Name: Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj protokół syntezy hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 do enkapsulacji hemoglobiny z biortogonalną PEGylacją. Metoda zapewnia skalowalną produkcję nośników tlenu o wysokiej stabilności koloidalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy wsparciu Europejskiej Rady Badań w ramach programu Badań i Innowacji Horyzont 2020 Unii Europejskiej (Grant nr 101002060).

Autorzy deklarują brak konkurencyjnego interesu finansowego.

Protokół ten oferuje solidną i powtarzalną drogę syntezy, funkcjonalizacji i charakteryzacji NP HP-UiO-66 zaprojektowanych do enkapsulacji Hb i dostarczania tlenu. Przyjmując podejście inżynieryjne od środka na zewnątrz, prace te ustanawiają uogólnione ramy projektowania NP MOF do zastosowań biomedycznych, w tym biomakrocząsteczek i dostarczania leków. Chociaż koncepcja materiału podstawowego i funkcjonalna wydajność były już wcześniej raportowane, obecny protokół znacząco rozszerza wcześniejsze prace, kładąc nacisk na p...

Odpowiednie natlenienie jest kluczowe dla skutecznej terapii i gojenia tkanek w różnych środowiskach biomedycznych1. W przypadku urazów i krwotoku chirurgicznego poważna utrata tlenu może zagrażać życiu, co podkreśla potrzebę stosowania bezpiecznych substytutów krwi, gdy krew dawcy jest niedostępna2. W onkologii obszary nowotworów hipoksycznych ograniczają skuteczność leczenia zależnego od tlenu, a dodatkowe dostarczanie tlenu może znacząco zwiększyć skuteczność terapeutyczną 3,4,5,6. Tlen odgrywa również kluczową rolę w gojeniu ran, gdzie zwiększona dostępność tlenu sprzyja angiogenezie i naprawie tkanek7. Podobnie, w stanach niedokrwiennych i przeszczepach narządów, nośniki tlenu mogą zmniejszyć uszkodzenia niedotlenienia oraz poprawić żywotność tkanek i ich regenerację 8,9.
Syntetyczne nośniki tlenu na bazie hemoglobiny (Hb) (HBOC) stanowią obiecujące podejście do łagodzenia hipoksji10. Jednak Hb poza czerwonymi krwinkami (RBC) jest z natury niestabilny i szybko dysocjuje się w dimery, które mogą powodować nefrotoksyczność, uszkodzenia oksydacyjne i zwężenie naczyń wazo-konskurnych w wyniku wydzielania tlenku azotu11. Aby złagodzić te wyzwania, opracowano strategie enkapsulacji stabilizujące Hb w biokompatybilnych nanonośnikach, takich jak liposomy12, polimeromy13 oraz polimerowe nanocząstki (NPs)14,15,16,17. Chociaż te systemy zwiększają stabilność Hb, osiągnięcie wysokiej efektywności enkapsulacji przy jednoczesnym zachowaniu natywnej funkcji wiązania tlenu pozostaje wyzwaniem18. Dodatkowo, przekształcenie oksydacyjne do methemoglobiny oraz wyciek hemu mogą ograniczyć wydajność przenoszenia tlenu19. Szybkie oczyszczanie i przedwczesne wycieki Hb dodatkowo ograniczają czas krążenia i translację kliniczną20.
Metalowo-organiczne ramy (MOF) niedawno stały się wszechstronnymi nanoplatformami do dostarczania leków i biomakrocząsteczek dzięki swojej architekturze krystalicznej, dużej powierzchni oraz regulowanej porowatości21. Składające się z metalowych węzłów skoordynowanych z organicznymi łącznikami, MOF-y umożliwiają dyfuzję molekularną i modyfikację strukturalną, co czyni je atrakcyjnymi do zastosowań biomedycznych. Jednak większość MOF posiada głównie mikroporowate jamy (<2 nm), które poważnie ograniczają postsyntetyczne enkapsulowanie makrocząsteczek, takich jak białka, kwasy nukleinowe czy enzymy 22,23,24,25. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest mineralizacja biomimetyczna in situ, gdzie biomolekuły pełnią rolę centrów nukleacji podczas wzrostu MOF, co zostało wykazane dla ZIF-8 i ZIF-90 26,27,28. Pomimo skuteczności, ta strategia wymaga łagodnych warunków syntezy, które ograniczają zakres kompatybilnych chemikaliów MOF29,30.
