Name: Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:53:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Naucz się izolować wysepki trzustkowe od szczurów Lewisa metodą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego. Protokół zapewnia wysoką czystość, żywotność i funkcjonalność komórek do badań nad cukrzycą i transplantologią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez National Institutes of Health (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) oraz NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D-2021-1078-S-B (AG) oraz-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), a także Fundację Vivian L. Smith.

<ol><li>Grattoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+cellular+therapeutics+for+type+1+diabetes+mellitus%3A+progress%2C+challenges%2C+and+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead.</a> Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).</li>
<li>Páez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+%CE%B2+cell+transplantation+to+treat+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for β cell transplantation to treat type 1 diabetes mellitus.</a> Cell Transplant. 31, 963689721004(2022).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+and+its+relevance+to+%CE%B2-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets and its relevance to β-cell function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+microvasculature+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet microvasculature and blood flow.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1871-1883 (2014).</li>
<li>Jiang, F. X., Morahan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet architecture and function.</a> Cell Death Discov. 10, 170(2024).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+%CE%B2-cell+apoptosis+and+functional+suppression+in+isolated+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces β-cell apoptosis and functional suppression in isolated islets.</a> PLoS One. 9 (12), e114868(2014).</li>
<li>Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+antioxidant+enzyme+gene+expression+and+antioxidative+defense+status+of+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidative defense status of insulin-producing cells.</a> Diabetes. 46 (11), 1733-1742 (1997).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shipment+of+human+islets+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Shipment of human islets for transplantation.</a> Am J Transplant. 7 (4), 1010-1020 (2007).</li>
<li>Carobbio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+GSIS+kinetics+in+freshly+isolated+mouse+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Rapid GSIS kinetics in freshly isolated mouse islets.</a> Diabetologia. 47 (9), 1652-1662 (2004).</li>
<li>Zawalich, W. S., Zawalich, K. C., Kelley, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+perifusion+of+fresh+rat+and+mouse+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Immediate perifusion of fresh rat and mouse islets.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (2), E444-E450 (2008).</li>
<li>Wassmer, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+freshly+isolated+islets+transplanted+within+48+h%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Clinical use of freshly isolated islets transplanted within 48 h.</a> Transplant Proc. 53 (6), 1907-1912 (2021).</li>
<li>Tai, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+autotransplantation+of+islets+following+total+pancreatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Surg%22%5BJournal%5D)">Immediate autotransplantation of islets following total pancreatectomy.</a> JAMA Surg. 150 (5), 472-479 (2015).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Emamaullee, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewis+rats+in+transplantation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lewis rats in transplantation studies.</a> Diabetes. 65 (5), 1350-1359 (2016).</li>
<li>de Groot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+islet+isolation+yield+and+function+are+donor+strain+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Rat islet isolation yield and function are donor strain dependent.</a> Lab Anim. 38 (2), 200-206 (2004).</li>
<li>Moazenchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability+in+islet+yield+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Strain variability in islet yield and isolation.</a> Islets. 2 (5), 283-289 (2010).</li>
<li>Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+variability+limits+reproducibility+in+rat+islet+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies.</a> PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).</li>
<li>Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flaws+and+future+of+islet+volume+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The flaws and future of islet volume measurements.</a> Cell Transplant. 27 (4), 571-578 (2018).</li>
<li>Kissler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methodologies+for+quantifying+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Validation of methodologies for quantifying isolated human islets.</a> Cell Transplant. 18 (6), 611-620 (2009).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+assessment+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet assessment for transplantation.</a> Cell Transplant. 18 (6), 519-528 (2009).</li>
<li>Dono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+collagenase+digestion+for+islet+isolation+from+48-hour+cold-preserved+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas.</a> Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+distension+and+warm+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation.</a> Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
<li>Corbin, K. L., Hughes, J. W., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment revisited.</a> Biol Proced Online. 23, 10(2021).</li>
<li>de Haan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+isolation+of+functional+pancreatic+rat+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets.</a> Pancreas. 29 (1), e15-e22 (2004).</li>
<li>Kenyon, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+function+of+intrahepatic+islet+allografts+in+baboons+treated+with+humanized+anti-CD154%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154.</a> Diabetes. 48 (7), 1473-1481 (1999).</li>
<li>Kenyon, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+function+of+intrahepatic+islet+allografts+in+rhesus+monkeys+treated+with+humanized+anti-CD154%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).</li>
<li>Liberase T-Flex Research Grade - Method Sheet. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22eLabDoc%22">eLabDoc</a>. , Roche Diagnostics GmbH. (2025).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+towards+tailored+donor+tissue-specific+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strategy towards tailored donor tissue-specific pancreatic islet isolation.</a> PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).</li>
<li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+matrix+proteins+within+the+pancreatic+islet+basement+membrane+are+differentially+digested+during+human+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Key matrix proteins within the pancreatic islet basement membrane are differentially digested during human islet isolation.</a> Am J Transplant. 17 (2), 451-461 (2017).</li>
<li>O'Gorman, D., Kin, T., Pawlick, R., Imes, S., Senior, P. A., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+islet+isolation+outcomes+with+a+highly+purified+neutral+protease+for+pancreas+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation.</a> Islets. 5 (3), 111-115 (2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjustment+of+digestion+enzyme+composition+improves+islet+isolation+outcome+from+marginal+grade+human+donor+pancreata%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata.</a> Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).</li>
