Name: Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj kompleksowy potok obrazowania do wizualizacji morfologii komórek gwiaździstych wątroby w tkance wątroby myszy. Wykorzystuje on fluorescencyjne znakowanie, clearing tkanek i mikroskopię konfokalową do rekonstrukcji 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te są wspierane przez programy 1R01 DK136016-01 oraz 5P30CA196521 (grant NCI center). Mikroskopia i/lub analiza obrazowa została przeprowadzona w Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE w Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Badania te były częściowo wspierane przez Tisch Cancer Institute at Mount Sinai, P30 CA196521 - Grant wspierający ośrodki onkologiczne.

Wszystkie eksperymenty na mysach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Szkoły Medycyny Icahn przy Mount Sinai. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Generowanie myszy z HSC oznaczonymi tdTomato (TdT)
<ol>
	<li>Uruchom hodowców Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (szczep Jackson Laboratories #00791420 oraz Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) szczep #06959521-JAX, odpowiednio). UWAGA: Spodziewaj się żwirku po 3 tygodniach. Do rozrodu używaj samic LratCre, ponieważ wykazano pewną ekspresję Cre w linii zarodkowej samców.</li>
	<li>Zbieranie ogonów i miotu genotypu F1, aby zidentyfikować Tg(Lrat:Cre); Myszy Tg(LSL-TdT), które selektywnie ekspresują fluorofor TdTomato w komórkach wątrobowych gwiazd.</li>
</ol>
2. Perfuzja i fiksacja wątroby in situ
<ol>
	<li>Przygotowanie przed operacją<ol>
		<li>Przygotuj mieszankę ketaminy i ksylazyny do znieczulenia myszy, mieszając 2 mL ketaminy, 1 mL ksylazyny i 7 ml wody. UWAGA: Ketamina jest substancją kontrolowaną i wymaga odpowiedniej licencji oraz regulacji do użytku laboratoryjnego.</li>
		<li>Przygotuj roztwór perfuzji 4% paradehydu (PFA) w 1x soli fosforanowej z buforem fizjologicznym (PBS).</li>
		<li>Ustaw pompę perystaltyczną, pozwalając 1x PBS przepływać przez rurkę i ustaw przepływ na 2 mL/min. UWAGA: Upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyka powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważ mysz, aby określić ilość mieszanki ketaminy i ksylazyny do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknij mieszankę ketaminy i ksylazyny dootrzewnowej do myszy. UWAGA: Wstrzyknąć 200 μL mieszanki na każde 20 g wagi myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w pojemniku z pokrywką i odczekaj około 20 minut, aż mysz zostanie całkowicie unieczulona. UWAGA: Uszczypnij palce myszy, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu. Upewnij się, że mysz jest nadal żywa w momencie inicjacji perfuzji.</li>
	<li>Przenieś mysz ze szklanego pojemnika na platformę chirurgiczną w pozycji leżącej. UWAGA: PFA jest toksyczne i lotne; Dlatego przeprowadz procedurę perfuzji w okapu chemicznym. Należy gromadzić i utylizować przepływ PFA zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.</li>
	<li>Uszczypnij dłonie stopy myszy kleszczemi, aby upewnić się, że mysz nie ma żadnych odruchów ani spazmów.</li>
	<li>Wbij cztery dłonie igłami, aby rozłożyć odwłok myszy.</li>
	<li>Spryskaj odwłok 70% etanolem, aby zwilżyć futro.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby podnieść skórę na środku odbrzucha, ustawić się z tylnymi nogami i zacząć ciąć skórę (obie warstwy), aby odsłonić odwłok.</li>
	<li>Użyj patyczków watowych z nawilżeniem PBS, aby przesunąć jelita i inne narządy na bok i unieść lewy płat.</li>
	<li>Ostrożnie przetnij błonę połączoną między lewym płatem a płatem ogonowym.</li>
	<li>Użyj szwów, aby zawiązać u górnej podstawy lewego płata.</li>
	<li>Przetnij lewy płat poniżej węzła szwowego i odłóż lewy płatek na bok do pobierania i przetwarzania próbek tkanek, w zależności od potrzeb eksperymentalnych (takich jak bezpośrednie zamrożenie w ciekłym arze, osadzenie w związku o optycznej temperaturze cięcia (OCT) lub utrwalanie formaliny).</li>
	<li>Użyj wacików z nawilżoną PBS, aby przesunąć wątrobę i odsłonić żyłę wrotną.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź igłę cewnika do żyły wrotnej mniej więcej w połowie długości żyły wrotnej. UWAGA: Aby wspomóc włożenie cewnika, podnieś ciało myszy, umieszczając kleszcze pod ciałem, aby uzyskać płaską powierzchnię. Ostrożnie wyrównaj igłę cewnika tak równolegle jak to możliwe do żyły wrotnej przed włożeniem.</li>
	<li>Wyjmij igłę cewnika. UWAGA: Upewnij się, że krew wraca się przez cewnik, aby wskazać na pomyślne założenie.</li>