UiO-66, cyrkonowy MOF zbudowany z węzłów oktaedralnych Zr6O4(OH)4 oraz łączników 1,4-benzenedikarboksylan (BDC), wyróżnia się wyjątkową stabilnością chemiczną i biokompatybilnością31. Jego solidna struktura opiera się rozkładowi w środowiskach wodnych i fizjologicznych, co czyni go idealnym do zastosowań biomedycznych32. Niemniej jednak jego wewnętrzna mikroporowata struktura ogranicza jego użyteczność do enkapsulacji biomakrocząsteczek. Hb, o wymiarze cząsteczkowym ~5 nm, nie może być umieszczony w wewnętrznych porach nieskazitelnej UiO-66. Odpowiednio, tylko ograniczona liczba badań badała UiO-66 w systemach związanych z Hb, gdzie MOF-y są wykorzystywane głównie do wykrywania Hb na powierzchni, a nie do enkapsulacji ramowej33,34. W rezultacie platformy oparte na UiO-66 do enkapsulacji Hb pozostają stosunkowo słabo rozwinięte.
Niedawno wprowadziliśmy hierarchicznie porowaty UiO-66 NP (HP-UiO-66), który przełamuje ograniczenie wielkości porów, włączając mezoporowe domeny zdolne do przyjęcia Hb, rozszerzając tym samym funkcjonalny zakres UiO-66 dla rozwoju HBOC35. Porowatość hierarchiczna jest wprowadzana poprzez inżynierię defektów, konkretnie poprzez zastosowanie długołańcuchowych kwasów monokarboksylowych, takich jak kwas dodekanowy (DA), jako modulatorów podczas syntezy36,37. Ten modulator konkuruje z ligandem BDC o koordynację z Zr4+, co prowadzi do powstawania defektów i powiększania mezoporów. Późniejsze usunięcie modulatora daje NP HP-UiO-66 zawierające współistniejące mikro- i mezoporowe domeny, z regulowanym rozmiarem porów dzięki stężeniu modulatora lub długości łańcucha36.
Chociaż wprowadzenie mezoporowatości poprawia dostępność cząsteczkową, może również ograniczyć integralność ramy buforów zawierających fosforany. Jony fosforanowe mogą koordynować się z klastrami Zr, prowadząc do częściowej lub całkowitej dezintegracji strukturalnej38,39. W związku z tym strategie stabilizacji powierzchni są niezbędne do zachowania stabilności koloidalnej i chemicznej w warunkach fizjologicznych40. Ogólnie rzecz biorąc, stabilizację powierzchni MOF można osiągnąć poprzez niekowalencyjne interakcje (np. interakcje van der Waalsa i wiązania wodorowe)41, interakcje koordynacyjne z odsłoniętymi miejscami metalowymi42 lub kowalencyjne przywiązanie do organicznych linkerów43. Spośród innych linkerów glikol polietylenowy (PEG) jest szczególnie atrakcyjny ze względu na szeroką dostępność i minimalną złożoność syntezy44. Co ważne, modyfikacja powierzchni PEG, powszechnie określana jako PEGylacja, zapewnia kilka korzystnych właściwości dla systemów podawania leków, w tym doskonałą biokompatybilność, zmniejszoną adsorpcję niespecyficznych białek oraz zmniejszone rozpoznawanie immunologiczne i absorpcję makrofagów45,46. Łącznie te efekty zmniejszają odpowiedzi immunogenne i wydłużają krążenie układowe47.
Tradycyjne techniki PEGylacji często opierają się na chemii karbodiamidu lub maleimidu, które zazwyczaj wymagają katalizatorów lub reaktywnych pośredników, które mogą uszkadzać wrażliwe biomolekusty, takie jak Hb. Aby obejść to ograniczenie, stosujemy cyklododatkę alkinowo-azydową wspieraną przez szczep (SPAAC), bioortogonalną reakcję wolną od katalizatorów między funkcjonalizowanymi azydem a dibenzylocykloktynem (DBCO), umożliwiającą specyficzną koniugację w łagodnych warunkach wodnych35,48. Takie podejście zapewnia efektywną modyfikację powierzchni bez kompromisu w funkcji Hb w kapsule.