<li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics%3A+comparison+study+with+Ficoll%2C+iodixanol+and+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3 (4), 144-149 (2011).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37 (4), 413-420 (1988).</li>
<li>BenchChem Technical Support Team. An in-depth technical guide to cell separation using iodixanol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BenchChem%22">BenchChem</a>. , (2026).</li>
<li>Dellê, H., Saito, M. H., Yoshimoto, P. M., Noronha, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+iodixanol+for+the+purification+of+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">The use of iodixanol for the purification of rat pancreatic islets.</a> Transplant Proc. 39 (2), 467-469 (2007).</li>
<li>Noguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol-controlled+density+gradient+during+islet+purification+improves+recovery+rate+in+human+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Iodixanol-controlled density gradient during islet purification improves recovery rate in human islet isolation.</a> Transplantation. 87 (11), 1629-1635 (2009).</li>
<li>Min, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superiority+of+Visipaque+%28iodixanol%29-controlled+density+gradient+over+Ficoll-400+in+adult+porcine+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Superiority of Visipaque (iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification.</a> Transplant Proc. 42 (5), 1825-1829 (2010).</li>
<li>Paez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neovascularized+implantable+cell+homing+encapsulation+platform+with+tunable+local+immunosuppressant+delivery+for+allogeneic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation.</a> Biomaterials. 257, 120232(2020).</li>
<li>Paez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+niche+with+local+immunosuppression+for+islet+allotransplantation+achieves+type+1+diabetes+reversal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats.</a> Nat Commun. 13, 7951(2022).</li>
<li>Piemonti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Endotext%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation.</a> Endotext. , (2022).</li>
<li>Patel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+foundation+for+engineering+a+pancreatic+islet+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The foundation for engineering a pancreatic islet niche.</a> Front Endocrinol. 13, 881525(2022).</li>
</ol>

A.G. jest współzałożycielem i głównym doradcą naukowym firmy Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. oraz C.Y.X.C. są wynalazcami własności intelektualnej licencjonowanymi przez continuity Biosciences, LLC. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Protokół ten określa wysokoprzepustowe podejście do izolacji i oczyszczania wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa. Sukces metody zależy od kilku kluczowych kroków, które wspólnie zachowują integralność i funkcjonalność wysepek. Wśród nich są precyzyjne i pełne śródprzewodowe perfuzja trzustki, staranne oczyszczenie przetrawionej trzustki oraz dokładny czas trawienia enzymatycznego. Stała perfuzja całych narządów jest kluczowa dla osiągnięcia równomiernej rozciągniętej trzustki i równomiernego rozmieszczenia mieszanki kolagenazy, termolizyny i DNazy, która odpowiednio trawi macierz zewnątrzkomórkową, zwiększa penetrację enzymów i zmniejsza lepkość pośredniczoną przez DNA21,22. Niedoskonałość może prowadzić do niepełnego trawienia tkanek i utraty znacznej części wysp, ponieważ niedostrawiona tkanka jest filtrowana przez sito. Podobnie, niewystarczające usuwanie tkanki tłuszczowej lub naczyniowej przed trawieniem może wprowadzić niedokrewne zanieczyszczenia obniżające czystość. Wreszcie, przedłużone trawienie prowadzi do desegregacji wysepek z powodu nadmiernego uszkodzenia macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas gdy nieoptymalne trawienie prowadzi do niestrawionej tkanki odpornej na mechaniczne trawienie za pomocą igły rdzeniowej. Te kroki stanowią najczęstsze pułapki techniczne i powinny być uważnie monitorowane podczas szkoleń i optymalizacji.
Chociaż metoda ta została zaprojektowana specjalnie dla szczurów Lewisa, prawdopodobnie można ją dostosować do innych szczepów lub gatunków poprzez drobną reoptymalizację czasu trawienia i stosunku enzymów 23,24,25,26. Niektóre laboratoria mogą zdecydować się na korektę proporcji kolagenazy, termolizyny i DNazy I w ośrodku dysocjacji roboczej (WDM), aby zoptymalizować wydajność dla specyficznych cech partii enzymów lub tkanek. Aby to zrobić, laboratoria mogą dokładnie stosować krok po kroku przewodnik producenta dotyczący optymalizacji enzymów i tkanek, a w każdym przypadku unikać dodawania składników takich jak 0,1 M EDTA, cysteina, merkaptoetanol, inhibitory proteazy, surowica lub albumina, ponieważ mogą one hamować kolagenazę, termolizynę oraz aktywność enzymu DNazy 127. Chociaż nie opublikowano jednoznacznego czasu pracy mieszaniny enzymów przed dysocjacją, wcześniejsze dane pokazują, że długotrwałe chłodne zachowanie trzustki negatywnie wpływa na wydajność i funkcjonowanie wysepek28. Empirycznie stwierdziliśmy, że w naszym protokole udane izolacje były konsekwentnie osiągane, gdy całkowity czas zimnej niedokrwienia, definiowany jako odstęp między umieszczeniem pierwszej trzustki w lodzie do czyszczenia a przeniesieniem jej do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, był utrzymywany poniżej 1,5 godziny. Dalsza optymalizacja tego parametru może być uzasadniona w zależności od zastosowania użytkownika końcowego.
Pomimo swojej odporności, protokół ten ma kilka praktycznych i technicznych ograniczeń. Po pierwsze, mieszanka enzymów (kolagenaza, termolizyna i DNaza I) oraz gradienty gęstości są niezbędne do efektywnej dysocjacji tkanek i izolacji wysepek, a jednocześnie wiążą się ze znacznymi kosztami. Nasz wybór kombinacji enzymów był podyktowany cechami strukturalnymi macierzy zewnątrzkomórkowej trzustki oraz potrzebą zrównoważenia skutecznej dysocjacji tkanek z zachowaniem integralności wysepek. Każdy składnik enzymatyczny pełni inną rolę: kolagenaza celuje w kolageny włókniste i błony podstawnej, aby uwalniać wysepki; termolizyna, neutralna proteaza, rozszczepia białka macierzy niekolagenowe oraz cząsteczki adhezji komórek, zmniejszając wymaganą ekspozycję na kolagenazę; oraz DNaza I minimalizuje lepkość wywołaną przez DNA uwalniane z komórek lizowanych 29,30,31. Chociaż tańsze formuły enzymów trawiennych są dostępne komercyjnie, ich czystość jest zmienna i może wpłynąć na wydajność enzymatyczną13,23. Ponieważ kolagenaza jest izolowana z hodowli bakteryjnych, dodatkowe kroki oczyszczania zmniejszają zanieczyszczenie endotoksynami, ale znacznie zwiększają koszt13,23.
Dla kolagenazy zalecamy preparaty o aktywności około 2 000 do 4 000 jednostek Wünscha na butelkę, co wspiera efektywną dysocjację przy umiarkowanym dawkowaniu i zapobiega długotrwałemu trawieniu. Warto zauważyć, że mieszanka powinna zawierać zrównoważony stosunek kolagenazy klasy I do klasy II, odpowiadający frakcji kolagenazy II do całkowitej ilości kolagenazy na poziomie około 0,3-0,5. Ten stosunek zapewnia silną aktywność kolagenolityczną, jednocześnie ograniczając nadmierną degradację niekolagenowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, mieszanina kolagenaz powinna być uzupełniona umiarkowanym poziomem aktywności neutralnej proteazy (około 150 000-250 000 jednostek) oraz DNazą, z powodów już wspomnianych.