	<li>Uruchom pompę perfuzyjną z przepływem 2 mL/min, połącz rurkę z cewnikem i przeinfunduj wątrobę 20 mL 1x PBS. UWAGA: Upewnij się, że cewnik jest całkowicie wypełniony krwią, a rurka całkowicie wypełniona buforem perfuzyjnym, zanim podłączysz je, aby absolutnie nie dostały się do organizmu pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zacisnij tętnicę płucną nad wątrobą hemostatem, aby zatrzymać 1x PBS przed przejściem przez serce.</li>
	<li>Przetnij dolną żyłę główną (dolną), aby uwolnić nagromadzone ciśnienie.</li>
	<li>Reguluj prędkość pompy do 5 mL/min. UWAGA: Na zakończenie przelewu należy odczekać około 15 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę, aby zmienić zawartość zbiornika na 4% PFA. UWAGA: Upewnij się, że nie wprowadzasz pęcherzyków powietrza do rury, zatrzymując pompę, gdy w zbiorniku jest jeszcze ciecz.</li>
	<li>Przekręć wątrobę 25 mL 4% PFA.</li>
	<li>Po zakończeniu perfuzji usuń wątrobę od otaczających narządów, przecinając tkanki łączące.</li>
	<li>Umieść wątrobę w stożkowej probówce o pojemności 50 mL, wypełnionej 25 ml 4% PFA.</li>
	<li>Umieść rurkę poziomo na ławce bujającej się na noc w temperaturze 4 °C przy 1,5 obr./min, aby zapewnić ruch roztworu.</li>
	<li>Myj wątrobę 3 razy w 1x PBS na ławce bujającej przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 1,5 obr./min.</li>
	<li>Przechowuj wątrobę w 20 mL 1x PBS z stężeniem 0,02% NaN3 w temperaturze 4 °C. UWAGA: Przechowywać wątrobę długoterminowo na tym etapie, co najmniej do roku.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie tkanek na bazie iDISCO+
UWAGA: Oryginalny opis protokołu iDISCO+ jest dostępny w wieku 17
Dzień 1: Próbka odwodnienia
<ol>
	<li>Pokrój próbki wątroby na kawałki o rozmiarach około 0,5-1 cm3. UWAGA: Różne próbki tnij na różne kształty, aby ułatwić wykrywanie podczas etapów obrazowania.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczenia 20% (objętość/objętość), 40%, 60% i 80% metanolu w wodzie w osobnych szklanych butelkach.</li>
	<li>Wkładaj próbki wątroby do szklanych fiolek z zakrętkami (np. 4-7 mL). UWAGA: Włóż do 6 kawałków próbki wątroby w jednej szklanej fiolce o pojemności 7 mL.</li>
	<li>Próbkę odsusz za pomocą rozcieńczenia metanolu z serii H2O, 20% (vol/vol), 40%, 60% i 80% przez 1 godzinę każdą w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
	<li>Przemyj próbkę kolejnym 100% metanolem na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania przez godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Schłodź próbkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczenie DCM w stężeniu 66% (vol/vol) w metanolu w szklanej butelce. UWAGA: Za każdym razem przygotowuj nowe rozcieńczenia. Do przygotowania roztworu używaj cylindrów szklanych, ponieważ DCM może rozpuszczać plastik, taki jak polistyren.</li>
	<li>Inkubuj próbki w roztworze 66% DCM/metanolu przez noc na rotatorze kołowym przy 8 obr./min w temperaturze pokojowej, bez wirowania. UWAGA: Uważaj, aby próbki nie wypływały na górę po dodaniu roztworu.</li>
</ol>
Dzień 2: Próbka wybielania
<ol start="9">
	<li>Przemyj próbkę dwukrotnie 100% metanolem na rotatorze koła przy 8 obr./min, bez wirowania przez 1 godzinę za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Schłodź próbkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Wybielaj próbkę w schłodzonym 5%H2O2 w metanolu (1 objętość 30%H2O2 do 5 woluminów metanolu) na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania, w temperaturze 4 °C przez noc. UWAGA: Za każdym razem przygotuj nowe rozwiązanie.</li>
</ol>
Dzień 3-5: Próbka permeabilizacji
<ol start="12">
	<li>Nawodnij metanol/serię H2O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
	<li>Przemyj próbkę dwukrotnie w PTx.2 (Tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym o częstotliwości 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu.</li>
	<li>Inkubuj próbki w roztworze permeabilizacji (Tabela 1) w temperaturze 37 °C przez 2 dni.</li>
</ol>
Dzień 5-17: Immunoznakowanie
<ol start="15">
	<li>Blokuj próbki w roztworze blokującym (Tabela 1) przez 2 dni w temperaturze 37 °C. UWAGA: Za każdym razem przygotowuj świeży środek blokujący ze względu na niestabilność surowicy osiołka. Przechowuj pozostałe środki blokujące w temperaturze 4 °C do miesiąca.</li>
	<li>Inkubuj próbki w przeciwciałach pierwotnych rozcieńczonych w PTwH (Tabela 1) z 5% DMSO i 3% surowiką Donkey w temperaturze 37 °C na rotatorze kołowym przy 5 obr./min, bez wirowania przez 4 dni. UWAGA: Zacznij od rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych 1:500.</li>
	<li>Przemywaj próbki w PTwH 4-5 razy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym z prędkością 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu (centrifugation). UWAGA: Opcjonalnie pozostawić próbki do prania przez noc.</li>