Bazując na wcześniej zgłoszonych HP-UiO-66 NPs35, które koncentrowały się na projektowaniu strukturalnym i walidacji biofunkcjonalnej, niniejszy protokół kładzie nacisk na przejrzystość metodologiczną i powtarzalność, zapewniając szczegółowy, krok po kroku eksperymentalny workflow z określonymi zakresami parametrów i krytycznymi aspektami obsługi pacjentów. Uwzględnione są wskazówki dotyczące diagnostyki kluczowych etapów syntezy, enkapsulacji Hb oraz PEGylacji za pomocą chemii SPAAC, co ostatecznie daje stabilne NP Hb@HP-UiO-66-PEG (patrz Rysunek 1).
Workflow obejmuje: (i) inżynierię defektów z wykorzystaniem DA jako modulatora do syntezy amino-modyfikowanych HP-UiO-66-NH2 NP; (ii) funkcjonalizację azydową powierzchniowych grup aminowych (azidowych); (iii) otoczenie Hb w łagodnych, wodnych warunkach; (iv) kowalencyjne sprzężenie PEG przez SPAAC.
Dla każdego ważnego etapu protokół ten identyfikuje typowe wyzwania eksperymentalne, takie jak agregacja cząstek, zapadanie się porów czy nieefektywna funkcjonalność powierzchni, oraz oferuje praktyczne strategie rozwiązywania problemów poprawiających powtarzalność między laboratoriami. Co ważne, artykuł ten szczegółowo pokazuje, że synteza NP HP-UiO-66 jest łatwo skalowalna, co umożliwia niezawodną produkcję w skali gramów na partię.
Ostatnie nanonośniki PEGylowane wykazują wysoką stabilność koloidalną w solach fizjologicznych, kwasie 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowym (HEPES) oraz surowicy, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności wiązania i uwalniania tlenu przez Hbna poziomie 35. Metody analityczne, takie jak spektroskopia podczerwieni z transformatem Fouriera (FTIR), jądrowy rezonans magnetyczny (NMR), dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego proszku (PXRD), sorpcja azotu (N 2), analiza potencjału zeta (ζ), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) oraz transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), potwierdzają transformację chemiczną, integralność ramy, porowatość, morfologię nanoskalową oraz skuteczną funkcionalizację powierzchni.
Poprzez nacisk na powtarzalność, skalowalność i przejrzystość operacyjną, wspieraną wizualizacją technicznie wrażliwych kroków opartą na wideo, ta metodologia zapewnia powtarzalną, solidną i dostępną drogę do wytwarzania stabilnych nośników tlenu opartych na MOF. Co ważne, podejście to jest modułowe i łatwo adaptowalne do innych biomakrocząsteczek lub enzymów, które wymagają chronionego, a jednocześnie tlenowo przepuszczalnego mikrośrodowiska, aby zachować funkcjonalność. W związku z tym NP Hb@HP-UiO-66-PEG stanowią obiecujący krok w kierunku stworzenia HBOC zdolnych do efektywnego dostarczania tlenu, jednocześnie odpornego na degradację płynów biologicznych.
Z praktycznego punktu widzenia strategia ta może być rozszerzona na inne biomakrocząsteczki poza Hb, pod warunkiem, że mają one wymiary poniżej około 20 nm, odpowiadające maksymalnemu dostępnemu rozmiarowi mezoporów, oraz wykazują jedną lub więcej z następujących cech: (i) wrażliwość na trudne warunki chemiczne, sprzyjającą łagodnej syntezie i modyfikacji powierzchni; (ii) wymóg nawadniania, tlenu przepuszczalnego mikrośrodowiska do utrzymania aktywności funkcjonalnej; oraz (iii) podatność na degradację MOF wywołaną fosforanami, co wymaga stabilizacji powierzchni. Podejście opiera się na umiarkowanych gęstościach defektów, aby zrównoważyć dostępność mezoporów z integralnością struktury. Gdy modyfikacja powierzchni bez katalizatorów i specyficzna dla miejsca jest konieczna, aby zachować funkcję biocząsteł, PEGylacja oparta na SPAAC oferuje wyraźne korzyści. W związku z tym protokół ten jest dobrze przystosowany do efektywnego ładowania biomakrocząsteczek, funkcjonalnej konserwacji oraz długoterminowej stabilności koloidalnej w warunkach fizjologicznych, podczas gdy znacznie większe biomolekuły lub systemy wymagające ekstremalnej stabilności termicznej lub kwasowej mogą wymagać alternatywnych platform MOF.