Z punktu widzenia kontroli jakości każda partia powinna zawierać dokumentację niskiego obciążenia endotoksynami (≤50 EU/mg białka), wysokiej czystości enzymów (≥85% według HPLC) oraz potwierdzonej aktywności między partiami, ponieważ czystość i skład enzymów mogą się znacznie różnić w zależności od producenta. Wreszcie, różnice w składzie lotu mogą wpływać na spójność trawienia i plon wysepek, co wymaga wykonania wewnętrznej weryfikacji specyficznej dla partii. Taką walidację można osiągnąć poprzez stosowanie standaryzowanych warunków trawienia opisanych w tym protokole, a następnie ocenę wydajności trawienia i morfologii wysepek. Wskaźniki nieoptymalnej wydajności enzymu to niepełna dysocjacja tkanek, wysepki o nieregularnych lub chropowatych brzegach lub konieczność nadmiernego ścinania mechanicznego do uzyskania separacji, w takim przypadku może być konieczne miareczkowanie czasu trawienia.
Podobne rozważania dotyczą gradientów gęstości. Wybraliśmy gradient na bazie polisachozy, niejonowy, wysoce hydrofilowy kopolimer sacharozowo-epichlorohydryny, który tworzy stabilne gradienty do 1,2 g/mL i ma długą historię izolacji wysepek32,33. Jodiksanol jest dobrze zweryfikowaną alternatywą, a badania na ludzkich wysepkach pokazują, że gradienty oparte na jodiksanolu mogą poprawić ich regenerację przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i funkcjonowania 34,35,36,37. Jednak dane dotyczące gryzoni są niejednoznaczne; niektóre badania wykazały lepsze wyniki przy użyciu joduksanlu, a inne wykazały lepszą żywotność i funkcjonowanie przy gradientach polisachorozowych32,35. Co istotne, zaleca się stosowanie komercyjnie produkowanych, kontrolowanych jakościowo rozwiązań gradientowych, aby zwiększyć powtarzalność w różnych laboratoriach. Gradienty oparte na polisacharozie są powszechnie dostępne przy optymalnych gęstościach do izolacji wysepek, podczas gdy gradienty jodiksanolu są zazwyczaj przygotowywane przez rozcieńczenie wewnętrzne, co wprowadza dodatkową zmienność. Drugim ograniczeniem jest to, że pobieranie chirurgiczne wymaga wysokiego poziomu biegłości technicznej, szczególnie przy perfuzji wewnątrzprzewodowej przez zwieracz Oddiego oraz szybkim wycięciu trzustki. Nawet niewielkie opóźnienia lub nieułożenie mogą prowadzić do uszkodzenia tkanek, wycieku, nierównomiernego przelewu lub przedłużającej się gorącej niedokrwienia, co może obniżyć wydajność i żywotność wysepek. Aby złagodzić to ograniczenie, protokół zawiera szczegółowe opisy proceduralne oraz oryginalne materiały graficzne z kolorowymi punktami orientacyjnymi w sposób anatomiczny, ułatwiający zrozumienie. Nowym operatorom zaleca się oswojenie się z techniką perfuzji przed przeprowadzeniem pełnej izolacji, a przed podjęciem się żywych poborów zaleca się ćwiczenie na tusach.
Po trzecie, dla maksymalnej efektywności protokół ten wymaga skoordynowanej pracy zespołowej. Podczas pobierania trzustki i trawienia enzymatycznego zazwyczaj potrzebnych jest trzech przeszkolonych operatorów: jeden wykonuje sterylne operacje, jeden oczyszcza trzustkę w warunkach sterylnych oraz jeden krąży i usypia zwierzęta w warunkach niesterylnych. Po strawieniu kolejne etapy oczyszczania mogą być zazwyczaj wykonywane przez mniej operatorów po osiągnięciu biegłości. Chociaż ta koordynacja stanowi początkowe wymagania logistyczne, umożliwia izolację wielu wysepek od wielu zwierząt w stosunkowo krótkim czasie, poprawiając ogólną przepustowość w porównaniu do mniej skoordynowanych przepływów. Chociaż protokół ten jest technicznie wymagający i zasobochłonny, te ograniczenia są wspólne dla wszystkich metod izolacji wysepek. Poprzez nacisk na standaryzowane warunki trawienia, ustrukturyzowane szkolenia i skoordynowane wykonanie, to wysokoprzepustowe podejście może skrócić czas i pracę na izolację oraz przynieść spójne, powtarzalne rezultaty, gdy jest wykonywane przez wykwalifikowany zespół.
W porównaniu z konwencjonalnymi protokołami izolacji wysepek gryzoni, ta metoda oferuje znaczące korzyści w zakresie przepustowości, powtarzalności i spójności. Tradycyjne trawienie pojedynczym narządem w dużej mierze opiera się na ręcznym pickingu i często daje zmienną czystość13. Dla porównania, nasz protokół wykorzystuje trawienie połączone i oczyszczanie gradientów gęstości, co znacznie skraca czas przygotowania i zmienność między próbkami, jednocześnie zachowując wysoką żywotność wysetek i funkcjonalną responsywność. Wyizolowane wysepki zostały kompleksowo scharakteryzowane pod kątem morfologii (barwienie dithizone), żywotności (test żywy/martwy) oraz funkcji (wydzielanie insuliny stymulowane glukozą), co potwierdza odporność metody. Łącznie ten ustandaryzowany przepływ pracy umożliwia generowanie obfitych, czystych i funkcjonalnych preparatów wysepek odpowiednich do zastosowań w dalszej fazie, w tym do enkapsulacji, przeszczepów oraz modelowania mikrofizjologicznego 38,39,40. Co istotne, wysepki szczurów Lewisa wyizolowane tą techniką odwróciły cukrzycę w modelach przedklinicznych, co podkreśla translacyjną istotność tego powtarzalnego i skalowalnego podejścia41.

Przeszczep wysepek trzustkowych stanowi realną strategię przywrócenia endogennej produkcji insuliny u osób z cukrzycą typu 1 (T1D)1. Poza T1D, biologia wysepek jest coraz bardziej istotna dla cukrzycy typu 2 (T2D), schorzenia charakteryzującego się postępującą dysfunkcją i utratą β-komórek, a także dla pacjentów poddawanych częściowej lub całkowitej pankreatektomii z powodu przewlekłego zapalenia trzustki, guzów trzustki lub urazów urazowych. W tych kontekstach dostęp do wysokiej jakości wysepek jest niezbędny dla rozwoju terapii komórkowych, modelowania niewydolności β komórek, badania interakcji immunnych między wyspami a stromalami oraz opracowywania nowych metod regeneracyjnych2. W związku z tym solidne i powtarzalne procedury izolacji wysepek są kluczowe dla wspierania zarówno badań mechanistycznych, jak i rozwoju translacyjnego w szerokim zakresie zaburzeń endokrynologicznych trzustki.