	<li>Inkubować próbki w przeciwciałach wtórnych i propidiu rozcieńczonym w PTwH z 3% surowiką Donkey w temperaturze 37 °C na rotatorze kołowym przy 5 obr./min, bez wirowania przez 4 dni. UWAGA: Zacznij od rozcieńczenia przeciwciał wtórnych 1:500. Użyj rozcieńczenia jodku propidiu w stosunku 1:250 z roztworu 5 mg/mL z jodku propidiu.</li>
	<li>Przemywaj próbki w PTwH 4-5 razy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym z prędkością 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu (centrifugation).</li>
	<li>Pozostawić próbkę w PTwH na noc, w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
</ol>
Dzień 18: Oczyszczanie
<ol start="21">
	<li>Próbkę odsusz za pomocą rozcieńczenia metanolu w serii H2O, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% przez 1 godzinę każdą w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
	<li>Przemyj próbkę dwukrotnie 100% metanolem na obrot przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu.</li>
	<li>Inkubuj próbkę w rozcieńczonych 66% (vol/vol) DCM w metanolu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
	<li>Przemyj próbkę dwukrotnie w 100% DCM przez 15 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.</li>
	<li>Inkubuj próbkę w DBE przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.</li>
	<li>Przechowuj próbki przez dłuższy czas w DBE do roku bez wpływu na sygnał barwienia.</li>
</ol>
4. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym
<ol start="1">
	<li>Umieść wyczyszczoną próbkę w misce o szklanym dnie o średnicy 35 mm i szklanym dnie o rozmiarze #1.5.</li>
	<li>Napełnij miskę cynamatem etylom, aby całkowicie zanurzyć próbkę.</li>
	<li>Umieść antenę na konfokalnym i dostosuj ostrość, aby wybrać najlepszą płaszczyznę, która daje najjaśniejszy sygnał.</li>
	<li>Pobierz obraz kafelkowy na najjaśniejszym poziomie, aby uchwycić duży obszar próbki, używając formatu 1024 x 1024 i prędkości 600. UWAGA: Użyj niższego celu (10x lub 20x) dla obrazu kafelka, aby zmniejszyć czas obrazowania i rozmiar pliku.</li>
	<li>Na podstawie obrazu kafelka wybierz interesujące obszary, aby zebrać skan z-skan o wyższej rozdzielczości.</li>
	<li>Wykonaj skan z-scan przez wyczyszczoną tkankę, obejmując całą jej głębokość z najlepszą rozdzielczością mikroskopu, używając formatu 1024 x 1024 i prędkości 600. UWAGA: Użyj obiektywu 40x w zanurzeniu olejowym, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość dla HSC.</li>
	<li>Zapisz pliki obrazów w formacie LIF i podglądaj pliki za pomocą Fiji lub ImarisViewer 11.0.0.</li>
</ol>
5. Analiza obrazów do rekonstrukcji 3D oraz analiza ilościowa poszczególnych HSC
<ol>
	<li>Konwertowanie plików obrazów do formatu IMS za pomocą ImarisFileConverter 10.2.0.</li>
	<li>Użyj modelu powierzchniowego w Imaris 10.2.0, aby wykryć obiekt na obrazach.</li>
	<li>Użyj kreatora Tworzenia, aby przeprowadzić analizę wybranego obszaru zainteresowania 3D, a następnie zastosować ją na całym obrazie. UWAGA: Użyj tego, aby przyspieszyć proces analizy.</li>
	<li>Wybierz kanał źródłowy, absolutną intensywność i odznacz przycisk wygładzania, aby określić próg intensywności dla całego obrazu.</li>
	<li>Zmodyfikuj próg, aby uchwycić wszystkie obiekty na obrazie.</li>
	<li>Użyj liczby wokseli do filtrowania obiektów zanieczyszczenia.</li>
	<li>Sfinalizuj czarodzieja, naciśnij przycisk statystyki, aby uzyskać wszystkie pomiary statystyczne.</li>
</ol>

<ol><li>Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis%3A+from+mechanisms+to+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibrosis: from mechanisms to medicines.</a> Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).</li>
<li>Wang, S., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Found+in+translation-Fibrosis+in+metabolic+dysfunction-associated+steatohepatitis+%28MASH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH).</a> Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).</li>
<li>Amini-Salehi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+An+updated+review+meta-analysis+comprising+a+population+of+78+million+from+38+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries.</a> Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).</li>
<li>Ekstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+stage+is+the+strongest+predictor+for+disease-specific+mortality+in+NAFLD+after+up+to+33+years+of+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up.</a> Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).</li>
