Protokół dotyczący dysocjacji pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA oraz izolacji komórek i fibroblastów mioepitelowych z starzejących się gruczołów łzowych i ślinowych
24 kwietnia 2026
Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę dysocjacji starzejących się gruczołów łzowych myszy w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne i delikatne traktowanie zachowują integralność komórek, dając wysokiej jakości zawiesiny odpowiednie do izolacji specyficznej dla typu komórki oraz analizy transkryptomicznej zmian związanych ze starzeniem się w populacjach gruczołów łzowych.
Moje laboratorium bada, jak zmiany związane z wiekiem w gruczołach ślinowych i łzowych wpływają na różne typy komórek, wykorzystując cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA jednokomórkowego. Standardowe metody dysocjacji słabo odzyskują delikatne komórki nabłonkowe z postarzałych gruczołów ślinowych i łzowych. Mój protokół poprawia żywotność komórek i umożliwia niezawodną analizę i sortowanie komórek w pojedynczych komórkach.
Na początek ułóż uśpioną mysz na plecach na stole do sekcji. Używając cienkich kleszczy i nożyczek, naciń skórę między okiem a uchem. Delikatnie cofnij skórę, aby odsłonić gruczoł łzowy.
Używając szczypiec z tępymi końcami, lekko unieś gruczoł łzowy. Ostrożnie rozdzielaj otaczającą tkankę łączną, delikatnie ją rozciągając okrężnym ruchem. Zidentyfikuj widoczne granice gruczołu łzowego i oddziel go od sąsiednich tkanek, w tym gruczołu przyusznego.
Następnie przenieś gruczoł łzowy do 35-milimetrowej miski Petriego zawierającej dwa mililitry zimnego PBS na lodzie. Pod mikroskopem rozcinającym usuń pozostałą tkankę tłuszczową i ostrożnie usuń torebkę tkanki łącznej z gruczołu łzowego. Umieść sterylną 35-milimetrową miskę Petriego na lodzie.
Dodaj 800 do 1000 mikrolitrów zimnego PBS do środka naczynia i przenieś jeden gruczoł łzowy do PBS. Upewnij się, że tkanka pozostaje zanurzona w PBS. Używając dwóch sterylnych skalpeli, drobno pokróć gruczoł łzowy na małe fragmenty, aż uzyska miękką, pastowatą konsystencję.
Zbieraj fragmenty tkanek z jednej strony naczynia. Aspiruj resztki PBS i myj fragmenty jednym mililitrem świeżego, zimnego PBS. Przenieś wyprane fragmenty tkanki do płytki z 12 dołkami zawierającą po dwa mililitry podgrzanego podłoża trawiennego.
Włóż talerz do wstrząsającej kąpieli wodnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 60 obrotach na minutę przez 30 minut. Używając szerokiego końcówki pipety o średnicy jednego mililitra, delikatnie trituruj tkankę 15 razy. Wróć talerz do wstrząsającej kąpieli wodnej i inkubuj przez dodatkowe 30 minut.
Następnie, używając zwykłej pipety o pojemności jednego mililitra, delikatnie trituruj próbkę 10 razy i inkubuj ponownie przez 30 minut. Następnie delikatnie trituruj próbkę 10 razy i przenieś zawiesinę komórkową do dwumililitrowych mikrowirówek delfinów. Dodaj jeden mililitr medium blokującego zimno, czyli jednego BM1, do każdego dołku płyty, aby zebrać pozostałe medium trawienne zawierające resztki komórek i umieścić płytkę na lodzie do następnego etapu.
Wiruj rurki zawierające zawiesinę ogniwa w 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant z każdej rurki. Przenieś BM1 z każdej dołki płyty zawierającej komórki resztkowe do odpowiedniej rurki.
Następnie do każdego dołku dodaj 600 mikrolitrów zimnego BM1, aby przepłukać pozostałe komórki, a następnie przenieść płukanie do odpowiedniej rurki, aby połączyć się z zawiesiną komórkową. Delikatnie ponownie zawiesij zawiesinę komórkową. Ponownie wiruj probówki przy 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzuć supernatant.
Dodaj jeden mililitr Accutazy do osadów komórkowych i delikatnie je zawiesz. Inkubuj rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 60 obrotach na minutę przez pięć do dziesięciu minut. Używając końcówki pipety o średnicy jednego mililitra, delikatnie trituruj próbkę 10 razy.
Następnie dodaj do probówki jeden mililitr zimnego BM2, aby zakończyć reakcję enzymatyczną przez rozcieńczenie Accutazy. Wirówka w probówce 300 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i wyrzuć supernatant. Dodaj do probówki podłoże zawierające DNazę 1 w stężeniu 200 jednostek na mililitr, aby ponownie zawiesować komórki i wypełnić probówkę aż do góry.
Inkubuj tubkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie ponownie zawiesz po pięciu minutach. Tymczasem umieść sitko komórki 70 mikrometrów nad stożkową rurką o pojemności 15 milimetrów i wstępnie zwilż sitko jednym mililitrem BM3. Po inkubacji przenieś zawiesinę komórkową na sitko.
Dodaj jeden mililitr BM3 do oryginalnej probówki, aby ją przepłukać, a następnie przelać płukanie na to samo sitko. Przemyj sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami BM3. Na koniec określ stężenie i żywotność filtrowanej zawiesiny komórkowej za pomocą barwienia trypanowego oraz automatycznego licznika komórek.
Przejdź do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek do profilowania ekspresji genów lub sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej populacji komórek znakowanych fluorescencjo. Analiza UMAP danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zidentyfikowała dobrze reprezentowane populacje nabłonkowe i stromalne w gruczole łzowym, w tym komórki mioepitelowe i fibroblasty, a także różnorodne populacje komórek odpornościowych. Stare gruczoły łzowe zawierały obfitość osocza i aktywowane komórki B wyrażające IGHM i IGHD.
Sekwencyjne bramkowanie cytometrii przepływowej umożliwiło wyraźne oddzielenie komórek mioepithelium pozytywnych i GFP-pozytywnych dla EpCAM od komórek muralnych EpCAM ujemnych i GFP-dodatnich. Fibroblasty GFP-dodatnie ekspresujące PDGFR alfa były EpCAM-ujemne, co umożliwiało rozróżnienie od komórek nabłonkowych. U myszy PDGFR alfa, EGFP, wszystkie komórki GFP-dodatnie również wyrażały kolagen 1, potwierdzając tożsamość fibroblastów.
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 99,6% komórek pozytywnych z GFP odpowiadało komórkom immunobarwionym PDGFR alfa. Protokół ten został zaprojektowany do izolacji żywotnych pojedynczych komórek z gruczołów łzowych w celu molekularnej charakterystyki populacji nabłonkowych, stromalnych i immunologicznych. Głównym wyzwaniem jest minimalizacja stresu mechanicznego i enzymatycznego podczas dysocjacji delikatnych, starzejących się tkanek, a także utrzymanie wysokiej żywotności komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Po tej procedurze izolowane komórki mogą być wykorzystywane do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA objętości oraz profilowania molekularnego określonych populacji komórek. Komórki sortowane można również hodować do dalszych badań funkcjonalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół izolacji żywych pojedynczych komórek z gruczołów łzowych (LGs) starych myszy, umożliwiający wysokiej jakości sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) oraz analizę cytometryczną. Metoda ta rozwiązuje problemy wynikające ze zwiększonej włóknicy, kruchości komórek i akumulacji lipidów w starych gruczołach łzowych, zapewniając efektywną dysocjację i odzysk różnorodnych typów komórek do późniejszego profilowania molekularnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórkowa i molekularna
- Oftalmologia i badania nad gruczołami egzokrynnymi
- Transkryptomika pojedynczych komórek
Wstęp
- Starzenie się gruczołu łzowego prowadzi do zmniejszenia wydzielania łez i przewlekłego stanu zapalnego, co przyczynia się do rozwoju zespołu suchego oka.
- Zmiany związane z wiekiem obejmują infiltrację komórek odpornościowych, uszkodzenia komórkowe, akumulację lipidów, odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej oraz poszerzenie przewodów.
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek jest potężnym narzędziem do profilowania heterogeniczności komórkowej i zmian transkrypcyjnych podczas starzenia się.
- Uzyskanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek ze starzejących się gruczołów łzowych jest trudne pod względem technicznym ze względu na kruchość tkanek i włóknienie.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego protokołu wydajnej dysocjacji starzejących się gruczołów łzowych myszy.
- Umożliwienie izolacji wielu typów komórek odpowiednich do analiz scRNA-seq oraz cytometrii przepływowej.
- Zminimalizowanie uszkodzeń komórek i maksymalizacja ich żywotności podczas przetwarzania tkanki.
Zastosowane metody
- Staranna sekcja i rozdrobnienie tkanki gruczołu łzowego myszy poddanych eutanazji.
- Stopniowe trawienie enzymatyczne z wykorzystaniem kolagenazy IV, dispazy II, DNazy I i Accutase.
- Stosowanie powlekanych naczyń plastikowych oraz kontrolowana temperatura i wytrząsanie w celu ograniczenia stresu komórkowego.
- Lizę erytrocytów i sekwencyjną filtrację przez sita w celu zwiększenia czystości komórkowej.
- Izolacja specyficznych typów komórek z wykorzystaniem linii myszy reporterowych (Acta2GFP i PdgfraEGFP) oraz sortowania komórek metodą FACS po immunobarwieniu przeciwciałem przeciwko EpCAM.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie wysokiej jakości, żywych zawiesin pojedynczych komórek zarówno z przestarzałych, jak i młodych gruczołów łzowych.