Chociaż wysepki stanowią mniej niż 2% masy trzustki, odgrywają one nieproporcjonalnie istotną rolę w homeostazie glukozy. Ich wrodzona podatność na hipoksję, nadmierne trawienie enzymatyczne, stres oksydacyjny i ścinanie mechaniczne czyni je szczególnie wrażliwymi na urazy związane z izolacją 3,4,5. Nawet subtelne odchylenia w temperaturze, natlenieniu czy obsłudze tkanek mogą utrudnić sprzężenie bodziec-wydzielina β komórek lub wywołać apoptozę, ze względu na ograniczone mechanizmy obronne antyoksydacyjne i wysokie zapotrzebowanie metaboliczne 6,7. W związku z tym większość konwencjonalnych protokołów kładzie nacisk na szybkie użycie w dalszej fazie pobierania, zazwyczaj w ciągu 24-48 godzin od pobrania, zarówno w warunkach klinicznych, jak i eksperymentalnych 8,9,10,11,12. Chociaż ten model "natychmiastowego użycia" minimalizuje pogorszenie jakości, ogranicza elastyczność eksperymentalną, utrudnia badania podłużne i komplikuje wysiłki mające na celu zgromadzenie wystarczającej liczby wysepek do dużych testów in vitro lub eksperymentów in vivo transplantacji.
Wśród modeli gryzoni szczury Lewisa są szeroko wykorzystywane do badań nad wysepkami ze względu na ich genetyczne tło sprzyrodcze, stabilny profil odpornościowy oraz powtarzalne cechy fizjologiczne14. Różnice zależne od odkształcenia w wydajności, responsywności i odporności wysepek są dobrze udokumentowane. De Groot i in. wykazali, że wystraski szczurów Lewisa wykazują lepszą wydzielanie insuliny pobudzanej glukozą w porównaniu z innymi szczepami, podkreślając ich przydatność do badań funkcjonalnych, metabolicznych i transplantacyjnych15. Dodatkowe badania potwierdziły ich wiarygodność w badaniach immunologicznych i allo-/ksenotransplantacyjnych 14,15,16. Jednak w różnych laboratoriach zmienność wydajności, czystości i funkcji wysepek pozostaje istotną barierą. Duża część tej zmienności wynika z niespójności w mieszance enzymów, technikach perfuzji wewnątrzwodowej, obsłudze trzustki, czasie trawienia oraz strategii oczyszczania17.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy powtarzalny, krok po kroku protokół pobierania chirurgicznego, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych z szczurów Lewisa w gradiencie gęstości. Ten workflow jest zoptymalizowany, aby maksymalizować plonę, zminimalizować fragmentację i zachować funkcjonalną opłacalność. Co ważne, ustanawia jasne punkty odniesienia, w tym odpowiedniki wysepek (IEQ), żywotność w czasie, czystość oraz wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, które pozwalają badaczom niezawodnie rozróżnić udane od nieoptymalnych izolacji 18,19,20. Poprzez poprawę zarówno wydajności, jak i długości życia, protokół zwiększa elastyczność eksperymentów i może zmniejszyć liczbę potrzebnych zwierząt dawców, wspierając bardziej etyczne i skalowalne projektowanie eksperymentów.
W odróżnieniu od wielu tradycyjnych metod, obecna metoda pokazuje, że wysepki szczurów Lewisa można utrzymywać w hodowli do 7 dni przy zachowaniu żywotności i funkcji, co zwiększa ich zastosowanie w długotrwałych badaniach in vitro . Protokół dodatkowo zawiera uproszczeniową, połączoną strategię przetwarzania zdolną do obsługi do 30 trzustek w jednej partii, umożliwiając równomierne trawienie i redukcję zmienności między próbkami. Przy czystości endokrynnej sięgającej 98%, procedura eliminuje potrzebę ręcznego zbierania i zmniejsza ryzyko skażenia mikroorganizmów. W porównaniu z metodami trawienia jednoetapowego lub masowego, które często prowadzą do powstania nieczystych lub mechanicznie uszkodzonych preparatów13, ten wysokoprzepustowy przepływ niezawodnie zapewnia dużą liczbę czystych, przeszczepowych wysetek odpowiednich do testów in vitro , profilowania metabolicznego oraz badań in vivo .

<table><tbody><tr><td>21 G x 2 cale. BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>500 & mikro; m Mosiężna rama i 304 sito ze stali nierdzewnej, średnica 3" x głębokość 1" (sito numer 35)</td><td>McMaster-Carr</td><td>34735K525</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Sterile Strzykawki, zamek Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-178</td><td></td></tr><tr><td>Biogel PI UltraTouch M</td><td>M&ouml; Inlycke</td><td>42665</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki bonn; Prosto; ostre punkty; Długość łopaty 15 mm; Całkowita długość 3 1/2"</td><td>Roboz</td><td>RS-5840</td><td></td></tr><tr><td>Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9956482</td><td></td></tr><tr><td>Seria Cell-IQ 5,8 stóp sześciennych Inkubator Laboratoryjny CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm Not TC-treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydła płodowego Corninga, 500 mL, zwykłe, testowane przez USDA (inaktywowane termicznie)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Gradient wysepek Corning 1,069 (gęstość 1,069 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-815-CIS</td><td>Wymaga specjalnej prośby od firmy</td></tr><tr><td>Gradient wysepki Corning 1,096 (gęstość 1,096 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-691-CIS</td><td>Wymaga specjalnej prośby od firmy</td></tr><tr><td>Gradient wysepki Corning 1,108 (gęstość 1,108 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-692-CIS</td><td>Wymaga specjalnej prośby od firmy</td></tr><tr><td>Podkładki Covidien Tendersorb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-225-102</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I Grade II</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Stożkowe rurki wirówkowe o wysokiej klarowności 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa Fisherbrand, rolka o standardowym rozstawie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Gąbki z gazy nietkanej</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-559</td><td></td></tr><tr><td>Szkło wielorazowego użytku, ciężkie zlewki Fisherbrand o niskim kształcie</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101600</td><td></td></tr><tr><td>Mikromikroskop fluorescencyjny&nbsp; BZ-X810</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glukozy</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikroigły Halsey</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, wapń, magnez, bez fenolu