Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu
8 maja 2026
Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.
Celem tych badań jest określenie stabilnych ram metalowo-organicznych, opartych na MOF nanocząstek do enkapsulacji hemoglobiny i dostarczania tlenu. Hierarchiczny porowaty morf może przezwyciężyć ograniczenie rozmiarowe dla enkapsulacji hemoglobiny, a populacja powierzchniowa może poprawić stabilność cząstek w środowiskach fizjologicznych. Na początek dokładnie zważ 50 miligramów przygotowanych hierarchicznie porowatych nanocząsteczek UIO 66, aminowych w kolbę o pojemności 25 mililitrów z okrągłym dnem.
Dodaj do kolby 10 mililitrów tetrahydrofuranu. Następnie ultrasonikuj mieszaninę przez pięć minut, aby w pełni rozproszyć cząstki, tworząc jednolitą, nieprzezroczystą zawiesinę. Umieść kolbę z okrągłym dnem w kąpieli w lodowatej wodzie na magnetycznej mieszadłce ustawionej na 400 obr./min.
Używając szklanej strzykawki, dodaj 0,4 mililitra azotynu tert-butylo-azotynu kroplami przez pięć minut, utrzymując temperaturę poniżej pięciu stopni Celsjusza. Natychmiast dodaj 0,35 mililitra azydu trimetyloSL kroplami w tych samych warunkach zimna. Może pojawić się łagodne musowanie, co wskazuje na postęp nitrozacji.
Następnie owinij kąpiel w lodzie w folię aluminiową, aby chronić reakcję przed światłem. Kontynuuj mieszankę reakcji w kąpieli wodnej w lodzie przez noc. Następnego dnia wypierz i wysusz produkt tak, jak pokazano.
Następnie zastosowaj spektroskopię FTIR, aby zweryfikować przemianę chemiczną. Przenieś pięć miligramów hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66 do dwumililitrowej rurki wirówki. Dodaj 0,5 mililitra bufora HEPES i sonikuj przez dwie do pięciu minut.
Dodaj 0,5 mililitra buforu HEPES zawierającego 20 miligramów na mililitr hemoglobiny i delikatnie odwróć rurkę kilkakrotnie, aby całkowicie rozproszyć nanocząsteczki. Następnie umieść rurkę na termowstrząsie i inkubuj w temperaturze pokojowej, potrząsając z prędkością 1 000 obr./min przez dwie godziny. Po inkubacji wiruj rurkę w stężeniu 13 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić nanocząstki azydu UIO 66 obciążone hierarchicznie porowatymi hemoglobiną.
Następnie ostrożnie pobiera supernatant do ilościowego określenia nieuwięzionej hemoglobiny. Delikatnie umyj granulat trzy razy jednym mililitrem ultraczystej wody, pipetując w górę i w dół, aby usunąć luźno wchłoniętą hemoglobinę. Następnie ostrożnie zbierają supernatant każdego płukania w celu ilościowego określenia uwięzionej hemoglobiny.
Ostatni granulek ponownie zawiesz w 0,5 mililitra wody ultraczystej i przechowuj w lodówce przed charakterystyką. Użyj testu hemoglobiny laurowo-sodowej do określenia uwięzionej hemoglobiny w zebranych supernatantach. Pipeta 10 mikrolitrów każdego supernatantu do mikropłytki o 96 dołkach.
Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika laurowo-sodowego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Za pomocą ultrafioletowego spektrofotometru widzialnego zmierz absorpcję na 412 nanometrów. Następnie przygotuj seryjne rozcieńczanie zapasów hemoglobiny w buforze HEPES, aby wygenerować standardową krzywą.
Przenieś przygotowane rozcieńczenia na przygotowaną płytę 96 dołków, aby wygenerować standardową krzywą do przeliczania odczytów absorpcji na stężenia hemoglobiny. Przenieś 10 miligramów hemoglobiny załadowanej hierarchicznie porowatych, UIO 66 nanocząsteczek azydu do dwumililitrowej rurki wirówkowej zawierającej 0,5 mililitra ultraczystej wody i sonikatu na dwie do pięciu minut. Dodaj 20 miligramów dibenzocykloktanu, zmodyfikowanego glikolem polietylenowym, aby uzyskać równomolowy stosunek glikolu polietylenowego do nanocząstek.