<li>Hagström, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+stage+but+not+NASH+predicts+mortality+and+time+to+development+of+severe+liver+disease+in+biopsy-proven+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD.</a> J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).</li>
<li>Geng, Y., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cell+heterogeneity%3A+Functional+aspects+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications.</a> Hepatology. , (2025).</li>
<li>Trinh, V. Q. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+maintain+liver+homeostasis+through+paracrine+neurotrophin-3+signaling+that+induces+hepatocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation.</a> Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).</li>
<li>Sugimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+control+liver+zonation%2C+size+and+functions+via+R-spondin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3.</a> Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).</li>
<li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li>
<li>Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+Signals+leading+to+the+amplification+of+the+fibrogenic+hepatic+stellate+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell.</a> Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).</li>
<li>Marra, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+the+regulation+of+liver+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation.</a> J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).</li>
<li>Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+expression+by+nonparenchymal+rat+liver+cells+in+experimental+biliary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis.</a> Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).</li>
<li>Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+Unique+characteristics+in+cell+biology+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype.</a> Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).</li>
<li>Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+and+multifunctionality+of+hepatic+stellate+cells+in+liver+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Commun%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology.</a> Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).</li>
<li>Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+plasticity-Metabolic+regulation+of+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells.</a> Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).</li>
<li>Niki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+glial+fibrillary+acidic+protein+and+desmin+staining+in+normal+and+CCl4-induced+fibrotic+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers.</a> Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+A+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).</li>
<li>Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+optical+clearing%2C+three-dimensional+imaging%2C+and+computer+morphometry+in+whole+mouse+lungs+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Mederacke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+hepatic+stellate+cells+as+dominant+contributors+to+liver+fibrosis+independent+of+its+aetiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology.</a> Nat Commun. 4, 2823(2013).</li>
<li>Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+tetrachloride+toxicity+as+a+model+for+studying+free-radical+mediated+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).</li>
<li>Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> iScience. 24 (4), 102387(2021).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+blood+and+its+application+in+biomedical+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research.</a> Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids%3A+Evergreen+autofluorescent+biomarkers+for+the+liver+functional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling.</a> Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).</li>
<li>Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+deep+imaging+of+the+kidney+using+confocal+and+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje powtarzalny i elastyczny proces przygotowywania próbki, prowadzący do trójwymiarowej wizualizacji i ilościowej analizy morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Integracja genetycznego znakowania komórek fluorescencyjnego, perfuzji wątroby in situ oraz zmodyfikowanej metody oczyszczania iDISCO+ umożliwia obrazowanie dużych objętości tkanek w rozdzielczości pojedynczych komórek, przy jednoczesnym zachowaniu architektury przestrzennej mikrośrodowiska wątroby.