czerwonego</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatyczne kleszcze Classic Crile długość 5,5 cala</td><td>McKesson</td><td>1231217</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Hudsona (Ewald)</td><td>Roboz</td><td>RS-5238</td><td></td></tr><tr><td>Igła hipodermiczna, monojektowa o długości 1-1/2 cala, 16 gauge, zwykła ściana bez zabezpieczenia</td><td>McKesson</td><td>43481</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liberase T-Flex, Stopień Badawczy</td><td>Roche</td><td>5989132001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw żywotności żywych/martwych / cytotoksyczności, dla komórek ssaków</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; L3224</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania MATLAB</td><td>MathWorks</td><td><a href="https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML">https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML</a></td><td></td></tr><tr><td>NE-4000 Dwukanałowa programowalna pompa strzykawkowa</td><td>Pompa strzykawkowa</td><td>NE-4000-US</td><td></td></tr><tr><td>IGŁA, HIPOSTR DYSPONACJA 27GX1/2" (100/BX) EXLINT</td><td>McKesson</td><td>408877</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórek/szalki Petriego</td><td>Termonaukowe</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CKX41 Mikroskop Kontrastu Fazowego Odwróconego</td><td>Olympus</td><td>CKX41-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, bez glukozy</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan sodu (100 mM zapasu)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST 16R</td><td>Termonaukowe</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki ze stali nierdzewnej 304</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z117013-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CHIRURGICZNA ZASŁONA, JEDNORAZOWA, 36 In X 100 JARDÓW</td><td>Covetrus</td><td>10408</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - ToughCut</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do opatrunku na kciuk 4,5" ząbkowate, delikatne końcówki 1,3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Termo Scientific Nunc 200mL Rurka Wirówki</td><td>Termonaukowe</td><td>14-962-17</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery i poduszki do butelek do wirówek Thermo Scientific Nunc</td><td>Termonaukowe</td><td>12-565-283B</td><td></td></tr><tr><td>TSDUB15 15L Dubnoff do wstrząsającej kąpieli wodnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>300610298</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 4 x 400 mL Obrotowy wirnik kubełowy</td><td>Termonaukowe</td><td>75003181</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL</td><td>Tygon</td><td>AAXoooo3</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA</td><td>Chemia krystaliczna</td><td>90060</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Pancreatic Islet Isolation and Purification from Lewis Rats Using Enzymatic Digestion and Density-Gradient Separation

Wysepki trzustkowe są niezbędne zarówno do klinicznego przeszczepiania wysepek, jak i badań przedklinicznych mających na celu zrozumienie mechanizmów i postępu cukrzycy. Jednak postęp w tych dziedzinach często ogranicza dostępność wysokiej jakości wysepek, ponieważ nowe strategie terapeutyczne wymagają większych, czystszych i bardziej ustandaryzowanych preparatów. W tym artykule przedstawiono wysokoprzepustowy, ustandaryzowany protokół dotyczący pobierania chirurgicznego, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysewek trzustkowych z poziomu gęstości szczurów Lewisa. Metoda łączy perfuzję trzustki wewnątrzprzewoźowej z określoną mieszanką enzymów, wspólnym trawieniem wielu trzustek oraz separacją opartą na gęstości, aby zmaksymalizować wydajność przy jednoczesnym minimalizowaniu fragmentacji i eliminacji konieczności rutynowego pobierania ręcznego. Wydajność wysepek jest ilościowa za pomocą dwóch komplementarnych podejść: tradycyjnej metody liczenia opartej na aliquotach, powszechnie stosowanej w warunkach klinicznych, oraz półautomatycznej metody obrazowania opartej na całkowitym przygotowaniu. W reprezentatywnej izolacji z 12 trzustek ręczne liczenie dało około 3 300 ekwiwalentów wysepek (IEQ) oraz 2 700 wysepek absolutnych na trzustkę (~39 600 łącznie IEQ), z rozkładem wielkości 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) oraz 6% (>250 μm). Dla porównania, analiza automatyzacji całego przygotowania wykazała 16 350 łącznych IEQ (1 362 IEQ/trzustka), co podkreśla wrodzoną zmienność w ilościowości opartej na aliquotach. Preparaty miały czystość 98% dzięki barwieniu dithizonowym, a żywotność wysepek utrzymywano na poziomie 98% in vitro w dniach 3 i 7 po izolacji. Funkcjonalna ocena za pomocą statycznej wydzieliny insuliny stymulowanej glukozą wykazała 10-krotny wzrost uwalniania insuliny po 1-godzinnej stymulacji z 16,7 mM glukozy. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia powtarzalne i efektywne podejście do generowania preparatów wysepek o wysokiej czystości, funkcjonalnie nienaruszonych, które można użyć natychmiast bez konieczności dalszego czyszczenia. Wysepki zachowują solidną funkcję w hodowli do siedmiu dni, co umożliwia elastyczność przy dużych testach in vitro oraz przeszczepach in vivo .

Poniższe wyniki reprezentują typową izolację wysepek wykonaną opisaną metodą, z dwunastoma trzustkami szczura Lewisa przetwarzanymi równolegle.
Wydajność i rozkład wielkości
Ręczne liczenie aliquotów i konwersja IEQ
Z mieszanej zawiesiny wysepek uzyskano dwa niezależne aliquoty o pojemności 100 μL, jak opisano w sekcji "Liczenie wysepek", krok 6.1, i liczone według pojemników o średnicy (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Liczenia zostały przeliczone na odpowiedniki wysepek (IEQ; odniesienie 150 μm) za pomocą standardowych tabel równoważności i ekstrapolowane do całkowitej objętości zawieszenia (patrz Rysunek 4A). W całej izolacji testowej (n = 12) wydajność wynosiła 3330 IEQ na trzustkę z medianą średnicy wysepek w pojemniku 50-100 μm. Powtórzenie alikwotów uzgodniło się z 18,8% na pojemnik (współczynnik zmienności), co wskazuje na umiarkowaną zmienność, ale oczekiwaną przy użyciu ręcznych metod liczenia. W ciągu poprzednich 14 izolacji wysepek metoda ta dała średnio 1353 (SD 607) IEQ na trzustkę.