Delikatnie przewieraj rurkę, aż mieszanina się ujednoli. Umieść rurkę na termowstrząsie i inkubuj w temperaturze pokojowej, potrząsając z prędkością 1 000 obr./min przez godzinę. Następnie przelej probówkę do lodówki utrzymywanej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nocną reakcję.
Wiruj probówkę w 12 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić nanocząstki UIO 66 zmodyfikowane, obciążone hemoglobiną, obciążone hemoglobiną i hierarchicznie porowate. Następnie odrzucam supernatant zawierający niereaktywny glikol polietylenowy. Opłucz granulat trzy razy dwumililitrową ultraczystą wodą, pipetując w górę i w dół oraz wirując w tych samych warunkach, co wcześniej pokazane.
Ponownie zawiesz oczyszczoną pegilowaną hemoglobinę, hierarchicznie porowatą nanocząstki UIO 66 polietylenglikolu w dwóch mililitrach ultraczystej wody. Przechowywać zawieszenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powstały koloid wydaje się jednorodny i lekko opalescentyczny, co wskazuje na dobrą stabilność dyspersyjną.
Następnie potwierdź skuteczną pegylację za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, czyli DLS. Powierzchniowe grupy aminowe zostały pomyślnie przekształcone w azidy. Zostało to potwierdzone przez pojawienie się charakterystycznego asymetrycznego azydu, rozciągającego się pasma na 2 122 odwrotne centymetry w spektrum FTIR hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66.
Ten pas był nieobecny w hierarchicznie porowatych nanocząsteczkach aminowych UIO 66. Enkapsulacja hemoglobiny była wizualnie widoczna przez wyraźną zmianę koloru z żółtego na czerwony. Pochłanianie azotu zmniejszyło się po załadunku hemoglobiną, co wskazuje na zajęcie mezoporów przez cząsteczki hemoglobiny.
Potencjał zeta hierarchicznie porowatych nanocząstek azydu UIO 66 zmniejszył się z 42,9 milivoltów do 20,4 milivoltów po enkapsulacji hemoglobiny. Udana koniugacja glikolu polietylenowego została potwierdzona przez zniknięcie azidów rozciągających drgania na 2 122 odwrotne centymetry oraz pojawienie się sygnałów związanych z glikolem polietylenowym w widmie FTIR. Analiza DLS wykazała wzrost średnicy hydrodynamicznej z około 114,9 do 140,8 nanometrów po pegylacji, przy zachowaniu niskiego PDI.
Ta cząstka umożliwia syntezę hierarchicznie porowatych nanocząstek morfu, enkapsulację hemoglobiny, pekulację powierzchniową oraz ocenę funkcjonalności uwalniania tlenu. Dzięki temu protokołowi można przeprowadzić dodatkowe fizyczne charakterystyki chemicznej i badania funkcjonalne, w tym analizę in vitro uwalniania tlenu oraz biokompatybilności nanocząstek. Przyszłe badania mogą skupić się na zachowaniu funkcjonalności hemoglobiny z powodów dłuższych, takich jak włączanie składników zapobiegających poważnym degradacjom.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article presents a detailed, scalable protocol for fabricating hierarchically porous UiO-66 nanoparticles (HP-UiO-66 NPs) designed to encapsulate hemoglobin (Hb) for use as hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs). The protocol emphasizes reproducibility, scalability, and stability, utilizing bioorthogonal polyethylene glycol (PEG) shells to enhance nanoparticle performance and biocompatibility. The workflow is modular and adaptable for encapsulating other biomacromolecules or enzymes for therapeutic delivery.
Key Study Components
Area of Science
- Nanomaterials
- Biomaterials
- Oxygen delivery systems
- Biomedical engineering
Background
- Hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) are developed to address hypoxia in biomedical applications.
