjacji RNA, zachowując układ homodimerów. Powstałe rekombinowane ludzkie białko SLFN14 nadaje się do dalszych badań strukturalnych oraz jakościowych testów biochemicznych. To szybkie podejście do izolacji i charakteryzacji próbek przez rekombinowane ludzkie białka jest szeroko zastosowane do produkcji innych rybonukleaz ssaków oraz białek wiążących RNA, przeznaczonych do charakterystyki biofizycznej i biochemicznej.

Wektor ssaków zaprojektowany do przejściowej ekspresji genów pełnowymiarowego ludzkiego białka SLFN14Myc-Flag jest zilustrowany na Rysunku 1. Dwuetapowy proces oczyszczania przedstawia izolację białkaMyc-Flag SLFN14 z komórek HEK293 (Rysunek 2A). Skuteczny reprezentatywny żel denaturujący oczyszczonego białkaMyc-Flag SLFN14 pokazano na Rysunku 2B. Etap chromatografii powinowactwa opiera się na selekt...

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Ribonucleases are a specialized class of RNA binding proteins that catalyze RNA cleavage and contribute to diverse biological processes including gene ...

Nasz program badawczy ma na celu scharakteryzowanie funkcji i regulacji niedostatecznie zbadanych rybonukleaz w eukariotycznej kontroli genów. Rekombinowana produkcja eukariotycznych rybonukleaz jest często trudna ze względu na ich złożoność i cytotoksyczność. Ten szybki protokół wykorzystuje linie komórkowe ssaków, aby pokonać te ograniczenia.Na początek nasiaj komórki zawiesiny ssaków HEK293 i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Używając barwienia Trypana niebieskiego i licznika komórek, sprawdź, że liczba komórek wynosi od 1,2 do 1,8 miliona komórek na mililitr oraz że żywotność przekracza 90%. W stożkowej probówce dodaj 320 mikrogramów oczyszczonego plazmidowego DNA, kodującego rekombinowany gen SLFN14 Myc-FLAG, do ośmiu mililitrów bezsurowicznego nośnika transfekcyjnego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 20–25 stopni Celsjusza. Jednocześnie należy dodać 960 mikrogramów PEI sterylizowanego filtrem 0,22 mikrometra do ośmiu mililitrów bezsurowicowego nośnika transfekcyjnego.Następnie powoli dodaj mieszankę PEI kroplami do roztworu DNA plazmidowego rekombinowanego i inkubuj połączony roztwór przez 15 minut w temperaturze 20 do 25 stopni Celsjusza. Następnie powoli dodaj 16 mililitrów mieszaniny DNA/PEI kroplami do przygotowanych komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Następnie przelej 40 mililitrów transfekowanych komórek do ośmiu stożkowych probówek. Pobieraj transfekowane komórki, wirując w 400g przez pięć minut w temperaturze 20 do 25 stopni Celsjusza. Każdą przetworzoną komórkę ponownie zawiesić 225 mikrolitrów schłodzonego buforu resuspendacyjnego, co daje łącznie 900 mikrolitrów w czterech pelletach.Przenieś połączone zawieszone komórki do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów, która została wcześniej schłodzona na lodzie. Inkubuj rurkę mikrowirówki poziomo na mutatorze przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie klaruj lizat komórkowy przez wirowanie w dawce 21,300g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Połącz klarowany lizat z wyrównaną żywicą antyflagową w rurce mikrowirówki i inkubuj mieszankę poziomo na mutatorze przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wiruj mieszankę lizatanu i żywicy w dawce 8 000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozsypać żywicę. Ostrożnie wyrzuć około 700 mikrolitrów supernatantu, nie naruszając granulek żywicy.Następnie ponownie zawiesij pozostałą mieszankę supernatantów żywicy i przelej ją do pustej kolumny wirowej o pojemności 800 mikrolitrów, włożonej do rurki mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów. Wiruj kolumnę wirującą w 1000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyrzuceniu przepływu przepłukaj wcześniej rurkę mikrowirówki 500 mikrolitrami buforu wysokosolnego i przelej płukanie do kolumny wirującej.Wiruj kolumnę wirującą w 1000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzuć przepływ. Teraz dodaj 500 mikrolitrów buforu wysokosolnego do kolumny wirowej. I wiruj w 1000g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po czterech przemyciach dodaj 55 mikrolitrów buforu elucijnego 3X FLAG bezpośrednio na żywicę. Inkubuj kolumnę spinową pionowo na mutatorze przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirówka kolumny, jak pokazano wcześniej, aby pobrać uniknięte rekombinantne białko SLFN14 Myc-FLAG.Dodaj 100 mikrolitrów połączonej eluy antyflagowej do środka kolumny odsolzającej spin, nie naruszając przy tym żywicy. Eluć rekombinowane białko SLFN14 Myc-FLAG, wirując kolumnę odsolniającą w odspinowaniu w dawce 700g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zmierz absorpcję na 260 i 280 nanometrów z dwóch mikrolitrów odzyskanego białka rekombinowanego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.Dodaj 10 mikrolitrów buforu odsolzającego