Automatyczna ilościfikacja całej płyty
Aby sprawdzić ręczne IEQ, zdjęcia w jasnym polu były wykonywane w D1 za pomocą mikroskopu i zszywane, aby uzyskać kompozyty całokomórkowe (4× obiektywu; ekspozycja 1/100 s). Automatyczne rozmiarowanie i kwantyfikacja obiektów wykonywano przy użyciu Fiji i kodowania z predefiniowanym progiem rozmiaru 50-600 μm. Obrazy były najpierw wstępnie przetwarzane, aby zmniejszyć zmienność tła i poprawić jednolitość kontrastu. Struktury wysepek zostały zidentyfikowane na podstawie różnic intensywności względem otaczających tkanek, co generowało maski obiektów binarnych. Przylegające lub częściowo stykające się wysepki zostały oddzielone, aby uniknąć niedoszacowania liczby obiektów. Obiekty spoza określonego zakresu rozmiarów zostały wykluczone w celu usunięcia zanieczyszczeń i tkanki niebędącej wyspami. Dla każdego zachowanego obiektu wyodrębniano parametry morfometryczne, w tym powierzchnię oraz średnice osi x i y. Wysepki były następnie segregowane według średnicy, a IEQ obliczano przez mnożenie liczby wysepek w każdym pojemniku przez odpowiadający im współczynnik konwersji. Automatyczne rozmiarowanie dało łącznie 98 832 obiekty, o średnich średnicach osi x i y odpowiednio 117 μm i 116 μm, oraz szacunkowo 16 350 IEQ, co silnie koreluje z ręcznym IEQ mierzonym na D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; patrz rysunek 4A-C).
Zrzucanie komórek wysepek
Obrazy całej płyty zostały wykonane 2 godziny po oczyszczeniu i ponownie w dniu 1 (D1), stosując tę samą metodologię w "Automatycznej kwantyfikacji całej płyty" do oceny wczesnej stabilizacji wysepek ("zrzucania"). Liczba obiektów zmieniła się o 0,9%, a IEQ o -6,11% z 2 h do D1 (patrz Rysunek 4D). Porównanie średnic wysepek między D0 a D1 wykazało statystycznie istotny spadek mediany o 2 μm (test rangi znakowej Wilcoxona, p = 0,0136, n = 2820). Jednak niewielka skala tej zmiany raczej nie będzie miała znaczenia biologicznego ani klinicznego.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig4.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Ilościowa ocena rozkładu wielkości wysepek, korelacji i wczesnego wypadania wysepek. Graficzne podsumowanie pomiarów wysepek uzyskanych za pomocą analiz ręcznych i automatycznych. (A) Rozkład wielkości wysepek dzień 0 (D0) oparty na ręcznej ilościowości na ustandaryzowanych pojemnikach wielkości wysepek równoważnych IEQ. (B) Rozkład wielkości wysepek w dniu 1 (D1) określony przez zautomatyzowane pomiary obrazowe w tych samych standaryzowanych pojemnikach rozmiarów IEQ. (C) Korelacja liczebności między ręczną ilością D0 a automatyczną ilościową D1 w pojemnikach wielkości IEQ. (D) Wykres pudełkowy rozkładu średnic wysepek między D0 a D1 do automatycznych pomiarów tej samej płyty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Czystość (zawartość endokrynna vs. egzokryna)
Barwienie Dithizone (DTZ)
Na D1 aliquot wysepek (n = 451) był barwiony DTZ przez 30 sekund w temperaturze pokojowej i natychmiast obrazowany za pomocą mikroskopii jasnego pola (4× obiektywnie; ekspozycja 1/20 s). Na Fidżi piksele tła zostały usunięte tak, aby pozostały obszar pikseli odpowiadał całkowitej powierzchni wysepek. DTZ-ujemne obszary tkanki egzokrynologicznej, rozpoznawane przez ciemniejszy kontrast kolorów, były ręcznie wybierane za pomocą narzędzia lasso, a obszar każdego interesującego obszaru był automatycznie rejestrowany w pikselach. Czystość endokrynologiczna została obliczona jako procent pikseli DTZ-dodatnich względem całkowitej liczby pikseli wysepek, co daje czystość 98,56 ± 0,38% (Rysunek 5A).
Opłacalność i wydajność funkcjonalna
Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą (GSIS)
W każdym punkcie czasowym (D1, D3, D7) ręcznie wybierano 15 wysew o dopasowanym rozmiarze, które umieszczano w pojedynczych dołkach z płytą 24-dołową, przygotowanymi w formie czterokrotnej. Wysepki były inkubowane w temperaturze 37 °C 5%CO2 w buforze Krebsa według protokołu niskiej-wysokiej i niskiej glukozy: najpierw przy niskiej glukozie (2,8 mM, 60 min), następnie przy wysokiej glukozie (16,7 mM, 60 min, patrz Tabela 1). Frakcje ścieków pobierano na koniec każdego okresu inkubacji, a stężenia insuliny określano za pomocą testu ELISA insuliny u szczurów. Indeksy stymulacji obliczono jako stosunek wydzielania insuliny podczas warunków wysokiego do niskiego poziomu glukozy. Indeksy stymulacji wynosiły 9,37, 8,34 i 6,7 odpowiednio w dniach 1, 3 i 7, bez istotnych różnic (Rysunek 5B).
Barwienie żywe/martwe
W D1, D3 i D7 15 wysepków zostało ręcznie wybranych i barwionych zestawem Live/Dead zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko wysepki były inkubowane w roztworze barwienia Live/Dead przez 30 minut w temperaturze 25 °C, a następnie obrazowane pod stałymi ustawieniami mikroskopu, aby zapewnić porównywalność w punktach czasowych (obiektyw 4X; ekspozycja 1/30 s, filtry Texas Red i GFP). Żywotność była ilościowo określana za pomocą skryptu Pythona wykorzystującego obraz scikit do segmentacji wysepek i pomiaru fluorescencji. Wysepki zidentyfikowano przez połączenie zielonego i czerwonego kanału fluorescencji, zastosowanie metody progowania Li do wygenerowania maski binarnej oraz segmentację zlewni do oddzielenia stykających się wysepek. Obiekty były filtrowane według powierzchni, aby wykluczyć szczątki i artefakty. Dla każdej wysepki obliczano żywotność jako procent żywej zintegrowanej gęstości (zielone piksele) w stosunku do całkowitej gęstości zintegrowanej (zielone plus czerwone piksele). Wyniki wykazały żywotność 68 ± 9% przy D1, 98,2 ± 0,6% przy D3 oraz 100% przy D7. Próbka kontrolna z dodatnim wynikiem poddana 70% etanolu przez 10 minut wykazała żywotność 2,7 ± 7,2% (patrz Rysunek 5C-F).
