Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego
3 kwietnia 2026
Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .
Nasze badania koncentrują się na opracowaniu ustandaryzowanego protokołu izolacji oczka szczura Lewisa o wysokiej przepustowości, aby zoptymalizować wydajność, czystość, żywotność i długowieczność funkcjonalną. Istniejące metody dają zmienne nieczyste, krótkotrwałe oczka. Protokół ten standaryzuje trawienie, oczyszczanie i łączenie w parze, aby poprawić spójność i długość życia.
Na początek poddaj uśpionemu szczurowi mikroskop. Używając nożyczek do skóry, wykonaj nacięcie w kształcie litery V, zaczynając od syntezy łonowej w kierunku każdej bocznej klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Za pomocą płaskich kleszczy cofnij jelito cienkie i grube na lewą stronę zwierzęcia, aby oczyścić przestrzeń roboczą jamy brzusznej.
Następnie użyj płaskich kleszczy i zakrzywionych hemostatów, aby rozwinąć górną część dwunastnicy. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i żyła wrotna wątroby znajdują się w polu widzenia. Teraz użyj zakrzywionych hemostatów, aby cofnąć wątrobę w kierunku głowogłowego.
Zaciskaj wspólny przewód żółciowy i żyłę wątrobową na odległość od jednej do dwóch milimetrów od wątroby. Pod mikroskopem, z płaskimi kleszczami i płaskimi hemostatami, delikatnie mobilizuj zawartość dwunastnicy, aby oczyścić zwieracz audi. Następnie delikatnie zacisnąć dwunastnicę na około pięć milimetrów od każdej strony zwieracza audi, aby odizolować otaczający obszar.
Zapewnij minimalne uciskanie, aby zachować integralność tkanki. Ostrożnie włóż igłę strzykawki z jałowym WDM przez ścianę dwunastnicy. Przeprowadź igłę przez ciało zwieracza i przesuwaj ją do głównego przewodu trzustkowego w celu przechwycenia.
Utrzymując stałe ciśnienie, perfuzuj od 7 do 10 mililitrów WDM do trzustki z prędkością około 500 mikrolitrów na sekundę, aż trzustka będzie całkowicie rozciągnięta. Teraz usuń oba płaskie hemostaty z dwunastnicy. Następnie delikatnie rozciąć i uwolnić trzustkę od otaczających struktur, zaczynając od śledziony, żołądka, jelita grubego, dwunastnicy i mezentary.
Delikatnie podnieś przekroczoną trzustkę płaskimi kleszczemi i użyj drobnych nożyczek do cięcia pozostałych przyczepów tkanki łącznej. Natychmiast przełóż wyciętą trzustkę do szalki Petriego z lodowatym roztworem do płukania i przystąpi do pobierania kolejnej trzustki, podczas gdy wycięta trzustka jest czyszczona. Do oczyszczenia trzustki użyj pary cienko zakrzywionych kleszczy i nożyczek do drobnego cięcia, aby ostrożnie usunąć węzły chłonne, tkankę tłuszczową, mezencjarz oraz duże naczynia z przetłuszczonej trzustki, jeśli są obecne.
Przełóż oczyszczoną trzustkę do sterylnej zlewki o pojemności 600 milimetrów zawierającej 25 mililitrów zimnego WDM. Przykryj zlewkę sterylną folią aluminiową, aby zachować czystość podczas transferu z miejsca pracy chirurgicznego do miejsca pracy do hodowli komórek. Przełóż zlewkę do orbitalnej łaźni wodnej ustawionej na 130 obrotów na minutę przez 10 minut.
Po pięciu minutach ręcznie kręć zlewką zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie, aby wspomóc dysocjację tkanek. Po 10 minutach szybko przełóż zlewkę i zanurz ją w lodzie, aby spowolnić aktywność enzymów. Następnie dodaj równą objętość buforu hartującego do roztworu w zlewce, aby zatrzymać trawienie.
Używając strzykawki 50 milimetrów wyposażonej w igłę rdzeniową o grubości 14 gauge, delikatnie zasysaj i usuwaj zawiesinę tkankową wielokrotnie, aby rozdzielić duże fragmenty tkanki. Przełóż zawieszenie do stożkowych rur o pojemności 200 mililitrów. Po odwirowaniu zawiesiny ostrożnie przelać supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 100 mililitrach mediów do mycia.