K...

Włóknienie, czyli patologiczne bliznowactwo tkanek, jest ostatnią wspólną ścieżką niemal wszystkich przewlekłych chorób narządów i przyczynia się do około 40% zgonów w krajach uprzemysłowionych.1. W wątrobie włóknienie powstaje w wyniku przewlekłych zaburzeń wątroby, takich jak wirusowe zapalenie wątroby, używanie alkoholu lub coraz częściej zaburzenia metaboliczne związane ze steatotyczną chorobą wątroby (MASLD), która obecnie dotyka 30-40% dorosłych w USA. Przewlekłe uszkodzenia wątroby i wynikające z nich postępujące włóknienie znacznie zwiększają ryzyko końcowych chorób wątroby, takich jak marskość wątroby, niewydolność wątroby i rak wątrobowokomórkowy2, 3,4,5.
Komórki wątrobowe gwiaździste (HSC) są kluczowe dla homeostazy wątroby i fibrogenezy. W zdrowych wątrobach HSC występują w stanie spokojnym, magazynującym witaminę A i przyczyniają się do homeostazy hepatocytów, a ogólnie całej wątroby 6,7. Jest to wyraźnie potwierdzone badaniami wyczerpania HSC, gdzie usunięcie niemal wszystkich HSC w zdrowej wątrze zmniejsza masę wątroby i poważnie ogranicza regenerację wątroby 7,8. Po urazie HSC aktywują się w komórkach podobnych do miofibroblastów, które się mnożą, migrują do uszkodzonych miejsc i produkują nadmiar macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc włókniste blizny. Aktywowane HSC w wątrobach włóknistych są również źródłem fibroblastów związanych z nowotworem i odgrywają rolę promującą nowotwory w raku wątrobowokomórkowym 9,10,11,12. Spoczynkowe HSC posiadają unikalną, neuronowatą morfologię z małymi ciałami komórkowymi, z których wyrastają projekcje na daleki zasięg. HSC zmieniają się w płaski, arkuszowy kształt miofibroblastu po aktywacji w włóknieniu13. Chociaż dziesięciolecia badań wyjaśniły szlaki sygnalizacyjne kontrolujące produkcję ECM przez HSC, funkcjonalne znaczenie ich odrębnej morfologii neuronalnej, sposób regulacji, czy mogą ułatwiać interakcje w niszy HSC oraz przyczyniać się do fibrogeniczności i chorób HSC, pozostają nieuchwytne14,15.
Obecne metody wizualizacji morfologii HSC ograniczają się do dwuwymiarowych (2D) obrazów komórek hodowanych in vitro lub przekrojów tkanek in vivo i rzadko obejmują całą morfologię HSC z projekcjami rozciągającymi się na kilka długości ciał komórek we wszystkich kierunkach. Ponadto najczęściej stosowany marker HSC, desmin, nie jest w stanie w pełni uchwycić unikalnej, neuronowatej morfologii HSC w barwieniu immunofluorescencyjnym, ponieważ desmin jest białkiem cytoszkieletu, które znakuje jedynie włókna pośrednie w HSC16. Dotychczasowe wyzwania metodologiczne utrudniały pełne uchwycenie morfologii HSC i ich interakcji komórkowych w sposób trójwymiarowy (3D) w ich naturalnym kontekście z rozdzielczością pojedynczych komórek. W rezultacie fundamentalne pytania dotyczące tego, jak morfologia HSC odnosi się do ich stanu funkcjonalnego i interakcji z sąsiednimi typami komórek, pozostają nierozwiązane.