- Free hemoglobin is unstable and vasoactive outside red blood cells, limiting its direct use.
- Metal-organic frameworks (MOFs), such as UiO-66, offer tunable porosity and stability for encapsulation.
- PEGylation is commonly used to improve nanoparticle stability and biocompatibility.
Purpose of Study
- To provide a reproducible, step-by-step protocol for fabricating HP-UiO-66 NPs encapsulating Hb.
- To enhance the stability and oxygen-carrying capacity of encapsulated Hb using PEG shells.
- To detail troubleshooting strategies and critical parameters for inter-laboratory reproducibility.
Methods Used
- Defect engineering of UiO-66-NH2 nanoparticles via dodecanoic acid modulation and acid washing.
- Surface amine conversion to azides for subsequent bioorthogonal chemistry.
- Encapsulation of hemoglobin in buffered aqueous media.
- PEGylation using catalyst-free strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC).
- Comprehensive physicochemical characterization (crystallinity, porosity, surface chemistry, PEG corona).
- Functional assays for oxygenation/deoxygenation of encapsulated Hb.
Main Results
- Gram-scale production of HP-UiO-66-NH2 NPs per batch is achievable.
- Encapsulation efficiencies of ~35% (loading content ~24 wt%) for Hb under mild conditions.
- PEGylated NPs exhibit a hydrodynamic diameter of ~140 nm and low polydispersity.
- Physicochemical analyses confirm framework integrity, mesoporosity, and successful PEGylation.
- Encapsulated Hb retains reversible oxygenation/deoxygenation capacity.
- PEGylation significantly improves colloidal and structural stability in various biological media.
Conclusions
- The protocol enables robust, scalable fabrication of MOF-based HBOCs with high encapsulation efficiency and stability.
- PEGylation is critical for maintaining nanoparticle integrity and function in physiological environments.
- The workflow is modular and adaptable for other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Hierarchically porous UiO-66 nanoparticles encapsulating hemoglobin and stabilized by bioorthogonal PEGylation address critical challenges in oxygen delivery system development. This modular, scalable protocol enhances predictive confidence in nanoparticle-based therapeutic carriers by ensuring reproducibility, stability, and functional oxygen transport. The approach supports robust pipeline integration for advanced biomacromolecule delivery platforms in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic evaluation of nanoparticle encapsulation and stabilization strategies for therapeutic protein delivery.
- Supports mechanistic de-risking by verifying hemoglobin functionality post-encapsulation and PEGylation.
- Facilitates target validation for oxygen carrier systems through quantitative oxygenation/deoxygenation assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible nanoparticle preparations for downstream screening of oxygen delivery efficacy.
- Delivers quantitative encapsulation efficiency and physicochemical characterization outputs for assay benchmarking.
- Enables scalable production of uniform nanoparticles, supporting high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Demonstrates stability and functional retention of encapsulated hemoglobin in physiologically relevant media.
- Aligns with translational biomarker requirements by confirming reversible oxygen transport in vitro.
- Supports risk-adjusted advancement of nanoparticle-based HBOCs toward preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions HP-UiO-66-PEG nanoparticles as a bridge from early discovery through preclinical model development for oxygen carrier therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing for protein encapsulation and stabilization in MOF-based carriers.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for nanoparticle characterization and functional assays.
- Analytics: Supplies encapsulation efficiency, hydrodynamic size, and oxygenation data for comparative analysis.
- Translational Research: Demonstrates nanoparticle stability and function in serum and physiological buffers.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanoparticle-based oxygen carriers and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle synthesis and PEGylation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for therapeutic carrier platforms and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of advanced delivery systems for hypoxia mitigation and beyond.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, surface chemistry, and protein encapsulation.
- Needs access to analytical instrumentation for physicochemical and functional characterization.
- Demands cross-team standardization of critical parameters and troubleshooting protocols.
- Adaptable to various biomacromolecules with consideration for protein stability and compatibility.
- Scale-up and reproducibility depend on precise control of defect engineering and PEGylation steps.