<table><tbody><tr><td>2-amino-1,4-benzenodoksylowy kwas &nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>381071-25G</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-etansulfonowy kwas</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aceton (99%)</td><td>VWR International (S&oslash; borg, DK)</td><td>23J244030</td><td></td></tr><tr><td>Badanie białka kwasu bicynchoninowego &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Krew bydła&nbsp;</td><td>SSI Diagnostica A/S (Hiller & Oslash; d, DK)</td><td>77667</td><td></td></tr><tr><td>Rurka wirówkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)</td><td>75009903</td><td>Seria Megafuge ST Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzocyklooktyno-polietylenowy glikol</td><td>BroadPharm</td><td>BP-23949</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dodekanonowy &nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>L556-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle' s średnio-minus; wysoki poziom glukozy &nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>VWR International (S&oslash; borg, DK)</td><td>24L044013</td><td></td></tr><tr><td>Spektroskopia podczerwieni z transformacją Fouriera&nbsp;</td><td>Bruker (Billerica, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator hemoksygenu &nbsp;</td><td>TSC Scientific Crp (PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma cytowana ludzka</td><td>TebuBio</td><td>SER-PLP25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (37%)</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia (USA)</td><td></td><td>Wersja 1.47t</td></tr><tr><td>Siatka Cu z koronką i węglem (siatka 300)</td><td>Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Wielka Brytania)</td><td>AGS166-3H</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczna</td><td>IKA-Werke GmbH & Kompania KG (,DE)</td><td>Ident. Nr.: 0010011496</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova sofeware</td><td>Mestrelab Research (Hiszpania)</td><td></td><td>Wersja 12</td></tr><tr><td>Analizator powierzchni Tristar Micromeritics</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>ASAP 2020 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Eppendorf Nordic (H&oslash; rsholm, DK)</td><td>Nr katalogowy &nbsp; 5452000010</td><td></td></tr><tr><td>Serum myszy</td><td>Innowacyjne badania (Novi, MI, USA)</td><td>IGMSCD1SER10ML</td><td></td></tr><tr><td>Piec tłumiczy&nbsp;</td><td>Nabertherm GmbH (Brema, DE)</td><td>Piec tłumiczy LE 6/11</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-dimetyloformamid (99,9%)</td><td>VWR International (S&oslash; borg, DK)</td><td>250131a008</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt Nanodrop 2000c&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rezonans magnetyczny jądrowy&nbsp;</td><td>Bruker (Billerica, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2 metr &nbsp;</td><td>PreSens (Ratyzbona, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Origin 2022</td><td>OriginLab Corporation (MA, USA)</td><td></td><td>Wersja 2022&nbsp;</td></tr><tr><td>Czujnik tlenu</td><td>PreSens (Ratyzbona, DE)</td><td>Ślad OXY-1 ST</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanem buforowana sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płyt</td><td>Tecan Group Ltd.&nbsp; (M&auml; nnedorf, CH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanoferian potasu</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>60299-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dyfrakcja rentgenowska proszku,</td><td>Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Wielka Brytania)</td><td></td><td>Model: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD do pomiarów proszku (wydane w 2020 roku)</td></tr><tr><td>Naczynie ciśnieniowe z okrągłym dnem&nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>SYNP170004-1EA</td><td></td></tr><tr><td>skaningowa mikroskopia elektronowa &nbsp;</td><td>Kompania FEI (Hillsboro, USA)</td><td>Dual Beam FEI Helios Nanolab 600</td><td></td></tr><tr><td>kloryd sodu & nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Ditionit sodu & nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>71699-250G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu & nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>Synthware&trade; Zbiornik ciśnieniowy z okrągłym dnem</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>SYNP170003</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn tert-butylo&nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>20370-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (99,7%)</td><td>VWR International (S&oslash; borg, DK)</td><td>201022A004</td><td></td></tr><tr><td>Termowstrząs</td><td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Wielka Brytania)</td><td>PHMT-PSC18 (01012015020119)</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa &nbsp;</td><td>Kompania FEI (Hillsboro, USA)</td><td>FEI Tecnai T20</td><td></td></tr><tr><td>Trymetylosilylazol &nbsp;</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>155071-10G</td><td></td></tr><tr><td>TSC HEMOX DAQ System</td><td>TSC Scientific Crp (PA, USA)</td><td></td><td>Oprogramowanie analizatora hemox&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrosound sonicator &nbsp;</td><td>Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, USA)</td><td>SKU: 2410240003</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spektrofotometr &nbsp;</td><td>Shimadzu (Kioto, JP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik próżniowy &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Wielka Brytania)</td><td>Numer seryjny. MAL1188530</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cyrkonu(IV)</td><td>Merck Life Science A/S (S&oslash; borg, DK)</td><td>357405-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna pegylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach uio-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Synthesis, Hemoglobin Encapsulation and Biorthogonal PEGylation in Hierarchically Porous UiO-66 Nanoparticles for Oxygen Delivery Applications