Następnie przefiltruj zawiesinę przez sterylne sito o średnicy 500 mikrometrów umieszczone nad sterylnym zlewem o pojemności 600 milimetrów, aby usunąć duże, niestrawione tkanki. Przelej filtrat do nowych stożkowych rurek o pojemności 200 mililitrów przed ponownym wirowaniem. Do oczyszczania oczek użyj wcześniej przygotowanej 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesować każdy granulat tkanki w 15 mililitrach roztworu gradientowego na dwa mililitry objętości granulatu.
Mieszaj delikatnie, aż zawieszenie stanie się jednolite. Ostrożnie podawaj 15 mililitrów zawiesiny ogniwowej na dno każdej 50-mililitrowej rurki stożkowej, unikając kontaktu ze ścianami rurki, aby zapewnić czyste gradienty. Następnie użyj pompy strzykawkowej, aby podać 10 mililitrów każdego gradientu z prędkością pięciu mililitrów na minutę, ustawiając końcówkę igły 16 gauge przy wewnętrznej ściance rurki, aby zapobiec mieszaniu.
Po odwirowaniu rurek zidentyfikuj warstwę oczkową umieszczoną na granicach warstw gradientowych. Używając pipety z przekroczonym cięciem, zbierz warstwę oczka, przenieś je do wcześniej schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 200 mililitrów zawierającej pięć mililitrów mediów do mycia. Zwiększ objętość do 200 mililitrów z medium do mycia i wykonaj następujące kroki mycia oraz wirowania.
Następnie równomiernie podkładaj oczka do 100-milimetrowych szalek Petriego, które nie są poddane hodowli tkankowej, używając jednej płytki na każde pięć przetworzonych trzustek. W całej izolacji testowej wydajność wynosiła 3 330 ekwiwalentów oczek na trzustkę z medianą średnicy oczka w pojemniku 50 do 100 mikrometrów. Automatyczne rozmiarowanie dało łącznie 98 832 obiekty, co silnie koreluje z odpowiednikami ręcznych powiek mierzonych w dniu zero.
Czystość endokrynna wynosiła około 98,56% na podstawie barwienia dithozone pierwszego dnia. Indeksy stymulacji wynosiły 9,37 pierwszego dnia, 8,34 trzeciego dnia i 6,7 siódmego dnia, bez istotnych różnic między punktami czasowymi. Metoda ta umożliwia badanie przeszczepów oczkowych, funkcji komórek beta, odwrócenia cukrzycy, otoczkowania oczka oraz interakcji immunologicznych lub mikrośrodowiskowych oczków.
Protokół ten może być stosowany w przeszczepach przedklinicznych, modelowaniu cukrzycy, badaniach enkapsulacji oraz testach funkcjonalnych in vitro wymagających wysokoczystości oczek Lewis Rat.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje zstandaryzowany, wysokoprzepustowy protokół izolacji wysepek trzustkowych u szczurów linii Lewis, opracowany w celu maksymalizacji wydajności, czystości, żywotności oraz trwałości funkcjonalnej. Metoda ta integruje pobranie chirurgiczne, trawienie enzymatyczne oraz oczyszczanie w gradiencie gęstości, co umożliwia efektywne przygotowanie wysokiej jakości wysepek odpowiednich zarówno do przedklinicznych badań nad cukrzycą, jak i do badań nad transplantacją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia wysepek
- Badania nad cukrzycą
- Nauka o transplantacji
- Techniki izolacji komórek
Wstęp
- Wyspy trzustkowe mają kluczowe znaczenie dla badań nad cukrzycą oraz transplantologii.
- Istniejące metody izolacji często dają wyspy o zmiennej jakości, zanieczyszczone i krótkotrwałe.
- Nowoczesne terapie wymagają większych, czystszych i bardziej zestandaryzowanych preparatów wysp.
- Standaryzacja jest niezbędna w celu poprawy powtarzalności oraz wyników funkcjonalnych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego, wysokoprzepływowego protokołu izolacji wysokiej czystości i żywotności wysepek trzustkowych u szczurów linii Lewis.
- Optymalizacja wydajności oraz funkcjonalnej trwałości wysepek na potrzeby badań i transplantacji.
- Zminimalizowanie ręcznej manipulacji oraz zmienności w preparatach wysepek.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne odsłonięcie i perfuzja trzustki poprzez główny przewód trzustkowy z użyciem sterylnego buforu.
- Trawienie enzymatyczne w łaźni wodnej z wytrząsarką orbitalną, a następnie przerwanie reakcji i dysocjacja mechaniczna.
- Filtracja i wirowanie w gradiencie gęstości w celu oczyszczania wysepek.
- Kwantyfikacja z wykorzystaniem zarówno ręcznego liczenia alikwotów, jak i półautomatycznego obrazowania całego preparatu.
- Ocena czystości za pomocą barwienia ditizonem oraz żywotności i funkcji poprzez testy wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.
Główne wyniki
- Ręczne liczenie dało około 3300 ekwiwalentów wysepek (IEQ) i 2700 bezwzględnych wysepek na trzustkę (~39 600 IEQ łącznie z 12 trzustek).
- Analiza automatyczna wykazała łącznie 16 350 IEQ (1362 IEQ/trzustkę), co uwypukla zmienność ilościową.
- Rozkład wielkości wysepek: 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm), 6% (>250 μm).
- Czystość wynosiła około 98% w barwieniu ditiizonem; żywotność in vitro w dniach 3. i 7. utrzymała się na poziomie 98%.
- Ocena funkcjonalna wykazała 9- do 10-krotny wzrost sekrecji insuliny po stymulacji glukozą, który utrzymywał się przez 7 dni.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia efektywną i powtarzalną izolację wysokiej czystości, żywotnych i funkcjonalnie stabilnych wysepek trzustkowych od szczurów rasy Lewis.
- Wysepki pozostają odpowiednie do testów in vitro oraz transplantacji in vivo do siedmiu dni po izolacji.
- Metoda ta wspiera badania na szeroką skalę w zakresie modelowania cukrzycy, transplantacji, enkapsulacji oraz biologii wysepek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znormalizowana, wysokoprzepustowa izolacja wysepek trzustkowych od szczurów szczepu Lewis rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w badaniach nad cukrzycą oraz w przedklinicznych badaniach nad transplantacją. Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie powtarzalnych, wysokiej czystości i funkcjonalnie stabilnych preparatów wysepek, wspierając skalowalne procesy badawcze in vitro oraz in vivo. Niezawodne źródło wysepek zwiększa pewność predykcyjną i umożliwia zminimalizowanie ryzyka w procesach wczesnego odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji komórek beta oraz mechanizmów cukrzycy w kontrolowanych układach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie spójnych, wysokiej czystości wysepek trzustkowych do badań mechanistycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki wiarygodnym testom wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowane preparaty wysepek trzustkowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników screeningu związków i opracowania testów.
- Ogranicza zmienność wynikającą z błędów manualnych, wspierając ilościowe i skalowalne wyniki analiz.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne dla dalszych etapów pracy na platformach wysokoprzepustowego screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia przedkliniczne przeszczepianie oraz modelowanie cukrzycy z wykorzystaniem funkcjonalnie nienaruszonych wysepek.
- Zapewnia ciągłość między funkcjonalnymi analizami in vitro a badaniami skuteczności in vivo.
- Jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerów poprzez utrzymanie żywotności i funkcji wysepek w czasie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, stanowiąc podstawę do identyfikacji związków wiodących, ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz walidacji translacyjnej w badaniach nad cukrzycą.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych z wykorzystaniem wysokiej jakości wysepek.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalne, ilościowe odczyty w celu oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia zarówno manualne, jak i półautomatyczne metody kwantyfikacji w celu rzetelnego porównania danych.
- Badania translacyjne: Utrzymuje funkcję i żywotność wysepek na potrzeby przedklinicznej transplantacji i dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, wielokrotnego użytku schemat pracy dla bieżących badań nad cukrzycą i biologią wysepek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach cukrzycy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację wysepek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez zapewnienie wiarygodnych danych biologicznych wejściowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych nad cukrzycą.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach chirurgicznych oraz enzymatycznym przetwarzaniu tkanek.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do perfuzji, separacji gradientowej oraz ilościowego oznaczania opartego na obrazowaniu.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Adaptacja do innych szczepów gryzoni może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
- W planowaniu eksperymentów należy uwzględnić zmienność wydajności i ilościowego oznaczania pomiędzy metodami manualnymi a zautomatyzowanymi.