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig5.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5: Ocena czystości wysepek, żywotności i funkcjonalnej responsywności. Reprezentatywne obrazy i ilościowe podsumowania charakterystyk izolowanych wysepek w czasie. (A) Reprezentatywne zdjęcie 10× jasnego pola wysepek zabarwionych dithizonem (DTZ), pokazujące czerwone wysepki dokrewne i nieprzebarwione tkanki egzokryniczne. (B) Wartości wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) z indeksem stymulacji wysokiego poziomu glukozy/niskiego poziomu glukozy (HG/LG) dla dni 1, 3 i 7. (C-E) Obrazy na żywo/martwe z fluorescencją wysepek w Dniu 1 (C), Dniu 3 (D) i Dniu 7 (E). (F) Obraz na żywo/martwe fluorescencyjne wysew o dodatniej kontroli poddawanej etanolowi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(A) Medie do prania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>Ilość (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum bydlęce płodowe</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angina mięciowa (10 000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>12,5 mL z 1M magazynów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>5 mL z magazynu 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(b) Media kultury wysepek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>Ilość (mL lub g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, brak glukozy</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum bydlęce płodowe</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angina mięciowa (10 000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>11 mL z 1M zapasów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirowęglan sodu</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5,5 mL z 100 mM magazynu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>5,5 mM</td>
			<td>2,75 mL z akwarium 200 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(c) Roztwór płukania penicylinowo-streptomycynowej</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>Ilość (mL lub g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór soli fizjologicznej, 0,9%</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylinowa streptomycyna (10 000 U/mL)</td>
			<td>2%</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(D) Bufor chłodzący</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>Ilość (mL lub g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum bydlęce płodowe</td>
			<td>20%</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E) Krebs Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Ostateczna koncentracja</td>
			<td>Ilość (mL lub g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>975 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>115 mM</td>
			<td>6,72 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>24 mM</td>
			<td>2,02 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,3728 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,0952 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,2775 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista rozwiązań. Szczegóły składu i przygotowania wszystkich roztworów stosowanych w całym protokole izolacji i oczyszczania wysepek. Każda podsekcja zawiera składniki, końcowe stężenia, wolumeny przygotowawcze oraz numery katalogowe. (A) Medium do mycia używanego do płukania i mycia tkanek podczas trawienia i oczyszczania. (B) Medium do hodowli wysepek, wykorzystywane do utrzymania i żywotności wysepek po izolacji. (C)Roztwór płukania penicylina i streptomycyny, używany do sterylizacji i płukania pobranych trzustek. (D) Bufor Hartujący, używany do zakończenia trawienia enzymatycznego i zachowania żywotności komórek. (E) Bufor Krebsa, stosowany podczas testów wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS).
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liczba trzustek</td>
			<td>Kolagenaza (15,38 mg/mL)</td>
			<td>Termolizyna (1 mg/mL)</td>
			<td>DNAse (100 mg/mL)</td>
			<td>Bufor roboczy</td>
			<td>Zlewki 600 mL do użycia</td>
			<td>Wolum/Zlewka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>4,5 mL</td>
			<td>2,25 mL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>450 mL</td>
			<td>5</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>3,6 mL</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>360 μL</td>
			<td>360 mL</td>
			<td>4</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>300 mL</td>
			<td>3</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>2,4 mL</td>
			<td>1,2 mL</td>
			<td>240 μL</td>
			<td>240 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>0,9 mL</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>180 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,75 mL</td>
			<td>150 μL</td>
			<td>150 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ostateczna konc.</td>
			<td>0,15 mg/mL</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Roztwór enzymów trawiennych według ilości trzustki. Objętości kolagenazy, termolizyny i DNazy I wymagane do przygotowania Roboczego Medium Dysocjacyjnego (WDM) dla różnej liczby trzustek szczurów. Końcowe stężenia każdego enzymu są wymienione na dole tabeli.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liczba trzustek</td>
			<td>Numer 50 mL lamp</td>
			<td>Objętość/strzykawka</td>
			<td>Liczba 1,096 strzykawek</td>
			<td>Liczba 1.068 strzykawek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>10 lamp</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>8 lamp</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>6 lamp</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>4 rurki</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>4 rurki</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>2 lampy</td>
			<td>20 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Obciążenie gradientowe według ilości trzustki. Liczba 50 mL stożkowych rurek oraz odpowiadające im objętości gradientu wymagane do oczyszczenia wysepek, w zależności od liczby przetworzonych trzustek.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zakres średnicy wysepek (μm)</td>
			<td>Liczba cząstek wysetek (AI)</td>
			<td>Współczynnik konwersji IEQ</td>
			<td>IEQ na zakres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-100</td>
			<td>a</td>
			<td>* 0.167</td>
			<td>a * 0,167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>b</td>
			<td>* 0.648</td>
			<td>b * 0,648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-200</td>
			<td>c</td>
			<td>* 1.685</td>
			<td>c * 1,685</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201-250</td>
			<td>d</td>
			<td>* 3.500</td>
			<td>d * 3.500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>251-300</td>
			<td>e</td>
			<td>* 6.315</td>
			<td>e * 6.315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-350</td>
			<td>f</td>
			<td>* 10.352</td>
			<td>f * 10,352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 350</td>
			<td>g</td>
			<td>* 15.833</td>
			<td>g * 15,833</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Konwersja równoważności wysepek. Konwersja zakresów średnic wysepek na ustandaryzowane odpowiedniki wysepek (IEQ). Tabela przedstawia obserwowane pojemniki średnicy wysepek, liczbę cząstek wysew na obszar, odpowiadający współczynnik konwersji IEQ dla każdego zakresu rozmiarów oraz wynikający z tego wkład IEQ na obszar.

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Pancreatic islets are essential for both clinical islet transplantation and preclinical studies aimed at understanding the mechanisms and progression of ...