o pojemności 0,22 mikrometra o niskim lub wysokim stężeniu soli do pustej komory fotometru masowego i zamknij pokrywkę. W sekcji znajdź fokus kliknij rozcieńczenie kropli w oprogramowaniu AcquireMP, aby określić właściwy fokus dołka próbki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roboczego materiału 5X do kropli buforowej i delikatnie pipekuj w górę i w dół, aby wymieszać roztwór i zamknąć pokrywkę nad próbką.Sprawdź ustawienia instrumentów, aby upewnić się, że wartości ruchu, sygnału, nasycenia i ostrości są stabilne i optymalne. Kliknij nagrywanie w oprogramowaniu AcquireMP, aby nagrać 60-sekundowy film. Zapisz plik z wynikiem z opisowym tytułem i znacznikiem czasu w formacie mpr.W sekcji pomiary kliknij przycisk plus-open i przejdź do pliku wyników kalibracyjnych oraz dwukrotnie kliknij na plik standardów białek, aby otworzyć wyniki. W konfiguracji wykresu dostosuj granice kontrastu odpowiednio do 0,0 i minus 0,03. Ręcznie zdefiniuj krzywą Gaussa dla pierwszych czterech standardowych pików białka, przeciągając kursor po każdym pojedynczym piku.Następnie kliknij utwórz i wybierz kalibrację masową z menu. Pod nagłówkiem kalibru przypisz każdemu dopasowanemu pikowi kalibrantu jego znaną masę cząsteczkową 86, 172, 258 i 344 kilodaltonów. Weryfikuj krzywą kalibracyjną, pokazuje wartość R-kwadrat bliską jedności oraz maksymalny błąd masowy poniżej 2%. W ramach pomiarów w oprogramowaniu DiscoverMP kliknij przycisk plus-open, aby wybrać plik wyników dla białka SLFN14 Myc-FLAG.Następnie w sekcji kalibracji kliknij dwukrotnie na plik krzywej kalibracji, aby zastosować kalibrację. Ręcznie zdefiniuj krzywą Gaussa dla każdego obserwowanego gatunku SLFN14 Myc-FLAG, przesuwając kursor po każdym piku, aby uzyskać obliczoną wartość masy cząsteczkowej. Na koniec oblicz średnią masę cząsteczkową dla każdego oligomerowego gatunku na podstawie trzech niezależnych pomiarów wraz z odchyleniem standardowym.Określ stechiometrię rekombinowanego białka SLFN14 Myc-FLAG, oceniając średnią obliczoną masę cząsteczkową względem całkowitych wielokrotności teoretycznej masy protomeru. Białko SLFN14 Myc-FLAG zostało oczyszczone z komórek HEK-293 za pomocą chromatografii anty-Flag, a następnie chromatografii wykluczenia rozmiaru. Reprezentatywny żel SDS-PAGE wykazał skuteczną oczyszczanie białka z wyraźnym pasem pojawiającym się w wypolerowanej linii elucii.Fotometria mas standardów białek wykazała wyraźne piki odpowiadające 86, 172, 258 i 344 kilodaltonom oraz utworzyła krzywą kalibracyjną o idealnej wartości R-kwadrat jeden i maksymalnym błędzie masowym 0,3%. W warunkach fizjologicznych białko SLFN14 Myc-FLAG utworzyło dwa gatunki o masach molekularnych około 241 kilodaltonów i 474 kilodaltonach, oba wyższe niż teoretyczne masy dimeru i tetramera. Podwyższony stosunek absorpcji 260/280 nanometrów wynoszący 1,6 wskazywał na obecność kwasów nukleinowych w próbce SLFN14 Myc-FLAG, co potwierdzono ilościowo-specyficzną dla RNA, wykrywającą około 3,5 mikrograma RNA. W warunkach wysokiego zasolenia białko SLFN14 Myc-FLAG utworzyło dwa gatunki o masach cząsteczkowych około 111 i 218 kilodaltonów, co odpowiadało teoretycznym wartościom monomerów i dimerów, co sugerowało uwalnianie RNA.Protokół ten oferuje szybką strategię produkcji rekombinowanych eukariotycznych rybonukleaz bez potrzeby stabilizacji mutacji. Dodatkowe rozważania mogą być konieczne dla białek wiążących RNA o wysokiej afinitecie, które mają skłonność do kopuryfikacji z komórkowymi kwasami nukleinowymi. Rekombinowane białko wyizolowane z tego protokołu może być wykorzystywane do jakościowych analiz biochemicznych i badań strukturalnych, w tym do krio-EM pojedynczych cząstek.

rapid-production-recombinant-human-slfn14-ribonuclease-stoichiometric

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano nową metodę badania kinetyki enzymatycznej, wykorzystującą ilościową analizę sygnałów FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Wyznaczono wartości KM oraz kcat dla hydrolizy domeny katalitycznej SENP1 (proteazy 1 specyficznej dla SUMO/Sentryny) w odniesieniu do pre-SUMO1 (małego modyfikatora podobnego do ubikwityny). Ogólne zasady tego ilościowego badania kinetyki proteaz w oparciu o technikę FRET mogą zostać zastosowane do innych proteaz.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Ten protokół opisuje rekombinowaną produkcję i oczyszczanie hydrofobiny SC16 z Escherichia coli i zapewnia oparte na fluorescencji testy do monitorowania jej samozbierania.

Rekombinowana Produkcja I Oczyszczanie Hydrofobiny SC16 Z Escherichia coli I Monitorowanie Jej Samoukładania Za Pomocą Testów Fluorescencyjnych

Poznaj szybką metodę produkcji rekombinowanej rybonukleazy SLFN14 u człowieka w liniach komórek ssaczych HEK293 oraz analizę stechiometryczną za pomocą fotometrii masowej.

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów