Protokół dotyczący dysocjacji pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA oraz izolacji komórek i fibroblastów mioepitelowych z starzejących się gruczołów łzowych i ślinowych

Moje laboratorium bada, jak zmiany związane z wiekiem w gruczołach ślinowych i łzowych wpływają na różne typy komórek, wykorzystując cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA jednokomórkowego. Standardowe metody dysocjacji słabo odzyskują delikatne komórki nabłonkowe z postarzałych gruczołów ślinowych i łzowych. Mój protokół poprawia żywotność komórek i umożliwia niezawodną analizę i sortowanie komórek w pojedynczych komórkach.

Na początek ułóż uśpioną mysz na plecach na stole do sekcji. Używając cienkich kleszczy i nożyczek, naciń skórę między okiem a uchem. Delikatnie cofnij skórę, aby odsłonić gruczoł łzowy.

Używając szczypiec z tępymi końcami, lekko unieś gruczoł łzowy. Ostrożnie rozdzielaj otaczającą tkankę łączną, delikatnie ją rozciągając okrężnym ruchem. Zidentyfikuj widoczne granice gruczołu łzowego i oddziel go od sąsiednich tkanek, w tym gruczołu przyusznego.

Następnie przenieś gruczoł łzowy do 35-milimetrowej miski Petriego zawierającej dwa mililitry zimnego PBS na lodzie. Pod mikroskopem rozcinającym usuń pozostałą tkankę tłuszczową i ostrożnie usuń torebkę tkanki łącznej z gruczołu łzowego. Umieść sterylną 35-milimetrową miskę Petriego na lodzie.

Dodaj 800 do 1000 mikrolitrów zimnego PBS do środka naczynia i przenieś jeden gruczoł łzowy do PBS. Upewnij się, że tkanka pozostaje zanurzona w PBS. Używając dwóch sterylnych skalpeli, drobno pokróć gruczoł łzowy na małe fragmenty, aż uzyska miękką, pastowatą konsystencję.

Zbieraj fragmenty tkanek z jednej strony naczynia. Aspiruj resztki PBS i myj fragmenty jednym mililitrem świeżego, zimnego PBS. Przenieś wyprane fragmenty tkanki do płytki z 12 dołkami zawierającą po dwa mililitry podgrzanego podłoża trawiennego.

Włóż talerz do wstrząsającej kąpieli wodnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 60 obrotach na minutę przez 30 minut. Używając szerokiego końcówki pipety o średnicy jednego mililitra, delikatnie trituruj tkankę 15 razy. Wróć talerz do wstrząsającej kąpieli wodnej i inkubuj przez dodatkowe 30 minut.

Następnie, używając zwykłej pipety o pojemności jednego mililitra, delikatnie trituruj próbkę 10 razy i inkubuj ponownie przez 30 minut. Następnie delikatnie trituruj próbkę 10 razy i przenieś zawiesinę komórkową do dwumililitrowych mikrowirówek delfinów. Dodaj jeden mililitr medium blokującego zimno, czyli jednego BM1, do każdego dołku płyty, aby zebrać pozostałe medium trawienne zawierające resztki komórek i umieścić płytkę na lodzie do następnego etapu.

Wiruj rurki zawierające zawiesinę ogniwa w 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant z każdej rurki. Przenieś BM1 z każdej dołki płyty zawierającej komórki resztkowe do odpowiedniej rurki.

Następnie do każdego dołku dodaj 600 mikrolitrów zimnego BM1, aby przepłukać pozostałe komórki, a następnie przenieść płukanie do odpowiedniej rurki, aby połączyć się z zawiesiną komórkową. Delikatnie ponownie zawiesij zawiesinę komórkową. Ponownie wiruj probówki przy 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć supernatant.

Dodaj jeden mililitr Accutazy do osadów komórkowych i delikatnie je zawiesz. Inkubuj rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 60 obrotach na minutę przez pięć do dziesięciu minut. Używając końcówki pipety o średnicy jednego mililitra, delikatnie trituruj próbkę 10 razy.

Następnie dodaj do probówki jeden mililitr zimnego BM2, aby zakończyć reakcję enzymatyczną przez rozcieńczenie Accutazy. Wirówka w probówce 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzuć supernatant. Dodaj do probówki podłoże zawierające DNazę 1 w stężeniu 200 jednostek na mililitr, aby ponownie zawiesować komórki i wypełnić probówkę aż do góry.

Inkubuj tubkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie ponownie zawiesz po pięciu minutach. Tymczasem umieść sitko komórki 70 mikrometrów nad stożkową rurką o pojemności 15 milimetrów i wstępnie zwilż sitko jednym mililitrem BM3. Po inkubacji przenieś zawiesinę komórkową na sitko.

Dodaj jeden mililitr BM3 do oryginalnej probówki, aby ją przepłukać, a następnie przelać płukanie na to samo sitko. Przemyj sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami BM3. Na koniec określ stężenie i żywotność filtrowanej zawiesiny komórkowej za pomocą barwienia trypanowego oraz automatycznego licznika komórek.

Przejdź do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek do profilowania ekspresji genów lub sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej populacji komórek znakowanych fluorescencjo. Analiza UMAP danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zidentyfikowała dobrze reprezentowane populacje nabłonkowe i stromalne w gruczole łzowym, w tym komórki mioepitelowe i fibroblasty, a także różnorodne populacje komórek odpornościowych. Stare gruczoły łzowe zawierały obfitość osocza i aktywowane komórki B wyrażające IGHM i IGHD.

Sekwencyjne bramkowanie cytometrii przepływowej umożliwiło wyraźne oddzielenie komórek mioepithelium pozytywnych i GFP-pozytywnych dla EpCAM od komórek muralnych EpCAM ujemnych i GFP-dodatnich. Fibroblasty GFP-dodatnie ekspresujące PDGFR alfa były EpCAM-ujemne, co umożliwiało rozróżnienie od komórek nabłonkowych. U myszy PDGFR alfa, EGFP, wszystkie komórki GFP-dodatnie również wyrażały kolagen 1, potwierdzając tożsamość fibroblastów.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 99,6% komórek pozytywnych z GFP odpowiadało komórkom immunobarwionym PDGFR alfa. Protokół ten został zaprojektowany do izolacji żywotnych pojedynczych komórek z gruczołów łzowych w celu molekularnej charakterystyki populacji nabłonkowych, stromalnych i immunologicznych. Głównym wyzwaniem jest minimalizacja stresu mechanicznego i enzymatycznego podczas dysocjacji delikatnych, starzejących się tkanek, a także utrzymanie wysokiej żywotności komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Po tej procedurze izolowane komórki mogą być wykorzystywane do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA objętości oraz profilowania molekularnego określonych populacji komórek. Komórki sortowane można również hodować do dalszych badań funkcjonalnych.