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu ustandaryzowanego protokołu izolacji oczka szczura Lewisa o wysokiej przepustowości, aby zoptymalizować wydajność, czystość, żywotność i długowieczność funkcjonalną. Istniejące metody dają zmienne nieczyste, krótkotrwałe oczka. Protokół ten standaryzuje trawienie, oczyszczanie i łączenie w parze, aby poprawić spójność i długość życia.Na początek poddaj uśpionemu szczurowi mikroskop. Używając nożyczek do skóry, wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od syntezy łonowej w kierunku każdej bocznej klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Za pomocą płaskich kleszczy cofnij jelito cienkie i grube na lewą stronę zwierzęcia, aby oczyścić przestrzeń roboczą jamy brzusznej.Następnie użyj płaskich kleszczy i zakrzywionych hemostatów, aby rozwinąć górną część dwunastnicy. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i żyła wrotna wątroby znajdują się w polu widzenia. Teraz użyj zakrzywionych hemostatów, aby cofnąć wątrobę w kierunku głowogłowego.Zaciskaj wspólny przewód żółciowy i żyłę wątrobową na odległość od jednej do dwóch milimetrów od wątroby. Pod mikroskopem, z płaskimi kleszczami i płaskimi hemostatami, delikatnie mobilizuj zawartość dwunastnicy, aby oczyścić zwieracz audi. Następnie delikatnie zacisnąć dwunastnicę na około pięć milimetrów od każdej strony zwieracza audi, aby odizolować otaczający obszar.Zapewnij minimalne uciskanie, aby zachować integralność tkanki. Ostrożnie włóż igłę strzykawki z jałowym WDM przez ścianę dwunastnicy. Przeprowadź igłę przez ciało zwieracza i przesuwaj ją do głównego przewodu trzustkowego w celu przechwycenia.Utrzymując stałe ciśnienie, perfuzuj od 7 do 10 mililitrów WDM do trzustki z prędkością około 500 mikrolitrów na sekundę, aż trzustka będzie całkowicie rozciągnięta. Teraz usuń oba płaskie hemostaty z dwunastnicy. Następnie delikatnie rozciąć i uwolnić trzustkę od otaczających struktur, zaczynając od śledziony, żołądka, jelita grubego, dwunastnicy i mezentary.Delikatnie podnieś przekroczoną trzustkę płaskimi kleszczemi i użyj drobnych nożyczek do cięcia pozostałych przyczepów tkanki łącznej. Natychmiast przełóż wyciętą trzustkę do szalki Petriego z lodowatym roztworem do płukania i przystąpi do pobierania kolejnej trzustki, podczas gdy wycięta trzustka jest czyszczona. Do oczyszczenia trzustki użyj pary cienko zakrzywionych kleszczy i nożyczek do drobnego cięcia, aby ostrożnie usunąć węzły chłonne, tkankę tłuszczową, mezencjarz oraz duże naczynia z przetłuszczonej trzustki, jeśli są obecne.Przełóż oczyszczoną trzustkę do sterylnej zlewki o pojemności 600 milimetrów zawierającej 25 mililitrów zimnego WDM. Przykryj zlewkę sterylną folią aluminiową, aby zachować czystość podczas transferu z miejsca pracy chirurgicznego do miejsca pracy do hodowli komórek. Przełóż zlewkę do orbitalnej łaźni wodnej ustawionej na 130 obrotów na minutę przez 10 minut.Po pięciu minutach ręcznie kręć zlewką zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie, aby wspomóc dysocjację tkanek. Po 10 minutach szybko przełóż zlewkę i zanurz ją w lodzie, aby spowolnić aktywność enzymów. Następnie dodaj równą objętość buforu hartującego do roztworu w zlewce, aby zatrzymać trawienie.Używając strzykawki 50 milimetrów wyposażonej w igłę rdzeniową o grubości 14 gauge, delikatnie zasysaj i usuwaj zawiesinę tkankową wielokrotnie, aby rozdzielić duże fragmenty tkanki. Przełóż zawieszenie do stożkowych rur o pojemności 200 mililitrów. Po odwirowaniu zawiesiny ostrożnie przelać supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 100 mililitrach mediów do mycia.Następnie przefiltruj zawiesinę przez sterylne sito o średnicy 500 mikrometrów umieszczone nad sterylnym zlewem o pojemności 600 milimetrów, aby usunąć duże, niestrawione tkanki. Przelej filtrat do nowych stożkowych rurek o pojemności 200 mililitrów przed ponownym wirowaniem. Do oczyszczania oczek użyj wcześniej przygotowanej 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesować każdy granulat tkanki w 15 mililitrach roztworu gradientowego na dwa mililitry objętości granulatu.Mieszaj delikatnie, aż zawieszenie stanie się jednolite. Ostrożnie podawaj 15 mililitrów zawiesiny ogniwowej na dno każdej 50-mililitrowej rurki stożkowej, unikając kontaktu ze ścianami rurki, aby zapewnić czyste gradienty. Następnie użyj pompy strzykawkowej, aby podać 10 mililitrów każdego gradientu z prędkością pięciu mililitrów na minutę, ustawiając końcówkę igły 16 gauge przy wewnętrznej ściance rurki, aby zapobiec mieszaniu.Po odwirowaniu rurek zidentyfikuj warstwę oczkową umieszczoną na granicach warstw gradientowych. Używając pipety z przekroczonym cięciem, zbierz warstwę oczka, przenieś je do wcześniej schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 200 mililitrów zawierającej pięć mililitrów mediów do mycia. Zwiększ objętość do 200 mililitrów z medium do mycia i wykonaj następujące kroki mycia oraz wirowania.Następnie równomiernie podkładaj oczka do 100-milimetrowych szalek Petriego, które nie są poddane hodowli tkankowej, używając jednej płytki na każde pięć przetworzonych trzustek. W całej izolacji testowej wydajność wynosiła 3 330 ekwiwalentów oczek na trzustkę z medianą średnicy oczka w pojemniku 50 do 100 mikrometrów. Automatyczne rozmiarowanie dało łącznie 98 832 obiekty, co silnie koreluje z odpowiednikami ręcznych powiek mierzonych w dniu zero.Czystość endokrynna wynosiła około 98,56% na podstawie barwienia dithozone pierwszego dnia. Indeksy stymulacji wynosiły 9,37 pierwszego dnia, 8,34 trzeciego dnia i 6,7 siódmego dnia, bez istotnych różnic między punktami czasowymi. Metoda ta umożliwia badanie przeszczepów oczkowych, funkcji komórek beta, odwrócenia cukrzycy, otoczkowania oczka oraz interakcji immunologicznych lub mikrośrodowiskowych oczków.Protokół ten może być stosowany w przeszczepach przedklinicznych, modelowaniu cukrzycy, badaniach enkapsulacji oraz testach funkcjonalnych in vitro wymagających wysokoczystości oczek Lewis Rat.

pancreatic-islet-isolation-purification-from-lewis-rats-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Naucz się izolować wysepki trzustkowe od szczurów Lewisa metodą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego. Protokół zapewnia wysoką czystość, żywotność i funkcjonalność komórek do badań nad cukrzycą i transplantologią.

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Przeglądaj więcej filmów