Nośniki tlenu na bazie hemoglobiny (HBOC) są ważną platformą dostarczania tlenu, łagodząc hipoksję w kilku kontekstach biomedycznych. Jednak wolna hemoglobina (Hb) jest niestabilna i aktywna naczynia poza czerwonymi krwinkami. Przedstawiamy tutaj powtarzalny, skalowalny protokół krok po kroku do wytwarzania hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 (NP HP-UiO-66), które otoczają Hb i są stabilizowane przez powłoki bioortogonalnego glikolu polietylenowego (PEG). Hierarchiczna mezoporowatość jest wprowadzana przez modulację kwasu dodekanowego i późniejsze płukanie kwasem, co daje NP HP-UiO-66-NH₂ o zachowanej krystaliczności oraz połączonych izotermach typu I/IV N2 . Aminy powierzchniowe są przekształcane w azidy (HP-UiO-66-N₃ NP), co umożliwia cyklododatkę alkinowo-azydową bez katalizatorów promowaną przez naprężenia (SPAAC) produkcję NP Hb@HP-UiO-66-PEG. Workflow obejmuje: i) inżynierię defektów NP UiO-66-NH₂, ii) usunięcie modulatora, iii) instalację azydu, iv) ładowanie Hb w buforowanym nośniku wodnem oraz v) PEGylację pośredniczoną przez SPAAC. Krytyczne parametry eksperymentalne, standardowe tryby awarii oraz strategie rozwiązywania problemów są szczegółowo opisane na każdym etapie, aby zwiększyć powtarzalność między laboratoriami. Protokół umożliwia produkcję NP HP-UiO-66-NH₂ na skalę gramów w każdej partii. Efektywność enkapsulacji na poziomie ~35% (zawartość obciążenia ~24 wt%) dla Hb uzyskuje się w łagodnych warunkach, z redyspersybilnymi NP o średnicy hydrodynamicznej ~140 nm i niskiej polidyspersyjności po PEGylacji. Kompleksowa charakterystyka fizykochemiczna potwierdza integralność szkieletu, mezoporowatość, skuteczną chemię powierzchni oraz rozproszoną koronę PEG o szerokości do ~12 nm. Testy funkcjonalne wykazują odwracalną oxygenację/deoxygenację enkapsulowanego Hb, co wskazuje na zachowaną zdolność transportu tlenu. PEGylacja znacząco zwiększa stabilność koloidalną i strukturalną w soli fizjologicznej, HEPES i surowicy, zapobiegając degradacji wywołanej fosforanami obserwowanej u odpowiedników niepegilatowanych. Dzięki integracji szczegółowych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, wizualizacji kluczowych kroków wspomaganej wideo oraz rozważań dotyczących skalowania, ten modułowy protokół zapewnia solidną i dostępną drogę do HBOC opartych na metalowo-organicznych ramach. Strategia ta jest łatwo adaptowalna do innych biomakrocząsteczek lub enzymów wymagających ochronnych, a jednocześnie dostępnych mikrośrodowisk do dostarczania terapeutycznego.