Niniejszy artykuł przedstawia innowacyjny i kompleksowy proces obrazowania oraz analizy umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Metoda ta integruje kilka kluczowych innowacji: (1) znakowanie fluorescencyjne HSC z wykorzystaniem modeli myszy genetycznych reporterów, (2) optymalizację perfuzji i fiksacji wątroby in situ w celu zachowania nienaruszonej architektury tkanek i relacji komórkowych, (3) zmodyfikowany protokół oczyszczania tkanek oparty na iDISCO w celu uzyskania przezroczystości optycznej17, (4) wysokorozdzielcza mikroskopia konfokalna do głębokiego rejestrowania obrazów tkankowych oraz (5) spersonalizowany proces obliczeniowy do rekonstrukcji obrazów 3D oraz analiza ilościowa poszczególnych HSC. Protokół nakłada pewne ograniczenia dotyczące wielkości tkanek i zaangażowania czasowego, które należy uwzględnić. Razem protokół ten zapewnia solidne i powtarzalne ramy do rejestrowania złożonej struktury 3D HSC oraz mapowania ich relacji przestrzennych z sąsiednimi komórkami naczyniowymi, immunologicznymi i miaskrzymowymi. Strategie i procesy przedstawione tutaj dla wątroby są łatwo adaptowalne także do innych narządów 17,18,19.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-RFP, królik, wstępnie adsorbowane</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>4-komorowa szklana płytka o średnicy 35 mm z mikrowgłębiem 20 mm, szyba pokrywa #1.5</td><td>Cellvis</td><td>D35C4201,5N</td><td></td></tr><tr><td>Zastrzyk AnaSed (zastrzyk z ksylazyny)</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 593990110-20</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>Stożkowe rurki wirówkowe: 50ml&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Patyki watowe</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione zamki&nbsp; Hemostaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-sprzężony AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-153</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki do obsługi 4,75" Zakrzywione, ostre/tępe</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td> 728501</td><td></td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy (DBE), 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM) i nie wiadomo; &ge; 99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosiarkowotlenkowy (DMSO), &ge; 99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw królikom osiołkiemu przeciwciału przeciw królikom (H+L) z silną adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Cynaminian etylo, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Extra drobne nożyczki do mikrorozcinania; Łopatka 24 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9232515</td><td></td></tr><tr><td>Szczur przeciwciała monoklonalne F4/80</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9214139</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Chem-Impex</td><td>29984</td><td></td></tr><tr><td>Piec hybrydyzacyjny Hybaid</td><td>Triad Scientific</td><td>Maxi 14</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris 10.2.0</td><td>Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImarisFileConverter 10.2.0</td><td>Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImarisViewer 11.0.0</td><td>Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cewnik dożylny</td><td>Exel International Inc.</td><td>EXE 26751</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, zastrzyk chlorowodorku</td><td>Dechra</td><td>B8U4</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS X 4.4.0.24861</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica Stellaris 8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol, klasa HPLC</td><td>Fisher</td><td>A452-2</td><td></td></tr><tr><td>Rotator wielofunkcyjny</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Model 151</td><td></td></tr><tr><td>Druty (27G x 1/2'')</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Paraformadehylde, proszek, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Model Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Rura pompy perystaltycznej, MasterFlex</td><td>Thermo Scientific</td><td>96400-16</td><td>3,1 mm średnicy x 7,6 m rurka silikonowej utwardzonej nadtlenkiem utlenionej, rozmiar L/S 16, 1/8 cala z wężem</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Bezpłodny, pH 7,0–7,2, bez wapnia, magnezu</td></tr><tr><td>Propidium jodek, &ge; 94,0% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>VWR</td><td>Model 200</td><td></td></tr><tr><td>Azyd sodu i ga; 99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>Ethicon</td><td>J109T</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 mL)</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki, z nakrętką z nakrętką i zakrętką z aluminiową okładką, gotowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27470-U</td><td>tom 7 mL, fiolka z bursztynowego szkła, O.D. &times; H 17 mm & razy; 60 mm, gwint do 15-425</td></tr></tbody></table>

mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Mapping Hepatic Stellate Cell Morphology in Mouse Models of Liver Fibrosis

Fibroblasty obecne w tkankach są komórkowymi czynnikami napędzającymi włóknienie tkanek. W wątrobie komórki wątrobowe gwiaździste (HSC), czyli rezydentne pericyty o unikalnej "gwiaździstej" morfologii, aktywują się w fibrogenne miofibroblasty podczas urazu, tworząc bliznę wątrobową. Chociaż dekady badań wyjaśniły główne szlaki sygnalizacyjne leżące u podstaw aktywacji HSC, funkcjonalne znaczenie ich charakterystycznej morfologii dendrytycznej pozostaje nieuchwytne ze względu na techniczne ograniczenia w obrazowaniu i analizie. Protokół ten oferuje kompleksowy proces obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne HSC z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość w próbkach tkankowych o grubości kilku centymetrów. Usunięte próbki są obrazowane za pomocą zoptymalizowanych platform mikroskopii konfokalnej, a zbiory danych obrazów przetwarzane są w niestandardowym procesie analizy do trójwymiarowej rekonstrukcji pojedynczych HSC w rozdzielczości pojedynczej komórki. Razem ten pipeline umożliwia powtarzalne mapowanie morfologii HSC w złożonym mikrośrodowisku wątroby, w tym ich procesów dendrytycznych i relacji przestrzennych z sąsiednimi komórkami. Poza wątrobą, przepływ pracy jest adaptowalny do fibroblastów w innych narządach, takich jak płuco, nerki, jelita i serce, gdzie rezydujące komórki mezenchymalne wykazują podobne funkcje fibrogenne w chorobach. Proponowane ramy ustanawiają zatem podstawę metodologiczną do porównawczych badań międzynarządowych w celu zbadania relacji struktura i funkcja fibroblastów oraz podatności terapeutyczne w chorobach włóknistych.