- Analiza UMAP danych scRNA-seq zidentyfikowała dobrze reprezentowane populacje komórek nabłonkowych, stromalnych oraz różnorodne populacje komórek odpornościowych.
- Metoda FACS umożliwiła wyraźną separację i identyfikację komórek mioepitelialnych (EpCAM+, GFP+) oraz fibroblastów (PDGFRα+, EpCAM-).
- W przestarzałych gruczołach łzowych wykryto liczne komórki plazmatyczne oraz aktywowane limfocyty B wykazujące ekspresję IGHM i IGHD.
- 99,6% komórek GFP-dodatnich odpowiadało fibroblastom barwionym przeciwciałami przeciwko PDGFRα, co potwierdziło tożsamość komórek.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia wydajną i łagodną dysocjację starzejących się gruczołów łzowych do analizy pojedynczych komórek.
- Zapewnia on wysoką żywotność komórek oraz odzysk wielu typów komórek, w tym delikatnych populacji nabłonkowych i stromalnych.
- Metoda ta może zostać dostosowana do innych włókniejących lub starzejących się tkanek egzokrynnych wymagających celowej izolacji komórek.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna dysocjacja i izolacja pojedynczych komórek z postarzonych gruczołów łzowych i ślinianych rozwiązuje krytyczny problem w profilowaniu heterogeniczności komórkowej oraz zmian transkrypcyjnych związanych z procesami starzenia i włóknienia tkanek. Niniejszy protokół umożliwia odzyskanie z wysoką żywotnością kruchych populacji nabłonkowych i zrębowych, co wspiera wiarygodne sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek oraz celowane sortowanie komórek na etapie badań odkrywczych. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w specyficznej dla typów komórek charakterystyce molekularnej, co pozwala na wczesną walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w modelach chorób gruczołów egzokrynnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie związanych z wiekiem zmian komórkowych i molekularnych w tkankach egzokrynnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację żywych komórek mioepitelialnych i fibroblastów do dalszych analiz.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych do profilowania transkryptomicznego.
- Zwiększa pewność prognostyczną w modelowaniu systemów istotnych dla przebiegu choroby w przypadku zespołu suchego oka i zaburzeń pokrewnych.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane zawiesiny pojedynczych komórek odpowiednie do wysokoprzepustowych analiz scRNA-seq oraz przepływowej cytometrii.
- Standaryzuje etapy dysocjacji i izolacji w celu maksymalizacji powtarzalności oraz jakości uzyskanego wyniku ilościowego.
- Umożliwia niezawodne sortowanie specyficzne dla typu komórek z wykorzystaniem FACS i linii myszy reporterowych do rozwoju testów.
- Wspiera skalowalną adaptację do innych włókniejących lub starzejących się tkanek egzokrynnych o podobnych trudnościach w dysocjacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników profilowania molekularnego z biomarkerami istotnymi dla choroby w modelach tkanek starzejących się.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie przeprowadzania analiz funkcjonalnych na posortowanych populacjach komórek.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne w badaniach translacyjnych, zapewniając wysoką żywotność i czystość komórek dla kolejnych etapów zastosowań.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wiarygodną analizę pojedynczych komórek oraz ukierunkowaną izolację komórek z trudnych do analizy tkanek starzejących się.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków w dysfunkcjach gruczołów egzokrynnych związanych z wiekiem.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, wysokiej czystości zawiesiny pojedynczych komórek do ilościowych analiz transkrypcyjnych i cytometrycznych.
- Analityka: Zapewnia rozdzielone według typów komórek dane molekularne i umożliwia statystyczne porównanie populacji komórkowych w różnych grupach wiekowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i walidację funkcjonalną w modelach tkanki starzejącej się istotnych dla przebiegu choroby.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Adaptowalny protokół dla różnorodnych tkanek egzokrynnych, wspierający skalowalność platformy i standaryzację międzyprogramową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizach specyficznych dla typów komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przepływów pracy z pojedynczymi komórkami w tkankach starzejących się i włókniejących.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie solidnego profilowania molekularnego na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację i rozwój programów ukierunkowanych na dysfunkcję i starzenie się gruczołów egzokrynnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce tkanek, dysocjacji enzymatycznej oraz sortowaniu komórek metodą cytometrii przepływowej.
- Wymaga dostępu do automatycznych liczników komórek, aparatury FACS oraz platform do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów dysocjacji i sortowania w obrębie zespołów w celu zapewnienia powtarzalności wyników.
- Adaptacja metody do innych tkanek może wymagać optymalizacji stężeń enzymów oraz czasów inkubacji.
- Żywotność i liczba uzyskanych komórek mogą być ograniczone przez włóknienie tkanek oraz kruchość komórkową w zaawansowanych modelach starzenia.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