Pomyślną syntezę NP HP-UiO-66-NH2 potwierdził PXRD (Rysunek 2A), który wykazał charakterystyczne piki dyfrakcyjne w 2θ = 7,3°, 8,4° i 25,7°, co dobrze odpowiada symulowanej strukturze UiO-6636. Niewielkie rozszerzenie szczytu względem symulowanego wzoru przypisano nanoskalowym wymiarom cząstek oraz potwierdzeniu zachowania integralności krystalicznej po syntezie54. Całkowite usunięcie DA potwierdzono spektroskopią NMR 1H p...

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) are an important platform for oxygen delivery to mitigate hypoxia in several biomedical contexts. However, free ...

Celem tych badań jest określenie stabilnych ram metalowo-organicznych, opartych na MOF nanocząstek do enkapsulacji hemoglobiny i dostarczania tlenu. Hierarchiczny porowaty morf może przezwyciężyć ograniczenie rozmiarowe dla enkapsulacji hemoglobiny, a populacja powierzchniowa może poprawić stabilność cząstek w środowiskach fizjologicznych. Na początek dokładnie zważ 50 miligramów przygotowanych hierarchicznie porowatych nanocząsteczek UIO 66, aminowych w kolbę o pojemności 25 mililitrów z okrągłym dnem.Dodaj do kolby 10 mililitrów tetrahydrofuranu. Następnie ultrasonikuj mieszaninę przez pięć minut, aby w pełni rozproszyć cząstki, tworząc jednolitą, nieprzezroczystą zawiesinę. Umieść kolbę z okrągłym dnem w kąpieli w lodowatej wodzie na magnetycznej mieszadłce ustawionej na 400 obr./min.Używając szklanej strzykawki, dodaj 0,4 mililitra azotynu tert-butylo-azotynu kroplami przez pięć minut, utrzymując temperaturę poniżej pięciu stopni Celsjusza. Natychmiast dodaj 0,35 mililitra azydu trimetyloSL kroplami w tych samych warunkach zimna. Może pojawić się łagodne musowanie, co wskazuje na postęp nitrozacji.Następnie owinij kąpiel w lodzie w folię aluminiową, aby chronić reakcję przed światłem. Kontynuuj mieszankę reakcji w kąpieli wodnej w lodzie przez noc. Następnego dnia wypierz i wysusz produkt tak, jak pokazano.Następnie zastosowaj spektroskopię FTIR, aby zweryfikować przemianę chemiczną. Przenieś pięć miligramów hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66 do dwumililitrowej rurki wirówki. Dodaj 0,5 mililitra bufora HEPES i sonikuj przez dwie do pięciu minut.Dodaj 0,5 mililitra buforu HEPES zawierającego 20 miligramów na mililitr hemoglobiny i delikatnie odwróć rurkę kilkakrotnie, aby całkowicie rozproszyć nanocząsteczki. Następnie umieść rurkę na termowstrząsie i inkubuj w temperaturze pokojowej, potrząsając z prędkością 1 000 obr./min przez dwie godziny. Po inkubacji wiruj rurkę w stężeniu 13 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić nanocząstki azydu UIO 66 obciążone hierarchicznie porowatymi hemoglobiną.Następnie ostrożnie pobiera supernatant do ilościowego określenia nieuwięzionej hemoglobiny. Delikatnie umyj granulat trzy razy jednym mililitrem ultraczystej wody, pipetując w górę i w dół, aby usunąć luźno wchłoniętą hemoglobinę. Następnie ostrożnie zbierają supernatant każdego płukania w celu ilościowego określenia uwięzionej hemoglobiny.Ostatni granulek ponownie zawiesz w 0,5 mililitra wody ultraczystej i przechowuj w lodówce przed charakterystyką. Użyj testu hemoglobiny laurowo-sodowej do określenia uwięzionej hemoglobiny w zebranych supernatantach. Pipeta 10 mikrolitrów każdego supernatantu do mikropłytki o 96 dołkach.Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika laurowo-sodowego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Za pomocą ultrafioletowego spektrofotometru widzialnego zmierz absorpcję na 412 nanometrów. Następnie przygotuj seryjne rozcieńczanie zapasów hemoglobiny w buforze HEPES, aby wygenerować standardową krzywą.Przenieś przygotowane rozcieńczenia na przygotowaną płytę 96 dołków, aby wygenerować standardową krzywą do przeliczania odczytów absorpcji na stężenia hemoglobiny. Przenieś 10 miligramów hemoglobiny załadowanej hierarchicznie porowatych, UIO 66 nanocząsteczek azydu do dwumililitrowej rurki wirówkowej zawierającej 0,5 mililitra ultraczystej wody i sonikatu na dwie do pięciu minut. Dodaj 20 miligramów dibenzocykloktanu, zmodyfikowanego glikolem polietylenowym, aby uzyskać równomolowy stosunek glikolu polietylenowego do nanocząstek.Delikatnie przewieraj rurkę, aż mieszanina się ujednoli. Umieść rurkę na termowstrząsie i inkubuj w temperaturze pokojowej, potrząsając z prędkością 1 000 obr./min przez godzinę. Następnie przelej probówkę do lodówki utrzymywanej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nocną reakcję.Wiruj probówkę w 12 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić nanocząstki UIO 66 zmodyfikowane, obciążone hemoglobiną, obciążone hemoglobiną i hierarchicznie porowate. Następnie odrzucam supernatant zawierający niereaktywny glikol polietylenowy. Opłucz granulat trzy razy dwumililitrową ultraczystą wodą, pipetując w górę i w dół oraz wirując w tych samych warunkach, co wcześniej pokazane.Ponownie zawiesz oczyszczoną pegilowaną hemoglobinę, hierarchicznie porowatą nanocząstki UIO 66 polietylenglikolu w dwóch mililitrach ultraczystej wody. Przechowywać zawieszenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powstały koloid wydaje się jednorodny i lekko opalescentyczny, co wskazuje na dobrą stabilność dyspersyjną.Następnie potwierdź skuteczną pegylację za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, czyli DLS. Powierzchniowe grupy aminowe zostały pomyślnie przekształcone w azidy. Zostało to potwierdzone przez pojawienie się charakterystycznego asymetrycznego azydu, rozciągającego się pasma na 2 122 odwrotne centymetry w spektrum FTIR hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66.Ten pas był nieobecny w hierarchicznie porowatych nanocząsteczkach aminowych UIO 66. Enkapsulacja hemoglobiny była wizualnie widoczna przez wyraźną zmianę koloru z żółtego na czerwony. Pochłanianie azotu zmniejszyło się po załadunku hemoglobiną, co wskazuje na zajęcie mezoporów przez cząsteczki hemoglobiny.Potencjał zeta hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66 zmniejszył się z 42,9 milivoltów do 20,4 milivoltów po enkapsulacji hemoglobiny. Udana koniugacja glikolu polietylenowego została potwierdzona przez zniknięcie azidów rozciągających drgania na 2 122 odwrotne centymetry oraz pojawienie się sygnałów związanych z glikolem polietylenowym w widmie FTIR. Analiza DLS wykazała wzrost średnicy hydrodynamicznej z około 114,9 do 140,8 nanometrów po pegylacji, przy zachowaniu niskiego PDI.Ta cząstka umożliwia syntezę hierarchicznie porowatych nanocząstek morfu, enkapsulację hemoglobiny, pekulację powierzchniową oraz ocenę funkcjonalności uwalniania tlenu. Dzięki temu protokołowi można przeprowadzić dodatkowe fizyczne charakterystyki chemicznej i badania funkcjonalne, w tym analizę in vitro uwalniania tlenu oraz biokompatybilności nanocząstek. Przyszłe badania mogą skupić się na zachowaniu funkcjonalności hemoglobiny z powodów dłuższych, takich jak włączanie składników zapobiegających poważnym degradacjom.