Udana perfuzja i utrwalenie wątroby myszy reprezentowane jest jednolitym bladym, beżowo-żółtym kolorem wątroby, co odzwierciedla efektywne usuwanie krwi i penetrację utrwalacza (Rysunek 1A,B). Nieprawidłowa perfuzja powoduje powstawanie ciemnoczerwonych lub brązowych obszarów zakrzepów, co obniża przejrzystość optyczną i powoduje wysoki sygnał tła w tych obszarach próbek (rysunek 1C).
Podczas oczyszczania tkanek próbk...

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Tissue-resident fibroblasts are the cellular drivers of fibrosis across tissues. Within the liver, hepatic stellate cells (HSCs), the resident pericytes ...

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Obecne obrazowanie 2D pomija pełną morfologię komórek gwiaździstych, ograniczając wiedzę strukturalną i funkcjonalną. Protokół ten umożliwia solidne przechwytywanie złożonej architektury 3D.Na początek uszczypnij dłonie znieczulonej myszy, aby zapewnić odpowiednią znieczulenie. Spryskaj odwłok 70% etanolem, aby zwilżyć sierść. Parą kleszczy podnieś skórę w środku brzucha, wyrównaną z tylnymi nogami, i zacznij ciąć skórę, aby odsłonić odwłok.Następnie użyj wacików zwilżonych PBS, aby przesunąć jelita i inne narządy na bok i unieść lewy płat. Ostrożnie przetnij błonę połączoną między lewym płatem a płatem ogonowym. Następnie użyj szwów, aby zawiązać u górnej podstawy lewego płata.Przetnij lewy płat poniżej węzła szwowego i odłóż go na bok do pobrania i przetwarzania próbek tkanek. Użyj patyczków watowych zwilżonych przez PBS, aby przesunąć wątrobę i odsłonić żyłę wrotną. Następnie ostrożnie wprowadza igłę cewnika do żyły portalnej mniej więcej w połowie jej długości.Wyjmij igłę cewnika. Upewnij się, że krew cofa się przez cewnik, aby wskazać na pomyślne założenie. Podłącz wypełnioną rurkę z działającej pompy perfuzyjnej do cewnika i przekrąż wątrobę 20 mililitrami PBS.Zacisnąć tętnicę płucną nad wątrobą hemostatem, aby zatrzymać przejście PBS przez serce. Przetnij dolną żyłę główną (dolną), aby uwolnić nagromadzone ciśnienie. Reguluj prędkość pompy do pięciu mililitrów na minutę.Po 15 minutach zatrzymaj pompę, aby zmienić zbiornik na 4% paradehydu, a następnie przekręć wątrobę 25 mililitrami 4% paradehydu. Po zakończeniu perfuzji usuń wątrobę od otaczających narządów, przecinając tkanki łączące. Umieść wątrobę w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, wypełnionej 25 mililitrami 4% paraformaldehydu.Umieść tubę poziomo na platformie do bujania na ławce przez noc w chłodnym pomieszczeniu przy czterech stopniach Celsjusza i 1,5 obrotu na minutę. Następnego dnia myj wątrobę trzy razy w PBS na platformie do bujania na ławce przez 30 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 1,5 obrotu na minutę. Przełóż wątrobę do 20 mililitrów PBS z 0,02% azydku sodu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pokrój próbki wątroby na kawałki o wielkości około 0,5 do 1 centymetra sześciennego. Przełóż próbki wątroby do szklanych fiolek z zakrętkami. Próbki odsusz w serii metanolu rozcieńczonej wodą od 20% do 80% na rotatorze kołowym z prędkością ośmiu obrotów na minutę przez jedną godzinę każda, w temperaturze pokojowej.Po wykonaniu wybielania próbki, permeabilizacji, immunoznakowania i oczyszczania, inkubuj próbkę w eterze dibenzylowym przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem. Próbki mogą być przechowywane w eterze dibenzynowym do roku bez utraty sygnału barwienia. Do obrazowania konfokalnego umieść wyczyszczoną próbkę w naczyniu o szklanym dnie o średnicy 35 milimetrów i szklanym dnie o rozmiarze 1,5.Napełnij miskę cynamatem etylom, aby całkowicie zanurzyć próbkę. Następnie umieść talerz na stole mikroskopu konfokalnego. Pobierz obraz kafelkowy na najjaśniejszym poziomie, aby uchwycić duży obszar próbki w formacie 1024 na 1024 i prędkości 600.Na podstawie obrazu kafelka wybierz interesujące obszary, aby uzyskać skan Z o wyższej rozdzielczości. Następnie pobierz stos Z obejmujący całą głębokość czystej tkanki w najwyższej rozdzielczości obsługiwanej przez mikroskop, używając formatu 1024 na 1024 i prędkości skanowania 600. Udana perfuzja i fiksacja wątroby myszy dały jednolity, jasnożółty kolor.Nieprawidłowa perfuzja powodowała powstawanie ciemnoczerwonych lub brązowych obszarów zakrzepów, co obniżało przejrzystość optyczną i powodowało wysoki sygnał tła w tych miejscach. Całkowita przezroczystość optyczna została osiągnięta po inkubacji w eterze dibenzylo, gdzie tkanka wydawała się przezroczysta w porównaniu do sytuacji przed klarowaniem. Wysokorozdzielcze stosy Z ujawniły drobne procesy dendrytyczne rozciągające się z ciała komórek poszczególnych wątrobowych komórek gwiaździstych.Zarówno kontrolne, jak i przewlekłe próbki wątroby czterochlorku węgla wykazały silne i stabilne sygnały fluorescencyjne pod mikroskopią konfokalną. Ten potok odtwarzalnie mapuje morfologię komórek gwiaździstych w złożonym serwerze mikrośrodowiska, rejestrując procesy dendrytyczne i relacje przestrzenne z sąsiednimi komórkami. Zaangażowanie czasowe jest ważnym czynnikiem przy realizacji protokołu.Proces rozliczania trwa około trzech tygodni i wymaga wcześniejszego planowania. Umożliwiając precyzyjną analizę morfometryczną 3D, platforma ta łączy strukturę fibroblastów z funkcjami, poszerzając wiedzę o homeostazie tkanek i mechanizmie Z.

mapping-hepatic-stellate-cell-morphology-mouse-models-liver

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. W celu oczyszczania komórek gwiaździstych, wątroby mysie poddawane są trawieniu in situ oraz in vitro przy użyciu pronazy i kolagenazy przed przeprowadzeniem wirowania w gradiencie gęstości. Technika ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości komórek gwiaździstych wątroby.

Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Zakłócenie przepływu żółci powoduje ciężkie zapalne cholestatyczne uszkodzenie wątroby z charakterystyczną, zależną od czasu sekwencją zmian morfologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół chirurgicznego podwiązania przewodu żółciowego wspólnego u myszy, który pozwala na wywołanie silnej odpowiedzi zwłóknieniowej po 21 do 28 dniach.

Podwiązanie dróg żółciowych u myszy: indukcja zapalnego uszkodzenia wątroby i zwłóknienia przez chalestazę obturacyjną

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Poznaj kompleksowy potok obrazowania do wizualizacji morfologii komórek gwiaździstych wątroby w tkance wątroby myszy. Wykorzystuje on fluorescencyjne znakowanie, clearing tkanek i mikroskopię konfokalową do rekonstrukcji 3D.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Przeglądaj więcej filmów