Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Obecne obrazowanie 2D pomija pełną morfologię komórek gwiaździstych, ograniczając wiedzę strukturalną i funkcjonalną. Protokół ten umożliwia solidne przechwytywanie złożonej architektury 3D.

Na początek uszczypnij dłonie znieczulonej myszy, aby zapewnić odpowiednią znieczulenie. Spryskaj odwłok 70% etanolem, aby zwilżyć sierść. Parą kleszczy podnieś skórę w środku brzucha, wyrównaną z tylnymi nogami, i zacznij ciąć skórę, aby odsłonić odwłok.

Następnie użyj wacików zwilżonych PBS, aby przesunąć jelita i inne narządy na bok i unieść lewy płat. Ostrożnie przetnij błonę połączoną między lewym płatem a płatem ogonowym. Następnie użyj szwów, aby zawiązać u górnej podstawy lewego płata.

Przetnij lewy płat poniżej węzła szwowego i odłóż go na bok do pobrania i przetwarzania próbek tkanek. Użyj patyczków watowych zwilżonych przez PBS, aby przesunąć wątrobę i odsłonić żyłę wrotną. Następnie ostrożnie wprowadza igłę cewnika do żyły portalnej mniej więcej w połowie jej długości.

Wyjmij igłę cewnika. Upewnij się, że krew cofa się przez cewnik, aby wskazać na pomyślne założenie. Podłącz wypełnioną rurkę z działającej pompy perfuzyjnej do cewnika i przekrąż wątrobę 20 mililitrami PBS.

Zacisnąć tętnicę płucną nad wątrobą hemostatem, aby zatrzymać przejście PBS przez serce. Przetnij dolną żyłę główną (dolną), aby uwolnić nagromadzone ciśnienie. Reguluj prędkość pompy do pięciu mililitrów na minutę.

Po 15 minutach zatrzymaj pompę, aby zmienić zbiornik na 4% paradehydu, a następnie przekręć wątrobę 25 mililitrami 4% paradehydu. Po zakończeniu perfuzji usuń wątrobę od otaczających narządów, przecinając tkanki łączące. Umieść wątrobę w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, wypełnionej 25 mililitrami 4% paraformaldehydu.

Umieść tubę poziomo na platformie do bujania na ławce przez noc w chłodnym pomieszczeniu przy czterech stopniach Celsjusza i 1,5 obrotu na minutę. Następnego dnia myj wątrobę trzy razy w PBS na platformie do bujania na ławce przez 30 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 1,5 obrotu na minutę. Przełóż wątrobę do 20 mililitrów PBS z 0,02% azydku sodu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pokrój próbki wątroby na kawałki o wielkości około 0,5 do 1 centymetra sześciennego. Przełóż próbki wątroby do szklanych fiolek z zakrętkami. Próbki odsusz w serii metanolu rozcieńczonej wodą od 20% do 80% na rotatorze kołowym z prędkością ośmiu obrotów na minutę przez jedną godzinę każda, w temperaturze pokojowej.

Po wykonaniu wybielania próbki, permeabilizacji, immunoznakowania i oczyszczania, inkubuj próbkę w eterze dibenzylowym przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem. Próbki mogą być przechowywane w eterze dibenzynowym do roku bez utraty sygnału barwienia. Do obrazowania konfokalnego umieść wyczyszczoną próbkę w naczyniu o szklanym dnie o średnicy 35 milimetrów i szklanym dnie o rozmiarze 1,5.

Napełnij miskę cynamatem etylom, aby całkowicie zanurzyć próbkę. Następnie umieść talerz na stole mikroskopu konfokalnego. Pobierz obraz kafelkowy na najjaśniejszym poziomie, aby uchwycić duży obszar próbki w formacie 1024 na 1024 i prędkości 600.

Na podstawie obrazu kafelka wybierz interesujące obszary, aby uzyskać skan Z o wyższej rozdzielczości. Następnie pobierz stos Z obejmujący całą głębokość czystej tkanki w najwyższej rozdzielczości obsługiwanej przez mikroskop, używając formatu 1024 na 1024 i prędkości skanowania 600. Udana perfuzja i fiksacja wątroby myszy dały jednolity, jasnożółty kolor.

Nieprawidłowa perfuzja powodowała powstawanie ciemnoczerwonych lub brązowych obszarów zakrzepów, co obniżało przejrzystość optyczną i powodowało wysoki sygnał tła w tych miejscach. Całkowita przezroczystość optyczna została osiągnięta po inkubacji w eterze dibenzylo, gdzie tkanka wydawała się przezroczysta w porównaniu do sytuacji przed klarowaniem. Wysokorozdzielcze stosy Z ujawniły drobne procesy dendrytyczne rozciągające się z ciała komórek poszczególnych wątrobowych komórek gwiaździstych.

Zarówno kontrolne, jak i przewlekłe próbki wątroby czterochlorku węgla wykazały silne i stabilne sygnały fluorescencyjne pod mikroskopią konfokalną. Ten potok odtwarzalnie mapuje morfologię komórek gwiaździstych w złożonym serwerze mikrośrodowiska, rejestrując procesy dendrytyczne i relacje przestrzenne z sąsiednimi komórkami. Zaangażowanie czasowe jest ważnym czynnikiem przy realizacji protokołu.

Proces rozliczania trwa około trzech tygodni i wymaga wcześniejszego planowania. Umożliwiając precyzyjną analizę morfometryczną 3D, platforma ta łączy strukturę fibroblastów z funkcjami, poszerzając wiedzę o homeostazie tkanek i mechanizmie Z.