synthesis-hemoglobin-encapsulation-biorthogonal-pegylation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy zasady pomiarów poziomu tlenu metodą wygaszania fosforescencji oraz omawiamy konstrukcję dendrytycznych nanoczujników opartych na porfirynach do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Ta procedura opisuje, jak kapsułkować cytochrom c (cyt. c) w zol-żelach krzemionkowych (SiO2) przetworzyć te żele na bioaerożele i użyć tych bioaerożeli do szybkiego rozpoznania tlenku azotu (NO) w reakcji w fazie gazowej. Ten rodzaj protokołu może pomóc w przyszłym rozwoju biosensorów lub innych urządzeń bioanalitycznych.

Kapsułkowanie cytochromu c w nanoarchitekturach aerożelu krzemionkowego bez nanocząstek metalu przy jednoczesnym zachowaniu bioaktywności w fazie gazowej

Struktury metaloorganiczne są skuteczne w magazynowaniu gazu i katalizie heterogenicznej, ale typowe metody syntezy skutkują powstawaniem sypkich proszków, które są trudne do włączenia do inteligentnych materiałów. Przedstawiono metodę polegającą na pierwszym powlekaniu tkanin tlenkami metali ALD, w wyniku czego powstają konforemne warstwy MOF na tkaninach podczas syntezy solwotermicznej.

Synteza solwotermiczna MIL-96 i UiO-66-NH2 na warstwach atomowych osadzonych powłok z tlenku metalu na matach włóknistych

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i wytwarzania nanostrukturalnych porowatych folii krzemowych (PSi) jako degradowalnych nośników dla czynnika wzrostu nerwów (NGF). Różnicowanie neuronalne i wzrost komórek PC12 i neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) myszy są charakteryzowane po leczeniu nośnikami PSi załadowanymi NGF.

Projektowanie porowatych filmów krzemowych jako nośników czynnika wzrostu nerwów

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Obecny protokół opisuje wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) na bazie poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) za pomocą opartej na pojedynczej emulsji technologii mikroprzepływowej. Mikrosfery te mają potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej i badaniach przesiewowych leków.

Wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) za pomocą technologii mikroprzepływowej

Nanoporowate złoto o hierarchicznym i bimodalnym rozkładzie wielkości porów może być wytwarzane przez połączenie procesów elektrochemicznych i chemicznych. Skład stopu może być monitorowany za pomocą badania EDS-SEM w miarę postępu procesu sortowania. Nośność materiału można określić, badając adsorpcję białek na materiale.

Wszechstronna technika tworzenia hierarchicznego projektu z nanoporowatego złota

Postsyntetyczna wymiana ligandów (PSE) jest wszechstronnym i potężnym narzędziem do instalowania grup funkcyjnych w strukturach metaloorganicznych (MOF). Wystawienie MOF na działanie roztworów zawierających ligandy funkcjonalizowane triazolami i tetrazolami może włączyć te heterocykliczne ugrupowania do Zr-MOF poprzez procesy PSE.

Synteza struktur metaloorganicznych na bazie triazolu i tetrazolu na bazie Zr poprzez postsyntetyczną wymianę ligandów

W tym artykule prezentujemy przygotowanie hydrożeli MOF-żelatynowych, które korzystają z termoorzewalnych właściwości żelatyny, związanych z jej separacją fazową przez koaceratację. Te kompozyty hydrożelowe wykazują wysokie obciążenie MOF, dużą porowatość i dobrą przestrzenną dystrybucję cząstek MOF w macierzy żelatynowej.

Przygotowanie żeli metalo-organicznych struktur hydrogeli z żelatyną poprzez koacerwację

Poznaj protokół syntezy hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 do enkapsulacji hemoglobiny z biortogonalną PEGylacją. Metoda zapewnia skalowalną produkcję nośników tlenu o wysokiej stabilności koloidalnej.

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu (Wideo) | JoVE Journal

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Przeglądaj więcej filmów